萝藦c21甾体提取物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，涉及萝蘑C21留体提取物及其制备方法，还涉及萝蘑C21甾 体提取物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂中的用途。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的疾病之一，它以细胞异常增殖和转移为特 点。世界卫生组织统计资料表明，2000年全球新发恶性肿瘤病例约1000万，死亡620万， 患病2200万例；预计到2020年恶性肿瘤新发病例将达到1500万，死亡1000万，患病3000 万例。化疗是恶性肿瘤综合疗法的方法之一，广泛用于术前、术中和术后，但肿瘤细胞多药 耐药现象严重影响化疗对恶性肿瘤的疗效。克服肿瘤药物的多药耐药，恢复耐药肿瘤细胞 对药物的敏感性，寻找高效低毒的肿瘤细胞多药耐药逆转剂是当前肿瘤治疗药物的研究方 向。
[0003] 肿瘤细胞多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和 作用机制完全不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。肿瘤细胞多药耐药是肿瘤难治愈的主要 原因之一，据美国癌症协会估计，90%的癌症化疗失败归因于多药耐药。
[0004] 萝蘑系萝蘑科 Asclepiadaceae 萝蘑属植物萝蘑 (Thunb.) Mak.，为《中药大辞典》所收载，味甘辛，性平，具有补益精气，通乳，解毒的功能，用于虚损劳 伤，阳萎，带下，乳汁不通，丹毒疮肿。已有文献报道从萝蘑中分离鉴定C21留体类化合物， 迄今从萝蘑中分离鉴定的C21留体类化合物包括去酰基萝蘑苷元衍生物和苷3种，夜来香 素苷元衍生物和苷20种，ramamone苷元衍生物和苷5种，肉珊瑚苷元1种，去羟基肉珊瑚 苷兀 1 种（Warashina T，ei PAf tocAemistry, 1998Λ9-.2103-2108. ；ffarashina l,et al. 泛￡? 及/#，1998,46 :1752-1757.)，但目前未见高含量萝蘑C21甾体提取物的 产品；未见有关萝蘑C21留体在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂方面的研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，开发利用迄今为止应用尚 不广泛的萝蘑科萝蘑属植物萝蘑(Thunb. ) Mak.，尤其是其C21甾体 类成分。
[0006] 本案发明人通过对萝蘑进行细致深入的研究，发明了高含量萝蘑C21留体提取物 提取分离纯化方法，制得的提取物经药理活性研究证明具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用， 因而完成了本发明。
[0007] 本发明提供萝蘑C21留体提取物及其制备方法和用途。
[0008] 本发明的萝蘑C21留体提取物从萝蘑干燥藤茎中提取，其中C21留体重量百分含 量为50~95%，制备方法包括以下步骤： a) 萝蘑干燥藤茎粗粉用第一溶剂回流提取，滤过，提取液合并，提取液减压浓缩； b) 将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无 色，弃去洗脱液； C)用第二溶剂洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液； d) 用第三溶剂洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液； e) 将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，用第四溶剂洗脱，收集洗脱液，减 压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物； 在以上步骤中，其中步骤a)的第一溶剂为0~100%乙醇水溶液，步骤b)大孔吸附树脂 包括非极性或弱极性大孔吸附树脂，步骤c)的第二溶剂为10~50%乙醇溶液，步骤d)的第 三溶剂为60~90%乙醇溶液，步骤e)的第四溶剂为90%乙醇溶液。
[0009] 本发明的萝蘑C21留体提取物从萝蘑干燥藤茎中提取，优选的其中C21留体重量 百分含量为70~95%，制备方法包括以下步骤： a) 萝蘑干燥藤茎粗粉加70~90%乙醇回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇； b) 将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱DlOl色谱，用水洗脱至洗脱液 近无色，弃去洗脱液； c) 用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液； d) 用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液； e) 将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集 洗脱液，减压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物。
[0010] 本发明提供萝蘑C21留体提取物的制备方法，该方法包括以下步骤： a) 萝蘑干燥藤茎粗粉用第一溶剂回流提取，滤过，提取液合并，提取液减压浓缩； b) 将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无 色，弃去洗脱液； c) 用第二溶剂洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液； d) 用第三溶剂洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液； e) 将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，用第四溶剂洗脱，收集洗脱液，减 压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物； 在以上步骤中，其中步骤a)的第一溶剂为0~100%乙醇溶液，步骤b)大孔吸附树脂包 括非极性或弱极性大孔吸附树脂，步骤c)的第二溶剂为10~50%乙醇溶液，步骤d)的第三 溶剂为60~90%乙醇溶液，步骤e)的第四溶剂为90%乙醇溶液。
[0011] 本发明提供萝蘑C21留体提取物的制备方法，优选的该方法包括以下步骤： a) 萝蘑干燥藤茎粗粉加70~90%乙醇回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇； b) 将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱DlOl色谱，用水洗脱至洗脱液 近无色，弃去洗脱液； c) 用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液； d) 用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液； e) 将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集 洗脱液，减压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物。
[0012] 本发明提供萝蘑C21留体提取物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂中的用途。
[0013] 本发明的萝蘑C21留体提取物通过下列研究证明其具有逆转肿瘤细胞多药耐药 作用，萝蘑C21留体提取物通过下列方法得到的：萝蘑干燥藤茎粉碎后，加90%乙醇回流提 取三次，每次用量为萝蘑干燥藤茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提 取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱DlOl色谱，填充大孔吸 附树脂DlOl体积为萝蘑干燥藤茎重量的0. 5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱 液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗 脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为萝蘑干燥藤茎重量的 〇. 5倍体积，用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得萝蘑C21留体提取 物。
[0014] 构建人胃癌多药耐药细胞株SGC-7901/VCR，采用MTT法测定人胃癌多药耐药细胞 株对阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺钼的耐药倍数分别为276. 28倍、3. 63倍和1. 56倍；构建人结 肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR，采用MTT法测定人结肠癌多药耐药细胞株对阿霉素、顺钼 和5-氟尿嘧啶的耐药倍数分别为273. 66倍、4. 05倍和2. 92倍；构建人肺癌多药耐药细胞 株A549/T，采用MTT法测定人肺癌多药耐药株对紫杉醇、阿霉素和顺钼的耐药倍数分别为 7. 16 倍、5. 30 倍和 2. 14 倍。
[0015] 萝蘑C21留体提取物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对阿霉素耐药 作用：单独阿霉素对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为145. 04±9. 64 //g/ml ;阿霉素联合萝蘑C21留体提取物50 //g/ml对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR 半数抑制浓度为〇. 30±0. 03 //g/ml，逆转倍数为483. 47倍；阿霉素联合萝蘑C21留体提 取物25 //g/ml对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为2. 74±0. 12 //g/ ml，逆转倍数为52. 93倍。
[0016] 萝蘑C21留体提取物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对紫杉醇耐药作用：单 独紫杉醇对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为41. 15±1. 04 //g/ml ;紫杉醇 联合萝蘑C21留体提取物50 //g/ml对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为 5. 29±1.45 //g/ml，逆转倍数为7. 78倍；紫杉醇联合萝蘑C21留体提取物25 //g/ml对人 肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为15. 14±1. 36 //g/ml，逆转倍数为2. 72倍。
[0017] 萝蘑C21留体提取物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对阿霉素耐药 作用：单独阿霉素对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为107. 75±5