专利名称：一种黑根霉及其催化甾体羟基化反应的微生物转化方法
技术领域：
本发明涉及ー种新的用于微生物转化反应生产霉菌氧化物的黑根霉菌株(Rhizopus nigricans)TS-8522,以及利用该黑根霉将沃氏氧化物转化为霉菌氧化物的微生物转化方法。属发酵工程技术领域。
背景技术：
留体类药物是医药行业中产量仅次于抗生素的第二大类药物。留体激素药物生产中，甾体母核的多个基团需要进行修饰，其中Cll a -羟基化反应是最重要的留体转化反应之一。Cll位的羟基化，对留体母核引入高生理活性基团，増加疗效，減少副作用具有重要意义。20世纪50年代首次采用生物转化法进行Cll位羟基化以来，黑根霉一直作为ー种应用最广的Cll a -羟基化微生物，它通过NADPH递氢，完成留体底物的羟基化反应，直接将沃氏氧化物转化为霉菌氧化物，省去了化学合成的10个エ序。1958年，王鸣龙等确立了黑根霉留体Cll a -羟基化转化工艺，此后，国内普遍采用此エ艺，其具有稳定性高、转化专一等优点，但由于转化率不高，Cll a -羟基化反应一直成为留体类药物生产的限制步骤。技术方案本发明的主要目的是提供ー种能有效将沃氏氧化物Cll a -羟基化转化为霉菌氧化物的新菌株，并提供一整套较为完善的沃氏氧化物生物转化工艺。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:本发明以从自然界筛选得到的黑根霉(Rhizopus nigricans)为出发菌株，经飞秒激光诱变及筛选，获得ー株能有效将沃氏氧化物Cll a -羟基化转化为霉菌氧化物的新菌株(Rhizopus nigricans TS-8522)。转化用菌株的培养与发酵:斜面培养:葡萄糖10g/L，酵母粉15g/L，氯化钠5g/L，K2HPO4 5g/L，琼脂15g/L，沃氏氧化物20g/L。121°C灭菌20分钟。冷却后接种，28°C培养3天。种子培养:配比为小米:水=1: 0.8的小米培养基，经过蒸煮后分装(15g/50ml三角瓶)，加入2 %的沃氏氧化物(驯化培养基沃氏氧化物浓度梯度为0.5 %、I %、1.5 %及2% )，121°C灭菌20分钟，冷却后接种，28°C培养3天。于4°C保存备用。微生物转化反应:发酵培养基组成:葡萄糖15g/L，豆饼粉15g/L，玉米浆25g/L，蚕蛹粉2g/L，硫酸铵
1.5g/L，六水氯化铁1.5g/L(分消)，氢氧化钠溶液调整pH至4.5，加入2%沃氏氧化物，装液量为4L/5L发酵罐，121°C灭菌20min。发酵通气量为4L/min，搅拌转速为400r/min，接种量为2% (小米培养物)，28°C下培养。转化24小时后，补加 150ml葡萄糖溶液(含40g葡萄糖)，进ー步转化反应。产物的提取:发酵液用布氏漏斗过滤，收集滤饼并于70°C下烘干、研磨，采用7.5倍体积的丙酮于80°C下回流提取20 30min，重复提取步骤两次。通过过滤收集得到的提取液，50°C下真空旋转蒸发干燥，得到的淡黄色结晶加稀NaOH皂化，抽滤，水洗至中性，烘干即得粗品。沃氏氧化物及霉菌氧化物的HPLC检测:柱型为C18(Hypersil 0DS2,5um,250X4.6mm)。流动相为:こ腈:水=50: 50，流速为0.7ml/min，紫外检测波长为240nm。本发明的有益效果:本发明采用生物转化法进行沃氏氧化物的Cll a -羟基化，相对于化学合成法具有以下优点:①转化专ー性高，副产物含量极低生产步骤简单，产品得率高；③提取方法费用低，大量节省成本；④反应条件温和，环境友好。采用诱变筛选获得的菌株，与传统的转化工艺相比具有以下优点:①本发明诱变筛选获得的的黑根霉(Rhizopus nigricans TS-8522)具有较强的抵抗沃氏氧化物压カ的能力；②在菌株生长的每一阶段均存在的沃氏氧化物驯化，因此发酵过程不需前期的诱导阶段，大大缩短了发酵周期，提高了产率；③采用小米培养物直接接种，不仅有利于菌株的分散与附着，更能使菌株尽快适应新的生长环境，节约资源；④采用淀粉加葡萄糖(即长效碳源与快速利用碳源)相结合的方式，解除了前期高浓度葡萄糖对菌株的抑制效应，提高了转化效率。
图1是本发明的エ艺流程示意图。具体实施方法下列通过实施例对本发明进行说明。实施例仅限于对本发明作进ー步说明，不代表本发明的保护范围，依据本发明做出的非本质的修改和调整均属于本发明的保护范围。实施例1:黑根霉的飞秒激光诱变及筛选取培养3天的黑根霉斜面，用超纯水洗涤并通过8层纱布过滤，制得IO5个孢子/ml的孢子悬液。取0.2ml孢子悬液于洁净培养皿内，进行照射。飞秒激光辐射条件为:入=800nm,激光束直径=6mm,重复频率=76MHz,照射距离=6cm,福照功率=20mW,福照时间=20s。吸取辐照后的孢子悬液，稀释100倍后涂布于PDA培养皿，于28°C暗室培养至长出单菌落。将单菌落分别挑取接种至新的PDA斜面，28°C培养4天，将孢子洗下制成孢子悬液，接种至发酵培养基，其组成为:葡萄糖20g/L，豆饼粉15g/L，玉米浆25g/L，蚕蛹粉2g/し硫酸铵1.5g/L，氢氧化钠溶液调整pH至4.5，加入2%沃氏氧化物，装液量为30ml/250ml三角瓶。28°C下，180rpm摇床中培养3天，丙酮提取，HPLC法检测沃氏氧化物的转化率。其中，转化率最高的菌株较出发菌株转化率提高了约60%，达到26.2%。将获得的该新菌株命名为黑根霉TS-8522。实施例2:多级驯化及投料方式对突变菌株沃氏氧化物转化率的影响采用本发明获得的诱变菌株黑根霉TS-8522。为解决沃氏氧化物在水中溶解度极低的问题，实验所添加的沃氏氧化物均加入I倍体积的无水こ醇，80°C下加热回流一小时，待冷却后再均匀加入培养基。斜面培养:培养基100ml，含葡萄糖lg，酵母粉1.5g，氯化钠0.5g，K2HPO40.5g，沃氏氧化物2g (对照组不含)，121°C灭菌20分钟。冷却后接种，28°C下培养3天。斜面上长出大量白色的菌丝体，高约3_，其顶端有大量肉眼可见的黑色小点，即为黑根霉的孢子嚢。种子培养:称取IOOg小米，洗浄后，加入少量蒸馏水(小米:水=I: 0.8)，蒸煮30min,待晾至不黏手，15g/50ml三角瓶分装,姆瓶加入0.3g沃氏氧化物(对照组不含)，充分混匀，121°C灭菌20分钟。待冷却后，用无菌水将斜面上的孢子冲洗下来，8层纱布过滤后，Iml/瓶接入小米培养基内。28°C培养3天，小米培养基上长出高约Icm的白色菌丝，上端大量分布黑色孢子。于4°C下保存以利于转接。发酵培养及转化:发酵培养基400ml，含葡萄糖Sg，豆饼粉6g，玉米浆10g，蚕蛹粉
0.8g,硫酸铵0.6g,氢氧化钠调pH值至4.5,分装,50ml/500ml三角瓶,实验组加入2%的沃氏氧化物(对照组加入0.2%的沃氏氧化物)，121°C灭菌20分钟。用无菌水将种子从小米培养基下冲洗下来，8层纱布过滤，调浓度至约IO8个/ml，按4%接种量接种于发酵培养基，280C，180r/min培养3天。实验组的菌株经过0.5%、I %、1.5%及2%的沃氏氧化物的多级驯化，种子及发酵阶段的培养均在含2%沃氏氧化物的培养基中。对照组采用较传统的方法，即斜面、种子阶段均不含沃氏氧化物，发酵接种时采用含0.2%沃氏氧化物的培养基先诱导，发酵16小时后再添加入1.8%的沃氏氧化物进行转化。结果如表1:表I黑根霉Rhizopus nigricans TS-8522转化沃氏氧化物生成霉菌氧化物
权利要求
1.一种黑根霉及其催化留体羟基化反应的微生物转化方法，其特征在于:筛选黑根霉(Rhizopus nigricans)—诱变、筛选—新黑根霉菌(Rhizopus nigricans TS-8522)—斜面活化一多级驯化一发酵转化一过滤干燥一丙酮提取一蒸发浓缩一NaOH皂化一样品。
2.根据权利要求1所述的ー种黑根霉及其催化留体羟基化反应的微生物转化方法，其特征在于:所述的黑根霉菌经过飞秒激光诱变及筛选，获得能有效将沃氏氧化物Cll a -羟基化转化为霉菌氧化物的新黑根霉菌。
3.根据权利要求1、2所述的ー种黑根霉及其催化留体羟基化反应的微生物转化方法，其特征在干:所述的新黑根霉菌经过沃氏氧化物多级驯化后，将其进行种子培养，驯化培养基为添加了 0.5m1.5%及2%沃氏氧化物的小米培养基，种子培养基为含2%沃氏氧化物的小米培养基。
4.根据权利要求1所述的ー种黑根霉及其催化留体羟基化反应的微生物转化方法，其特征在干:所述的发酵转化中的发酵培养基为(g/L):葡萄糖15，，豆饼粉15，玉米浆25，蚕蛹粉2，(NH4)2SO4 1.5，六水氯化铁1.5，pH值为4.5，添加2%经こ醇加热回流处理的沃氏氧化物。
5.根据权利要求1、4所述的ー种黑根霉及其催化留体羟基化反应的微生物转化方法，其特征在于:所述的发酵培养基菌体的培养条件为:装液量4L-5L发酵罐，接种量为2%，搅拌转速为400r/min，28°C下转化3天。其中，转化24小时后向发酵液中一次性补加10%葡 萄糖。
全文摘要
本发明所涉及一种黑根霉及采用该微生物催化甾体羟基化反应生产霉菌氧化物的方法。该方法利用发明人诱变、筛选并驯化获得的能使沃氏氧化物转化为霉菌氧化物的微生物菌株黑根霉(Rhizopus nigricans)TS-8522。在种子培养阶段采用含浓度梯度沃氏氧化物的小米培养基驯化，并通过优化培养基的碳氮源组成及微量元素的添加，28℃下发酵培养转化3天，采用丙酮法提取，HPLC检测，其转化率可达54％。相对于化学合成法具有以下优点转化专一性高，副产物含量极低；生产步骤简单，产品得率高；提取方法费用低，大量节省成本；反应条件温和，环境良好。
文档编号C12N1/14GK103088013SQ201210468288
公开日2013年5月8日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者刘志强, 陶帅 申请人:湖南科源生物制品有限公司