专利名称：胚胎干细胞分化成t细胞的培养方法及分化培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于干细胞与免疫学领域，涉及干细胞的培养方法，尤其是涉及胚胎干细胞分化成T细胞的培养方法。
背景技术：
T淋巴细胞是特异性免疫应答主要的效应细胞之一，在感染性疾病，尤其是病毒和胞内寄生虫，以及肿瘤免疫中发挥重要的作用。T淋巴细胞的异常不仅可使宿主易患感染性疾病和肿瘤，还可导致自身免疫性疾病和过敏性疾病。临床上常见的移植排斥和许多老年性疾病也与T淋巴细胞密切相关。
到目前为止，T淋巴细胞的发育过程和作用机制还不十分清楚。这主要是由于T淋巴细胞的发育必须依赖胸腺微环境，因此，很难在体外诱导出T淋巴细胞，实验动物体外诱导T淋巴细胞必须依赖胚胎胸腺器官培养或重聚胸腺器官培养提供立体支持和特殊的信号。
最近有文献报道(Nat Immunol.2004 Apr；5(4)410-7)，通过转染了Notchligand(Delta-1)的OP-9细胞也能在体外诱导出T淋巴细胞，这一发现为研究T淋巴细胞的发育过程提供了模型，也为获得可用于临床治疗的T淋巴细胞提供了来源。但已报道的诱导体系都存在以下两方面的缺陷(1)必须依赖外源性的细胞提供T淋巴细胞分化所需的立体支持和分化信号，这些细胞有的来源极少，有的与T细胞的某些前体细胞极其相似，还有的转入了外源基因易导致细胞发生变异，从而限制了T细胞的应用。(2)转入外源基因时使用的载体等本身就有致癌致畸的危险，因此，很难进入实际的临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一个胚胎干细胞分化成T细胞的培养方法，能克服现有诱导体系的上述缺陷。
本发明利用胚胎干细胞自身具有多向分化潜能的特性，通过不同细胞因子的组合，诱导其向T细胞方向分化。来源于胚胎干细胞的胚胎体在细胞因子的作用下，通过自身的空间结构和细胞膜表面分子提供T细胞分化所需的立体支持和特殊的信号，获得可用于临床治疗的安全的T淋巴细胞。
本发明所述的胚胎干细胞分化成T细胞的培养方法，包括以下步骤A.制备胚胎体用胰酶将胚胎干细胞消化成单个细胞接种于含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中悬浮培养5～7天，诱导胚胎体形成；B.将胚胎体转入分化培养液中，所述的分化培养液是在含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中加入50～200ng/ml干细胞因子，5～20ng/ml白介素-3，5～20ng/ml白介素-7，5～20μg/ml胸腺肽；C.胰酶消化胚胎体成单个细胞，标记T细胞特异性表面分子相应抗体，流式细胞仪检测T细胞数量，得到所需的T细胞。
所述的高糖DMEM培养液选自HYCLONE公司的Cat.No.SH30003.01的产品，或者GIBCO公司的同类产品。
效果评价分化培养一周后开始出现CD3分子表达，两周后出现CD4/CD8单阳细胞，三周半至四周时CD3+细胞≥25％，CD3+CD4+细胞≥6％，CD3+CD8+细胞≥2％随着培养时间的延长，阳性细胞百分率可能进一步增加。
本发明还提供了一种胚胎干细胞分化成T细胞的分化培养基。
所述的胚胎干细胞分化成T细胞的分化培养基，包括冻存的细胞因子组合，含有以下成分干细胞因子50～200ng/ml白介素-3 5～20ng/ml白介素-7 5～20ng/ml胸腺肽5～20μg/ml；使用时，将其解冻后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中。
本发明的优点在于摒弃了以往体外诱导T细胞需要依赖外源性细胞的做法，避免了转入了外源基因易导致细胞发生变异的缺陷，利用胚胎干细胞来源的胚胎体和安全的细胞因子提供T细胞分化所需条件，直接从胚胎干细胞诱导出T淋巴细胞，为研究T细胞分化提供一个简单有效的体外模型，为临床应用T细胞提供了一个安全有效的来源。
图1为在本发明所述的T细胞诱导体系中诱导一个月后的流式细胞检测图；(a)图中显示总T细胞占总细胞数量的38.9％，其中CD3+CD8+细胞为29.3％；(b)图中显示总T细胞占总细胞数量的41.1％，其中CD3+CD4+细胞为33.4％；(c)图中显示CD4+CD8+细胞占总细胞数量的27.7％，CD4+细胞为6.5％，CD8+细胞为5.5％。
具体实施例方式
材料胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES cells)，为国际通用细胞系E14.1和本发明人所在实验室自建的来源于B6/129的细胞系SC1001和SC1002。
仪器主要包括CO2孵箱、离心机、流式细胞仪等。
本发明所述的胚胎干细胞分化成T细胞的培养方法，包括以下步骤A.制备胚胎体用胰酶将胚胎干细胞消化成单个细胞接种于含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中悬浮培养5～7天，诱导胚胎体形成。
所述的高糖DMEM培养基选用HYCLONE公司的CAT NO.SH30003.01产品，或者GIBCO公司的同类产品。
B.将胚胎体转入分化培养液中，所述的分化培养液是在含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中加入50～200ng/ml干细胞因子，5～20ng/ml白介素-3，5～20ng/ml白介素-7，5～20μg/ml胸腺肽；C.胰酶消化胚胎体成单个细胞，标记T细胞特异性表面分子相应抗体，流式细胞仪检测T细胞数量，得到所需的T细胞。
在步骤B中，所述的分化培养液中加入的成分包括但不限于以下组合组合一50ng/ml干细胞因子，5ng/ml白介素-3，5ng/ml白介素-7，5μg/ml胸腺肽；
组合二100ng/ml干细胞因子，10ng/ml白介素-3，10ng/ml白介素-7，10μg/ml胸腺肽；组合三200ng/ml干细胞因子，20ng/ml白介素-3，20ng/ml白介素-7，20μg/ml胸腺肽。
效果评价分化培养一周后开始出现CD3分子表达，两周后出现CD4/CD8单阳细胞，三周半至四周时CD3+细胞≥25％，CD3+CD4+细胞≥6％，CD3+CD8+细胞≥2％随着培养时间的延长，阳性细胞百分率可能进一步增加。
如图1所示，在本发明所述的T细胞诱导体系中诱导一个月后，经流式细胞仪检测，约40％的细胞是CD3+T淋巴细胞，其中CD4+CD8+细胞占27％，CD4+细胞占6％，CD8+细胞占5.5％本发明还提供了一种胚胎干细胞分化成T细胞的分化培养基。
所述的胚胎干细胞分化成T细胞的分化培养基，包括冻存的细胞因子组合，含有以下成分干细胞因子50～200ng/ml白介素-3 5～20ng/ml白介素-7 5～20ng/ml胸腺肽5～20μg/ml；使用时，将其解冻后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中。
该分化培养基的成分包括但不限于以下组合组合一50ng/ml干细胞因子，5ng/ml白介素-3，5ng/ml白介素-7，5μg/ml胸腺肽；组合二100ng/ml干细胞因子，10ng/ml白介素-3，10ng/ml白介素-7，10μg/ml胸腺肽；组合三200ng/ml干细胞因子，20ng/ml白介素-3，20ng/ml白介素-7，20μg/ml胸腺肽。
权利要求
1.胚胎干细胞分化成T细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤A.制备胚胎体用胰酶将胚胎干细胞消化成单个细胞接种于含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中悬浮培养5～7天，诱导胚胎体形成；B.将胚胎体转入分化培养液中，所述的分化培养液是在含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中加入50～200ng/ml干细胞因子，5～20ng/ml白介素-3，5～20ng/ml白介素-7，5～20μg/ml胸腺肽；C.胰酶消化胚胎体成单个细胞，标记T细胞特异性表面分子相应抗体，流式细胞仪检测T细胞数量，得到所需的T细胞。
2.一种胚胎干细胞分化成T细胞的分化培养基，其特征在于包括冻存的细胞因子组合，含有以下成分干细胞因子 50～200ng/ml白介素-35～20ng/ml白介素-75～20ng/ml胸腺肽 5～20μg/ml；使用时，将其解冻后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液中。
全文摘要
本发明属于干细胞与免疫学领域，涉及胚胎干细胞分化成T细胞的培养方法。本发明所述的方法包括以下步骤制备胚胎体将胚胎体转入分化培养液中；胰酶消化胚胎体成单个细胞，标记T细胞特异性表面分子相应抗体，流式细胞仪检测T细胞数量，得到所需的T细胞。本发明还提供了胚胎干细胞分化成T细胞的分化培养基。本发明摒弃了以往体外诱导T细胞需要依赖外源性细胞的做法，避免了转入了外源基因易导致细胞发生变异的缺陷，利用胚胎干细胞来源的胚胎体和安全的细胞因子提供T细胞分化所需条件，直接从胚胎干细胞诱导出T淋巴细胞，为研究T细胞分化提供一个简单有效的体外模型，为临床应用T细胞提供了一个安全有效的来源。
文档编号C12N5/08GK1804028SQ200510032739
公开日2006年7月19日 申请日期2005年1月13日 优先权日2005年1月13日
发明者项鹏, 李树浓, 彭延文 申请人:中山大学