液近无色，弃去洗脱液，用70%乙 醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，70%乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体 积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物0.72 Kg，其中C21甾 体重量百分含量94%。
[0041] 实施例6 取萝蘑干燥藤茎粗粉100 Kg，加8倍量80%乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提 取液合并，减压回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于DlOl大孔吸附树脂柱上，用水 洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙 醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，70%乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体 积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物0. 78 Kg，其中C21甾 体重量百分含量82%。
[0042] 实施例7 取萝蘑干燥藤茎粗粉100 Kg，加8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提 取液合并，减压回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于DlOl大孔吸附树脂柱上，用水 洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙 醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，70%乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体 积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物0.94 Kg，其中C21甾 体重量百分含量71%。
[0043] 实施例8 萝蘑C21留体提取物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对阿霉素耐药作用 萝蘑C21留体提取物的制备：萝蘑干燥藤茎粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用 量为萝蘑干燥藤茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压 回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱DlOl色谱，填充大孔吸附树脂DlOl体 积为萝蘑干燥藤茎重量的〇. 5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇 洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处 理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为萝蘑干燥藤茎重量的0. 5倍体积， 用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得萝蘑C21留体提取物。
[0044] 取对数生长期的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR用含10%FBS的PPMI-1640 培养液调整细胞浓度至IX IO5个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 //1/孔，置于含有 5%0)2的37°C恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 //1含有不同浓度阿霉素 的培养基、萝蘑C21留体提取物(终浓度50 //g/ml)和不同浓度阿霉素的培养基、萝蘑C21 甾体提取物(终浓度25 //g/ml)和不同浓度阿霉素的培养基，加药后继续培养48小时后， 在各孔中加入20 //1浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO， 经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算 抑制率和IC5tl，计算逆转指数=阿霉素 IC5c/阿霉素联合萝蘑C21留体提取物IC5tl。结果见 表1。
[0045] 表1萝蘑C21留体提取物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对阿霉素耐 药作用
【主权项】
1. 萝蘑C21留体提取物，其特征在于从萝蘑干燥藤茎中提取，其中C21留体重量百分含 量为50~95%，制备方法包括以下步骤： a) 萝蘑干燥藤茎粗粉用第一溶剂回流提取，滤过，提取液合并，提取液减压浓缩； b) 将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无 色，弃去洗脱液； c) 用第二溶剂洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液； d) 用第三溶剂洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液； e) 将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，用第四溶剂洗脱，收集洗脱液，减 压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物； 在以上步骤中，其中步骤a)的第一溶剂为0~100%乙醇溶液，步骤b)大孔吸附树脂包 括非极性或弱极性大孔吸附树脂，步骤c)的第二溶剂为10~50%乙醇溶液，步骤d)的第三 溶剂为60~90%乙醇溶液，步骤e)的第四溶剂为90%乙醇溶液。
2. 根据权利要求1所述的萝蘑C21留体提取物，其特征在于从萝蘑干燥藤茎中提取，其 中C21留体重量百分含量为70~95%，制备方法包括以下步骤： a) 徐长卿干燥根和根茎粗粉加70~90%乙醇回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙 醇； b) 将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱DlOl色谱，用水洗脱至洗脱液 近无色，弃去洗脱液； c) 用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液； d) 用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液； e) 将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集 洗脱液，减压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物。
3. 权利要求1所述的萝蘑C21留体提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤： a) 徐长卿干燥根和根茎粗粉用第一溶剂回流提取，滤过，提取液合并，提取液减压浓 缩； b) 将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无 色，弃去洗脱液； c) 用第二溶剂洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液； d) 用第三溶剂洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液； e) 将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，用第四溶剂洗脱，收集洗脱液，减 压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物； 在以上步骤中，其中步骤a)的第一溶剂为0~100%乙醇溶液，步骤b)大孔吸附树脂包 括非极性或弱极性大孔吸附树脂，步骤c)的第二溶剂为10~50%乙醇溶液，步骤d)的第三 溶剂为60~90%乙醇溶液，步骤e)的第四溶剂为90%乙醇溶液。
4. 根据权利要求3所述的萝蘑C21留体提取物的制备方法，其特征在于包括以下步 骤： a) 萝蘑干燥根和根茎粗粉加70~90%乙醇回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇； b) 将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱DlOl色谱，用水洗脱至洗脱液 近无色，弃去洗脱液； C)用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液； d) 用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液； e) 将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集 洗脱液，减压浓缩、干燥得萝蘑C21留体提取物。
5. 萝蘑C21留体提取物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂中的应用，其特征在于，所述 的萝蘑C21留体提取物通过下列方法得到的：萝蘑干燥藤茎粉碎后，加 90%乙醇回流提取三 次，每次用量为萝蘑干燥藤茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液 合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱DlOl色谱，填充大孔吸附树 脂DlOl体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0. 5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗 脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集 洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为萝蘑干燥藤茎重量 的〇. 5倍体积，用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得萝蘑C21甾体 提取物。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该提取物在制备结肠癌多药耐药细胞耐 阿霉素逆转剂中的应用。
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该提取物在制备肺癌多药耐药细胞耐紫 杉醇逆转剂中的应用。
8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该提取物在制备胃癌多药耐药细胞耐阿 霉素逆转剂中的应用。
9. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该提取物在制备结肠癌多药耐药细胞耐 5_氟尿嘧啶逆转剂中的应用。
10. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该提取物在制备结肠癌多药耐药细胞耐 顺钼逆转剂中的应用。
【专利摘要】本发明提供了萝藦C21甾体提取物及其制备方法和用途。萝藦干燥藤茎经0~100%乙醇溶液提取，大孔吸附树脂和脱色树脂法分离萝藦C21甾体，其中C21甾体重量百分含量为50~95%。制得的萝藦C21甾体提取物经药理活性研究证明，具有逆转肿瘤多药耐药作用，可用于制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂。
【IPC分类】A61K36-27, A61P35-00
【公开号】CN104706698
【申请号】CN201510162007
【发明人】王威, 刘小红, 韩立春, 颜世达, 姚慧丽
【申请人】青岛大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月8日