专利名称：间质干细胞与造血干细胞联合移植促进造血重建和免疫重建的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于干细胞与免疫学领域，涉及干细胞的新用途及应用方法，尤其是涉及间质干细胞与造血干细胞联合移植的应用。
背景技术：
造血干细胞移植后存在着复杂的矛盾，例如(1)同种移植后免疫重建困难而引起严重感染；(2)供体细胞植入同时却诱发移植物抗宿主病(graft versushost disease，GVHD)，为了降低GVHD，通常采用去除T细胞的造血细胞移植，但不利于免疫重建，更容易发生移植后感染。由于上述问题相互交织，至今也难于找到各方面均可兼顾的综合处理方案，因此严重影响了同种造血干细胞移植的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供间质干细胞与造血干细胞联合移植促进造血重建和免疫重建的应用，此应用不仅可促进BMT后造血重建和免疫重建，也可降低GVHD的发生率及其严重程度，从而为造血干细胞移植后的复杂矛盾提供了新的途径。
基于间质干细胞(mesenchvmal stell cells，MSC)对造血重建的促进作用以及特有的免疫学特征，发明人探讨出间质干细胞与造血干细胞联合移植促进造血重建和免疫重建的应用方法，当用于大鼠的造血重建和免疫重建时，包括以下步骤A.间质干细胞的分离、鉴定与传代扩增移植前，取同种异体健康骨髓，收获单个核细胞进行培养，借助间质干细胞的贴壁特性，反复换液、弃悬浮细胞，逐步获得纯的骨髓间质干细胞；通过形态学观察、流式细胞术分析、向成骨、成脂、神经样细胞分化的多向分化潜能鉴定，证实分离到的细胞为间质干细胞，并不断传代扩增，备用；B.间质干细胞与同种异体造血干细胞联合移植移植前处理造血干细胞的准备同常规骨髓移植方案；按步骤A备用的间质干细胞，细胞活度检测＞95％，在常规骨髓移植的基础上加入间质干细胞，同时经静脉输入受体，输入剂量为2.5×107细胞/Kg体重。
当用于病人的造血重建和免疫重建时，包括以下步骤A.间质干细胞的分离、鉴定与传代扩增移植前，取同种异体健康骨髓，收获单个核细胞进行培养，借助间质干细胞的贴壁特性，反复换液、弃悬浮细胞，逐步获得纯的骨髓间质干细胞；通过形态学观察、流式细胞术分析、向成骨、成脂、神经样细胞分化的多向分化潜能鉴定，证实分离到的细胞为间质干细胞，并不断传代扩增，备用；B.间质干细胞与同种异体造血干细胞联合移植移植前处理造血干细胞的准备同常规骨髓移植方案；按步骤A备用的间质干细胞，细胞活度检测＞95％，在常规骨髓移植的基础上加入间质干细胞，同时经静脉输入受体，输入剂量为2～8×106细胞/Kg体重。
本发明的优点在于间质干细胞与造血干细胞联合移植不仅明显促进骨髓移植(BMT)后造血重建和免疫重建；也可降低GVHD的发生率及其严重程度，从而极大地提高造血干细胞移植的治疗效果。
图1为骨髓组织切片HE染色图，左列为100×，右列为400×。第一排为A组，骨髓对照组；第二排为B组，BM组；第三排为C组，BM+MSC组。
具体实施例方式
(一)间质干细胞的分离、鉴定与传代扩增移植前，取同种异体健康骨髓，收获单个核细胞进行培养，借助MSC的贴壁特性，反复换液、弃悬浮细胞，逐步获得纯的骨髓间质干细胞。通过形态学观察、流式细胞术分析、向成骨、成脂、神经样细胞分化的多向分化潜能鉴定，证实分离到的细胞为间质干细胞，并不断传代扩增，备用。
(二)间质干细胞与同种异体造血干细胞联合移植移植前处理造血干细胞的准备同常规骨髓移植方案；按步骤A备用的间质干细胞，细胞活度检测＞95％，在常规骨髓移植的基础上加入间质干细胞，同时经静脉输入受体，输入剂量为2.5×107细胞/Kg体重。实验动物分为单纯骨髓移植组、造血干细胞与间质干细胞共移植组、单纯照射组。
(三)移植后造血重建、免疫重建及GVHD的检测(1)一般情况观察；(2)外周血象恢复检测；(3)骨髓穿刺病理检测及流式分析；(4)免疫功能分析；(5)GVHD(移植物抗宿主病)发生情况。
(四)效果评价(1)一般情况观察照射后10小时大鼠出现被毛凌乱、蓬松，次日出现消瘦、弓背、反应迟钝，少动拒食。约7至10天后，体重开始恢复，毛发变柔顺，活动增加，反应灵敏，进食及饮水量增加。
(2)骨髓穿刺病理检测及流式分析骨髓病理显示共移植组骨髓恢复较好，可见三系各期幼稚细胞；骨髓单纯移植组造血恢复欠佳，骨髓显示较多脂肪组织，骨髓髓系、红系、巨核系细胞均减少。骨髓组织切片H E染色如图1所示，分别为100×，400×。A组(骨衰对照组)致死量照射(8.5Gy)后13天，造血细胞消失，被脂肪组织取代；B组(BM组)虽有造血细胞植入，但骨髓髓系、红系、巨核系细胞均减少；C组(BM+MSC组)骨髓象基本恢复正常，可见三系各期幼稚细胞。
FACS进一步显示MSC共移植可明显促进造血干细胞向B淋巴细胞系、巨核细胞系分化。见表1。
(3)外周血象恢复检测单纯骨髓移植组、骨髓与MSC共移植组的血红蛋白均恢复较快，+30天时即恢复正常。在同一检测时间点比较，共移植组的淋巴细胞、血小板数均高于单纯骨髓移植组。+30天时，共移植组的血小板恢复已正常。详见表2。
(4)免疫功能分析移植后30天，共移植组的受体脾细胞、单纯骨髓移植组脾细胞分别与供体来源的脾细胞、受体来源的脾细胞共培养，二组均显示耐受状态。而共移植组的受体脾细胞分别经ConA、LPS、第三体来源的脾细胞刺激后，较对照组显示更高的刺激率，p值均＜0.05，见表3。这表明共移植组的T、B淋巴细胞功能均较对照组恢复早。
(5)GVHD发生情况移植后30天，BM组皮肤有2只出现中度GVHD损伤，MSC与BM共移植组仅有一只显示轻度GVHD。
表1骨髓穿刺流式分析结果
注*与骨髓移植组相应类别对比，P值均＜0.05表2移植后外周血象的动态变化
注*与骨髓移植组相应时间点、相应类别相比较，P值均＜0.05；#与正常组相应类别相比较，P值均＜0.05。
表3移植后30天，大鼠脾细胞对ConA、LPS诱导的淋巴细胞增殖反应(x±s)
注*与BM组相比，P值均＜0.05；
权利要求
1.间质干细胞与造血干细胞联合移植促进造血重建和免疫重建的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当用于大鼠的造血重建和免疫重建时，包括以下步骤A.间质干细胞的分离、鉴定与传代扩增移植前，取同种异体健康骨髓，收获单个核细胞进行培养，借助间质干细胞的贴壁特性，反复换液、弃悬浮细胞，逐步获得纯的骨髓间质干细胞；通过形态学观察、流式细胞术分析、向成骨、成脂、神经样细胞分化的多向分化潜能鉴定，证实分离到的细胞为间质干细胞，并不断传代扩增，备用；B.间质干细胞与同种异体造血干细胞联合移植移植前处理造血干细胞的准备同常规骨髓移植方案；按步骤A备用的间质干细胞，细胞活度检测＞95％，在常规骨髓移植的基础上加入间质干细胞，同时经静脉输入受体，输入剂量为2.5×107细胞/Kg体重。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当用于病人的造血重建和免疫重建时，包括以下步骤A.间质干细胞的分离、鉴定与传代扩增移植前，取同种异体健康骨髓，收获单个核细胞进行培养，借助间质干细胞的贴壁特性，反复换液、弃悬浮细胞，逐步获得纯的骨髓间质干细胞；通过形态学观察、流式细胞术分析、向成骨、成脂、神经样细胞分化的多向分化潜能鉴定，证实分离到的细胞为间质干细胞，并不断传代扩增，备用；B.间质干细胞与同种异体造血干细胞联合移植移植前处理造血干细胞的准备同常规骨髓移植方案；按步骤A备用的间质干细胞，细胞活度检测＞95％，在常规骨髓移植的基础上加入间质干细胞，同时经静脉输入受体，输入剂量为2～8×106细胞/Kg体重。
全文摘要
本发明属于干细胞与免疫学领域，涉及间质干细胞与造血干细胞联合移植促进造血重建和免疫重建的应用。本发明可用于大鼠和病人的造血重建和免疫重建时，包括以下步骤A、间质干细胞的分离、鉴定与传代扩增；B、间质干细胞与同种异体造血干细胞联合移植；C、移植后造血重建、免疫重建及GVHD的检测。本发明不仅明显促进骨髓移植(BMT)后造血重建和免疫重建；也可降低GVHD的发生率及其严重程度，从而极大地提高造血干细胞移植的治疗效果。
文档编号C12N5/08GK1804027SQ200510032738
公开日2006年7月19日 申请日期2005年1月13日 优先权日2005年1月13日
发明者项鹏, 李树浓, 雷俊霞 申请人:中山大学