用于解淀粉乳杆菌l6高密度培养的培养基及其培育方法

用于解淀粉乳杆菌l6高密度培养的培养基及其培育方法
【专利摘要】本发明公开了用于解淀粉乳杆菌L6高密度培养的培养基及其培育方法。用于解淀粉乳杆菌L6的高密度培养的培养基的基础培养基由豆腐黄浆水经离心去除不溶物形成；以质量份数计，所述营养成分由4-12份蛋白胨、5-20份酵母提取物和7.5-40份玉米淀粉组成；培养基的高密度培养解淀粉乳杆菌L6的方法：将冷藏保存的解淀粉乳杆菌接入MRS液体培养基，得到种子液；将种子液接种于在培养基中，在温度32-47°C下进行发酵6-24小时；终止发酵。通过本发明的培养方法可以得到4.5X109cfu/mL以上活菌数的解淀粉乳杆菌的高密度培养物，为进一步利用该菌株制备直投式解淀粉乳杆菌发酵剂奠定了基础。
【专利说明】用于解淀粉乳杆菌L6局密度培养的培养基及其培育方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物的培养，特别涉及解淀粉乳杆菌L6的高密度培养的培养基及 培养技术。属于微生物培养【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 黄浆水为豆腐制作过程中产生的黄色浙水，含有大量水溶性的糖类如水苏糖、棉 籽糖等低聚糖，以及异黄酮、蛋白质和维生素等营养物质，非常适合微生物的生长。直接排 放不仅会造成资源的浪费，而且会严重污染环境与土壤，因此实现对黄浆水的综合利用引 起了国内外科学工作者的关注。
[0003] 近年来研究发现，豆制品加工过程中产生的黄浆水，在存贮的过程中经自然发酵 所生成的酸浆水，是一种良好的豆腐凝固剂，已在部分豆制品生产厂家使用，以酸浆水制成 的豆腐色泽微黄、口感鲜嫩，无化学点浆剂的苦涩味，属纯天然食品。但目前使用的酸浆水 均为自然发酵，所涉及到的微生物除产酸的乳酸菌外，还含有部分其它的细菌和酵母等，其 中也有可能污染蜡样芽孢杆菌、葡萄球菌等杂菌，对豆腐及其制品的食用安全性构成危害。
[0004] 本实验室从自然发酵的豆腐酸浆中分离得到一株乳酸菌Lactobacillus amylolyticus L6,取得了以下良好结果：
[0005] (1)将Lactobacillus amylolyticus L6种子液接入到灭菌的黄楽水中，进行纯种 发酵，获得了一种新型的豆腐点浆剂，解决了自然发酵酸浆水中微生物生长杂乱的问题，提 高了酸浆豆腐的质量安全性。
[0006] (2)该菌株可以直接利用黄浆水中的低聚糖和淀粉等生长产酸，无需补充其它碳 源和营养素即可达到点浆剂所需酸度，降低了生产成本。
[0007] 高密度培养技术，也就是高密度发酵技术。一般来说，高密度培养是指应用一定的 培养技术或装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较传统培养方式有显著的提高，从而达 到减少培养体积，缩短生产周期，最终提高特定产物的比生产速率，减少设备投资从而降低 生产成本，提高在市场上的竞争力。
[0008] 随着发酵剂的商业化生产和应用的迅速增加，工业发酵的基本目标自然转向了以 最小的代价获得最大的产值和利润。而实现这一目标的工程手段是建立相应的高效发酵模 式。
[0009] 解淀粉乳杆菌Lactobacillus amylolyticus L6通过使用MRS液体培养基制备种 子发酵液时活菌数不高，另外市售MRS培养基价格较高限制了其在工业生产中的应用。


【发明内容】

[0010] 本发明的目的在于提供一种原料廉价，解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)的高密度培养基制备的浓缩型发酵剂含有的活菌数高达4. 5X IO9Cfu/ ml的用于解淀粉乳杆菌L6高密度培养的培养基及其培育方法。
[0011] 本发明中解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)为本发明人从自 然发酵的豆腐酸浆水中提取并分离鉴定的菌种。菌种（株）L6保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究 所，其菌种保藏编号为=CGMCCN0. 9090,保藏日期为2014年4月25日，菌种的分类命名为 解淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylolyticus)，保藏证明参见在 申请人:申请的申请号为 201410277246. 3的发明专利申请。
[0012] 本发明使用豆腐黄楽水作为解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)的基础培养基，并对其培养条件进行了研究，旨在提高培养物中解淀粉乳杆菌 L6(Lactobacillus amylolyticus L6)的活菌密度，制备廉价的乳酸菌浓缩发酵剂，为 进一步利用其制备直投式发酵剂奠定基础。在利用解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)发酵黄浆水，进行工业化生产制备豆腐凝固剂时，乳酸菌浓缩发酵剂的 制备就显得尤为重要。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的 培养以及价格低廉。
[0013] 本发明目的通过如下技术方案实现：
[0014] -种用于解淀粉乳杆菌L6的高密度培养的培养基，由基础培养基和营养成分组 成，所述基础培养基由豆腐黄浆水经离心去除不溶物形成；以质量份数计，所述营养成分 由4-12份蛋白胨、5-20份酵母提取物和7. 5-40份玉米淀粉组成；每1升基础培养基加入 4_12g蛋白胨，5-20g酵母提取物和7. 5-40g玉米淀粉。
[0015] 优选地，所述营养成分加入基础培养基后还包括灭菌，所述灭菌的温度为 120°C -122°C，所述灭菌的时间为15min-20min。
[0016] 所述每1升基础培养基加入8. 2g蛋白胨、10. 7g酵母提取粉和22g玉米淀粉。
[0017] 应用所述培养基的高密度培养解淀粉乳杆菌L6的方法，包括如下步骤：
[0018] A)菌种发酵液的制备：将冷藏保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接入装有已经灭菌的MRS液体培养基的容器内，在32°C-47°C下静置培 养10h-24h，得到种子液；
[0019] B)发酵：将所述种子液接种于在培养基中，在温度32-47°C下进行发酵6-24小时； 所述种子液的加入量为培养基体积的2% -6% ;
[0020] C)终止发酵：达到所述发酵时间后置于-4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳 杆菌L6的高密度发酵液。
[0021] 所述高密度发酵液中解淀粉乳杆菌L6的菌数达到4. 5X 109Cfu/mL以上。
[0022] 所述MRS液体培养基的制备为：将牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖 20g，吐温-80 lmL，K2HPO4 · 3H202g，NaAc · 3H205g，柠檬酸三铵 2g，MgSO4 · 7Η200· 58g 和 MnSO4 · H2OO. 25g 加入蒸馏水到 1L，调 pH 到 6· 4±0· 2。
[0023] 所述发酵的温度优选为42°C，发酵的时间优选为12h。
[0024] 由以上方法制备得到的解淀粉乳杆菌L6的高密度发酵液可作为豆腐黄浆水制备 豆腐凝固剂时的发酵剂，尤其可用于直投式解淀粉乳杆菌发酵剂的制备。
[0025] 相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
[0026] (1)解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)的高密度培养基制备的 浓缩型发酵剂含有的活菌数高达4. 5 X 109cfu/ml。优于商业化MRS液体培养基培养效果。
[0027] (2)本发明涉及的高密度培养基，使用豆腐黄浆水作为基础培养基，廉价的原料降 低了生产成本，具有推广价值。
[0028] (3)本发明涉及的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)的高密度 培养方法，条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该理解为，这些实施例仅用于例证 的目的，并不限制本发明的保护范围。
[0030] 本发明具体实施例中所涉及的材料：玉米淀粉购买自明誉（香港）食品有限公司； 蛋白胨购买自北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母提取粉购买自广东环凯微生物科技 有限公司。
[0031] 实施例中所涉及的菌种：解淀粉乳杆菌L6为本发明人从自然发酵豆腐酸浆水中 提取并分离鉴定的菌种，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种 保藏编号为CGMCC No. 9090。
[0032] 实施例1
[0033] 解淀粉乳杆菌L6的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0034] (1)菌种发酵液的制备：
[0035] 将冷冻保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接种于灭菌的 MRS液体培养基中，在温度42°C下培养18h，连续转接三次，即得菌种发酵液。
[0036] (2)发酵培养基的配制：
[0037] a.基础培养基的制备：取豆腐黄浆水，经离心去除不溶物，作为基础培养基；
[0038] b.分别称取下述原料：10g蛋白胨，5g酵母提取粉，7. 5g玉米淀粉。
[0039] c.将上述原料溶于IL步骤a获得的基础培养基中，搅拌均匀，pH值自然，装于锥 形瓶中，在温度121°C下灭菌15min。即得到发酵培养基。
[0040] (3)发酵：
[0041] 将步骤（1)得到的解淀粉乳杆菌L6菌种发酵液按照发酵培养基体积的5%接种于 在步骤（2)得到的发酵培养基中，在温度42°C下，进行静置培养24h。
[0042] (4)终止发酵：
[0043] 达到所述发酵时间后，将锥形瓶置于4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6活菌数达到I. 09X 109cfu/mL以上的解淀粉乳杆菌L6高密度发酵液。
[0044] 实施例2
[0045] 解淀粉乳杆菌L6的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0046] (1)菌种发酵液的制备：
[0047] 将冷冻保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接种于灭菌的 MRS液体培养基中，在温度42°C下培养18h，连续转接三次，即得菌种发酵液。
[0048] (2)发酵培养基的配制：
[0049] a.基础培养基的制备：取豆腐黄浆水，经离心去除不溶物，作为基础培养基；
[0050] b.分别称取下述原料：10g蛋白胨，15g酵母提取粉，27. 5g玉米淀粉；
[0051] C.将上述原料溶于IL步骤a获得的基础培养基中，搅拌均匀，pH值自然，装于锥 形瓶中，在温度121°C下灭菌15min。即得到发酵培养基。
[0052] (3)发酵：
[0053] 将步骤⑴得到的解淀粉乳杆菌L6菌种发酵液按照发酵培养基体积的5%接种于 在步骤（2)得到的发酵培养基中，在温度42°C下，进行静置培养24h。
[0054] (4)终止发酵：
[0055] 达到所述发酵时间后，将锥形瓶置于4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6活菌数达到I. 93X 109cfu/mL以上的解淀粉乳杆菌L6高密度发酵液。
[0056] 实施例3
[0057] 解淀粉乳杆菌L6的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0058] (1)菌种发酵液的制备：
[0059] 将冷冻保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接种于灭菌的 MRS液体培养基中，在温度42°C下培养18h，连续转接三次，即得菌种发酵液。
[0060] (2)发酵培养基的配制：
[0061] a.基础培养基的制备：取豆腐黄浆水，经离心去除不溶物，作为基础培养基；
[0062] b.分别称取下述原料：8. 2g蛋白胨，10. 7g酵母提取粉，22g玉米淀粉；
[0063] c.将上述原料溶于IL步骤a获得的基础培养基中，搅拌均匀，pH值自然，装于锥 形瓶中，在温度121°C下灭菌15min。即得到发酵培养基。
[0064] (3)发酵：
[0065] 将步骤⑴得到的解淀粉乳杆菌L6菌种发酵液按照发酵培养基体积的5%接种于 在步骤（2)得到的发酵培养基中，在温度42°C下，进行静置培养12h。
[0066] (4)终止发酵：
[0067] 达到所述发酵时间后，将锥形瓶置于4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6活菌数达到4. 5X 109cfu/mL以上的解淀粉乳杆菌L6高密度发酵液。
[0068] 实施例4
[0069] 解淀粉乳杆菌L6的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0070] (1)菌种发酵液的制备：
[0071] 将冷冻保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接种于灭菌的 MRS液体培养基中，在温度42°C下培养18h，连续转接三次，即得菌种发酵液。
[0072] (2)发酵培养基的配制：
[0073] a.基础培养基的制备：取豆腐黄浆水，经离心去除不溶物，作为基础培养基；
[0074] b.分别称取下述原料：8. 2g蛋白胨，10. 7g酵母提取粉，22g玉米淀粉；
[0075] c.将上述原料溶于IL步骤a获得的基础培养基中，搅拌均勻，pH值自然，装于锥 形瓶中，在温度121°C下灭菌15min。即得到发酵培养基。
[0076] (3)发酵：
[0077] 将步骤（1)得到的解淀粉乳杆菌L6菌种发酵液按照发酵培养基体积的5%接种于 在步骤（2)得到的发酵培养基中，在温度47°C下，进行静置培养6h。
[0078] (4)终止发酵：
[0079] 达到所述发酵时间后，将锥形瓶置于4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6活菌数达到I. 205X 109cfu/mL以上的解淀粉乳杆菌L6高密度发酵液。
[0080] 实施例5
[0081] 解淀粉乳杆菌L6的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0082] (1)菌种发酵液的制备：
[0083] 将冷冻保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接种于灭菌的 MRS液体培养基中，在温度42°C下培养18h，连续转接三次，即得菌种发酵液。
[0084] (2)发酵培养基的配制：
[0085] a.基础培养基的制备：取豆腐黄浆水，经离心去除不溶物，作为基础培养基；
[0086] b.分别称取下述原料：8. 2g蛋白胨，10. 7g酵母提取粉，22g玉米淀粉；
[0087] c.将上述原料溶于IL步骤a获得的基础培养基中，搅拌均匀，pH值自然，装于锥 形瓶中，在温度121°C下灭菌15min。即得到发酵培养基。
[0088] (3)发酵：
[0089] 将步骤⑴得到的解淀粉乳杆菌L6菌种发酵液按照发酵培养基体积的5%接种于 在步骤（2)得到的发酵培养基中，在温度37°C下，进行静置培养12h。
[0090] (4)终止发酵：
[0091] 达到所述发酵时间后，将锥形瓶置于4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6活菌数达到2. 89X 109cfu/mL以上的解淀粉乳杆菌L6高密度发酵液。
[0092] 实施例6
[0093] 解淀粉乳杆菌L6的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0094] (1)菌种发酵液的制备：
[0095] 将冷冻保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接种于灭菌的 MRS液体培养基中，在温度42°C下培养18h，连续转接三次，即得菌种发酵液。
[0096] (2)发酵培养基的配制：
[0097] a.基础培养基的制备：取豆腐黄浆水，经离心去除不溶物，作为基础培养基；
[0098] b.分别称取下述原料：8. 2g蛋白胨，10. 7g酵母提取粉，22g玉米淀粉；
[0099] c.将上述原料溶于IL步骤a获得的基础培养基中，搅拌均匀，pH值自然，装于锥 形瓶中，在温度121°C下灭菌15min。即得到发酵培养基。
[0100] ⑶发酵：
[0101] 将步骤⑴得到的解淀粉乳杆菌L6菌种发酵液按照发酵培养基体积的5%接种于 在步骤（2)得到的发酵培养基中，在温度32°C下，进行静置培养18h。
[0102] (4)终止发酵：
[0103] 达到所述发酵时间后，将锥形瓶置于4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6活菌数达到2. 04X 109cfu/mL以上的解淀粉乳杆菌L6高密度发酵液。
[0104] 实施例7 (对比实施例1)
[0105] 为了实现本发明的解淀粉乳杆菌L6高密度培养的培养基的特点，以本实施例作 为对比。
[0106] (1)菌种发酵液的制备：
[0107] 将冷冻保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接种于灭菌的 MRS液体培养基中，在温度42°C下培养18h，连续转接三次，即得菌种发酵液。
[0108] (2)发酵培养基的配制：
[0109] 取豆腐黄浆水，经离心去除不溶物，pH值自然，装于锥形瓶中，在温度121°C下灭 菌15min。即得到发酵培养基。
[0110] ⑶发酵：
[0111] 将步骤⑴得到的解淀粉乳杆菌L6菌种发酵液按照发酵培养基体积的5%接种于 在步骤（2)得到的发酵培养基中，在温度42°C下，进行静置培养24h。
[0112] (4)终止发酵：
[0113] 达到所述发酵时间后，将锥形瓶置于4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6活菌数达到8X 106cfu/mL的解淀粉乳杆菌L6高密度发酵液。
[0114] 对比实施例1显示，通过本发明提供的高密度培养的培养基获得的解淀粉乳杆菌 L6的活菌菌数要显著高于单独使用黄浆水作为高密度培养的培养基所获得的活菌数量。
[0115] 实施例8 (对比实施例2)
[0116] 为显示本发明的解淀粉乳杆菌L6的高密度培养的培养基的特点，以本实施例作 为对比：
[0117] (1)菌种发酵液的制备：
[0118] 将冷冻保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接种于灭菌 的，在温度42°C下培养18h，连续转接三次，即得菌种发酵液。
[0119] ⑵发酵培养基的配制：
[0120] MRS液体培养基在温度121°C下灭菌15min。即得到发酵培养基。
[0121] (3)发酵：
[0122] 以上述发酵培养基体积计，将步骤（1)得到的解淀粉乳杆菌L6菌种发酵液按照发 酵培养基体积的5%接种于在步骤（2)得到的发酵培养基中，在温度42°C下，进行静置培养 24h。
[0123] (4)终止发酵：
[0124] 达到所述发酵时间后，将锥形瓶置于4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6活菌数达到5. 5X 108cfu/mL的解淀粉乳杆菌L6高密度发酵液。
[0125] 对比实施例显示，通过本发明提供的高密度培养的培养基获得的解淀粉乳杆菌L6 的活菌数量要显著高于使用商用MRS培养基作为解淀粉乳杆菌L6的高密度培养的培养基 所获得的活菌数量。
[0126] 本发明利用豆腐工业的副产物豆腐黄浆水作为解淀粉乳杆菌L6的基础培养基， 并利用菌种能够分泌淀粉酶并催化淀粉水解的特点，补充淀粉作为碳源显著促进了菌种的 生长，同时适当添加蛋白胨和酵母抽提物，获得了菌数在IO 9CfVmL以上的增殖培养基和培 养方法，与单独使用豆腐黄浆水作培养基（对比实施例1)相比，菌数高出3个数量级，与商 用培养基MRS(对比实施例2)相比，菌数也高出1个数量级，显示出本发明使用的高密度培 养基具有价格低廉、增殖效果好的特点，适宜于工业化生产应用。
【权利要求】
1. 一种用于解淀粉乳杆菌L6的高密度培养的培养基，由基础培养基和营养成分组成， 其特征在于，所述基础培养基由豆腐黄浆水经离心去除不溶物形成；以质量份数计，所述营 养成分由4-12份蛋白胨、5-20份酵母提取物和7. 5-40份玉米淀粉组成；每1升基础培养 基加入4-12g蛋白胨，5-20g酵母提取物和7. 5-40g玉米淀粉。
2. 根据权利要求1所述的用于解淀粉乳杆菌L6的高密度培养的培养基，其特征在于， 所述营养成分加入基础培养基后还包括灭菌，所述灭菌的温度为120°C _122°C，所述灭菌 的时间为15min_20min。
3. 根据权利要求1所述的用于解淀粉乳杆菌L6的高密度培养的培养基，其特征在于， 所述每1升基础培养基加入8. 2g蛋白胨、10. 7g酵母提取粉和22g玉米淀粉。
4. 应用权利要求1所述培养基的高密度培养解淀粉乳杆菌L6的方法，其特征在于包括 如下步骤： A) 菌种发酵液的制备：将冷藏保存的解淀粉乳杆菌L6 (Lactobacillus amylolyticus L6)接入装有已经灭菌的MRS液体培养基的容器内，在32°C -47°C下静置培养10h-24h，得 到种子液； B) 发酵：将所述种子液接种于在培养基中，在温度32-47°C下进行发酵6-24小时；所 述种子液的加入量为培养基体积的2% -6% ; C) 终止发酵：达到所述发酵时间后置于-4°C冷藏保存，终止发酵，得到解淀粉乳杆菌 L6的高密度发酵液。
5. 根据权利要求4所述的高密度培养解淀粉乳杆菌L6的方法，其特征在于，所述高密 度发酵液中解淀粉乳杆菌L6的菌数达到4. 5X 109Cfu/mL以上。
6. 根据权利要求4所述的高密度培养解淀粉乳杆菌L6的方法，其特征在于，所述MRS 液体培养基的制备为：将牛肉膏l〇g，蛋白胨l〇g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，吐温-80 lmL， K2HP04 · 3H202g，NaAc · 3H205g，柠檬酸三铵 2g，MgS04 · 7H200. 58g 和 MnS04 · H200. 25g 加 入蒸馏水到1L，调pH到4±(λ 2。
7. 根据权利要求4所述的高密度培养解淀粉乳杆菌L6的方法，其特征在于，所述发酵 的温度为42°C，发酵的时间为12h。
【文档编号】C12N1/20GK104212743SQ201410419744
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】李理, 刘力 申请人:华南理工大学