专利名称：一种预防和治疗日本血吸虫感染的相关基因和蛋白质及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药、基因药物和基因工程产品，进一步是指东方田鼠血清白蛋白的分离纯化，及其基因工程产品的研制。东方田鼠血清白蛋白及白蛋白基因制品的开发，及其在预防和治疗日本血吸虫病中的用途。
背景技术：
据世界卫生组织的统计资料，全世界有70多个国家血吸虫病流行，2亿人感染了血吸虫，1亿2千万人出现临床感染症状，每年大约有2万人死于血吸虫病。我国的血吸虫为日本血吸虫。新中国成立以来，我国在血吸虫病控制方面取得巨大成就，但目前全国尚有108个县(市、区)未能控制血吸虫病流行。由于河道和湖区泥沙淤积，有钉螺面积逐年扩大，不但送走的瘟神有卷土重来之势，近年来某些城市也发现有血吸虫病流行，感染人群不断增加。而对该病目前尚无特别有效的防治方法。中国是世界上日本血吸虫病流行最为严重的国家之一。据最新资料显示，目前全国现有血吸虫病病人81万人，病牛近6万头，钉螺面积约34.5亿平方米，受感染者不计其数。而湖南省是全国血吸虫病最严重的省份，钉螺面积占全国有螺面积的51％，血吸虫病人21万多人，占全国血吸虫病人数的25.7％。虽然可以用吡喹酮等化学药物对血吸虫病患者进行有效治疗，由于化学药物有一定的副作用，加之患者治愈后机体并没有获得有效免疫，接触含有尾蚴的疫水后，可以反复感染再次发病。目前对日本血吸虫病尚无特别有效的预防方法。目前对日本血吸虫病的预防主要集中在日本血吸虫的中间宿主钉螺方面，消灭钉螺成为人类预防血吸虫病的有效方法之一。几十年人与钉螺斗争，难分胜负，这是日本血吸虫病发病率居高不下的主要原因。同时，科学家们积极研制血吸虫疫苗，希望能预防血吸虫病。由于血吸虫是一种多细胞真核生物，免疫机制极其复杂，研制疫苗任重而道远。因此，预防和控制血吸虫病仍是一个长期而艰巨的任务。
日本血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患性寄生虫病，可以感染包括人类在内的40多种哺乳动物。我国洞庭湖血吸虫病疫区栖居的野生动物东方田鼠对日本血吸虫具有天然抗性，日本血吸虫在其体内不能发育成熟和产卵，是目前所知的疫区唯一对日本血吸虫感染具有这种特殊抗性的啮齿类哺乳动物，而且这种特性能稳定地进行遗传。东方田鼠分布的范围很广，有证据表明，洞庭湖区与黄河以北(宁夏)的东方田鼠均对日本血吸虫感染具有抗性。
我国科学家从60年代开始，对东方田鼠抗日本血吸虫感染机制进行了一系列研究，解剖了数以万计疫区的东方田鼠，无一只发现日本血吸虫成虫或虫卵。实验室的研究证明，经人工感染日本血吸虫尾蚴于东方田鼠后，尽管虫体在感染后11天内能正常发育，但从第12天开始，虫体生长发育停滞，第20～28天虫体在体内全部消亡。现已证明，东方田鼠血清和淋巴细胞在体外对日本血吸虫童虫有杀伤作用，其体内存在的抗日本血吸虫天然抗体以及抗日本血吸虫的其它蛋白质。实验室驯化饲养的东方田鼠与野生东方田鼠均具有相同的特性。
在东方田鼠体内寻找抗日本血吸虫的特异基因和蛋白质，并且用于血吸虫病的预防和治疗，一直是我们长期以来努力探索的目标。
发明内容
本发明要解决的关键技术问题是，针对现有技术存在的不足和社会实际需求，提出预防血吸虫感染和治疗血吸虫病的方案，并从东方田鼠体内获得抗日本血吸虫的蛋白质——血清白蛋白和相应基因。该蛋白质和相应基因对体外培养的日本血吸虫童虫有明显的杀灭作用，对感染日本血吸虫的小白鼠有明显的预防和治疗作用。可以利用转基因技术，建立转基因家畜，阻断日本血吸虫的转播。不同来源的东方田鼠血清白蛋白及其基因的一级结构有所不同，但有相同的作用。该技术的社会效益和经济效益十分巨大。
本发明中的东方田鼠血清白蛋白及其基因系利用蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析法、聚丙烯酰氨凝胶电泳、透析、冷冻干燥，氨基酸测序，PCR体外基因扩增，DNA测序，以及生物信息学技术，从东方田鼠体内分离得到。
一、本发明主要有以下用途1.使用东方田鼠血清白蛋白，在感染日本血吸虫前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
2.利用蛋白质工程技术，改变东方田鼠血清白蛋白的氨基酸序列，形成血清白蛋白突变体，使用东方田鼠血清白蛋白的突变体，在感染日本血吸虫前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
3.将东方田鼠血清白蛋白基因插入真核表达载体，在感染日本血吸虫前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，将血清白蛋白基因导入体内，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
4.利用基因工程技术，改变东方田鼠血清白蛋白基因的核苷酸序列，形成血清白蛋白基因突变体。将东方田鼠血清白蛋白基因的突变体插入真核表达载体，在感染日本血吸虫前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，将血清白蛋白基因突变体导入体内，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
5.将东方田鼠血清白蛋白基因的突变体插入病毒(逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等)载体，在感染日本血吸虫前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，将白蛋白基因突变体导入体内，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
6.利用利用亲和层析法、聚丙烯酰氨凝胶电泳、透析、冷冻干燥等方法，从东方田鼠血清中分离、纯化血清白蛋白，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
7.上述东方田鼠血清白蛋白基因及其突变体的DNA序列插入真核表达载体，利用真核表达系统，在真核细胞(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞等)中表达和生产血清白蛋白，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
8.东方田鼠血清白蛋白基因及其突变体的DNA序列插入原核表达载体，利用原核表达系统，在原核细胞(包括大肠杆菌和其它细菌)中表达和生产血清白蛋白，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
9.上述东方田鼠指名亚种白蛋白基因及其突变体的DNA序列插入各种真核表达载体，包括逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体等病毒载体，通过基因导入技术，建立转基因动物(包括水牛和其它家畜)，使这些动物对血吸虫产生永久抗性，用于阻断血吸虫病的传播和蔓延。
二、以下对本发明做出进一步说明。
日本血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患性寄生虫病，可以感染包括人类在内的40多种哺乳动物。我国洞庭湖血吸虫病疫区栖居的野生动物东方田鼠对日本血吸虫具有天然抗性，日本血吸虫在其体内不能发育成熟和产卵。人工感染血吸虫尾蚴于东方田鼠后，尽管虫体在感染后11天内能正常发育，但从第12天开始，虫体生长发育停滞，第20～28天虫体在体内全部消亡。现已证明，东方田鼠血清和淋巴细胞在体外对血吸虫童虫有杀伤作用，其体内存在的抗日本血吸虫天然抗体以及抗日本血吸虫的其它蛋白质在抗日本血吸虫的过程中发挥了重要作用。实验室驯化饲养的东方田鼠与野生东方田鼠均具有相同的特性。东方田鼠是目前所知的疫区唯一对日本血吸虫感染具有这种特殊抗性的啮齿类哺乳动物，而且这种特性能稳定地进行遗传。
根据东方田鼠这一重要的遗传性状，本发明研制者经过几年的努力，利用亲和层析法、聚丙烯酰氨凝胶电泳、透析、冷冻干燥，用Edman降解法以及生物信息学技术对相关蛋白质进行分离纯化和氨基端序列测定，同时利用聚合酶链式反应(PCR)技术，对该基因进行体外扩增。将扩增的基因片段进行DNA序列测定和生物信息学分析。在东方田鼠指名亚种和长江亚种血清中分离到一个对日本血吸虫有特异抗性的蛋白质——血清白蛋白以及在东方田鼠指名亚种和长江亚种的肝细胞中获得这种蛋白质的基因序列。该专利成果为本发明的申请者首创，目前国内外尚未见到东方田鼠血清白蛋白及其基因用于血吸虫预防和治疗的报道和相关研究。
三、本发明的实验包括1.东方田鼠血清白蛋白的分离纯化。将成年东方田鼠用乙醚麻醉，眼框取血。血液收集于玻璃试管中，冰箱4℃过夜，使血液凝固。血液凝固后，3000转/每分钟，离心5分钟，收集血清。
东方田鼠血清以缓冲液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀释，经10000转/每分钟离心，去除不溶性物质后，上样于蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析柱顶部。层析柱用缓冲液I洗脱，以去除未结合蛋白质。随后用缓冲液II(0.05M KH2PO4，1.5M KCl，pH7.0)对血清白蛋白进行洗脱，收集洗脱液。透析袋(透析分子量8000-14000 kDa)用缓冲液I透析平衡24小时(其间换液至少3次)。将含有血清白蛋白的洗脱液装于透析袋内，4℃对水充分透析去盐3天(其间换液至少6次)，真空冷冻干燥。用12％ SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，对纯化的血清白蛋白进行纯度鉴定。(见图1)。
2.用Edman降解法对东方田鼠血清白蛋白进行氨基端序列测定，并结合生物信息学分析技术，得到血清白蛋白的氨基酸序列。(见图2、图3)。
3.根据小白鼠白蛋白基因的序列，设计如下引物ALBUMIN1 5’-ACCGGAATTCTAGCCTCTGGCAAAATGA-3’ALBUMIN2 5’-CCGGAATTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’在乙醚麻醉下，处死动物，取东方田鼠肝脏，提取总RNA，使用引物ALBUMIN1和ALBUMIN2，利用聚合酶链式反应技术，对血清白蛋白基因进行体外扩增。将扩增的基因片段进行DNA序列测定和生物信息学分析。得到东方田鼠白蛋白基因的序列(见图4、图5)。
根据东方田鼠指名亚种和长江亚种血清白蛋白基因序列，推导其编码产物为608个氨基酸残基的白蛋白前体，白蛋白前体的氨基酸序列为(见图6、图7)。
东方田鼠指名亚种和长江亚种血清白蛋白基因在翻译后的蛋白质加工过程中信号肽序列被剪切掉，形成成熟的白蛋白。白蛋白信号肽序列如下MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGLFRR4.体外杀日本血吸虫童虫试验。将纯化的东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫一起培养，在光学显微镜下连续计数96小时，观察活血吸虫童虫数量。以东方田鼠血清作为阳性对照，牛血清白蛋白作为阴性对照。结果可见，东方田鼠血清白蛋白对体外培养的日本血吸虫童虫有明显的杀伤作用，而且呈现剂量依赖关系(图8、图9)。
5.对感染血吸虫的小白鼠的治疗作用。将小白鼠先感染日本血吸虫尾蚴，再经腹腔、静脉或肌肉注射，使东方田鼠血清白蛋白进入小白鼠体内，以牛血清白蛋白作为阴性对照。41天后，处死小白鼠，计数小白鼠体内血吸虫成虫数、每克肝组织的虫卵数，计算减虫率和减卵率。与对照组相比，效果非常明显。(表1)。
表1东方田鼠血清白蛋白小白鼠体内抗日本血吸虫的实验结果
注结果以均值±SD表示6.真核表达载体用限制性核酸内切酶消化，将东方田鼠血清白蛋白基因插入真核表达载体，转化大肠杆菌，提取重组真核表达载体。用重组真核表达载体转染真核细胞(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞等)，利用真核表达系统，在真核细胞中表达和生产东方田鼠血清白蛋白，并且分泌到细胞培养液中，收集含有血清白蛋白的细胞培养液。纯化后用于血吸虫的预防和治疗。
将这种细胞培养液与缓冲液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀释，经10000转/每分钟离心去除不溶性物质后，上样于蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析柱顶部。层析柱用缓冲液I洗脱，以去除未结合蛋白质。随后用缓冲液II(0.05MKH2PO4，1.5M KCl，pH7.0)对血清白蛋白进行洗脱，收集洗脱液。透析袋(透析分子量8000-14000kDa)用缓冲液I透析平衡24小时(其间换液至少3次)。将含有白蛋白的洗脱液置于透析袋内，4℃对水充分透析去盐3天(其间换液至少6次)，真空冷冻干燥。用12％ SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，对纯化的血清白蛋白进行纯度鉴定。将纯化的白蛋白与日本血吸虫童虫一起培养，在光学显微镜下连续计数96小时，以东方田鼠血清作为阳性对照，观察活日本血吸虫童虫数量。
7.原核表达载体用限制性核酸内切酶消化，将东方田鼠血清白蛋白基因插入原核表达载体，转化大肠杆菌，利用原核表达系统，在大肠杆菌中表达东方田鼠血清白蛋白，从大肠杆菌中分离、纯化东方田鼠血清白蛋白，用于血吸虫的预防和血吸虫病的治疗。将纯化的白蛋白与日本血吸虫童虫一起培养，在光学显微镜下连续计数96小时，以东方田鼠血清作为阳性对照，观察活日本血吸虫童虫数量。
8.将东方田鼠血清白蛋白基因插入真核表达载体，经腹腔、静脉或肌肉注射，使白蛋白基因进入小白鼠体内，再感染日本血吸虫尾蚴，41天后，处死小白鼠，计算小白鼠体内血吸虫成虫数、每克肝组织的卵数，计算减虫率和减卵率。与对照组相比，效果明显。可见东方田鼠白蛋白基因对小白鼠感染血吸虫的的保护作用。
9.将东方田鼠白蛋白基因插入逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒载体，经腹腔、静脉或肌肉注射，使白蛋白基因进入小白鼠体内，再感染日本血吸虫尾蚴，41天后，处死小白鼠，数小白鼠体内血吸虫成虫数、每克肝组织的卵数，计算减虫率和减卵率。与对照组相比，效果非常明显，可见东方田鼠白蛋白基因对小白鼠感染血吸虫的的保护作用。
10.利用基因工程和蛋白质工程技术，改变东方田鼠血清白蛋白基因的一级结构，产生血清白蛋白突变体，插入真核表达载体和原核表达载体，通过真核表达系统核原核表达系统，生产东方田鼠血清白蛋白突变体，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
11.将东方田鼠血清白蛋白或者白蛋白突变体基因序列插入各种真核表达载体，包括逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体等病毒载体，通过基因导入技术，建立转基因动物(包括水牛和其它家畜)，使这些动物对血吸虫产生永久抗性，用于阻断血吸虫病的传播和蔓延。
图1中A是蓝色葡聚糖凝胶洗脱图，B是聚丙烯酰氨凝胶电泳图。
图2是东方田鼠指名亚种白蛋白的氨基酸序列。
图3是东方田鼠长江亚种白蛋白的氨基酸序列。
图4是东方田鼠指名亚种白蛋白基因的核苷酸序列。
图5是东方田鼠长江亚种白蛋白基因的核苷酸序列。
图6是根据东方田鼠指名亚种白蛋白基因的核苷酸序列推导的白蛋白前体的氨基酸序列。
图7是根据东方田鼠长江亚种白蛋白基因的核苷酸序列推导的白蛋白前体的氨基酸序列。
图8是东方田鼠白蛋白对日本血吸虫童虫的抑制作用。
图8中A是日本血吸虫童虫经10mg/ml东方田鼠血清白蛋白处理；B是日本血吸虫童虫经5mg/ml东方田鼠血清白蛋白处理；C是日本血吸虫童虫经40％东方田鼠全血清处理；D是日本血吸虫童虫经10mg/ml牛血清白蛋白处理。图8A、B、C显示的日本血吸虫童虫均为死童虫；图8D显示的日本血吸虫童虫为活童虫。
图9是东方田鼠血清白蛋白浓度与日本血吸虫童虫死亡率的关系。
具体实施例方式
1.东方田鼠血清白蛋白的分离纯化。
将成年东方田鼠用乙醚麻醉，眼框取血。血液收集于玻璃试管中，冰箱4℃过夜，使血液凝固。血液凝固后，3000转/每分钟，离心5分钟，收集血清。
东方田鼠血清以缓冲液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀释，经10000转/每分钟离心，去除不溶性物质后，上样于蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析柱顶部。层析柱用缓冲液I洗脱，以去除未结合蛋白质。随后用缓冲液II(0.05M KH2PO4，1.5M KCl，pH7.0)对血清白蛋白进行洗脱，收集洗脱液。透析袋(透析分子量8000-14000 kDa)用缓冲液I透析平衡24小时(其间换液至少3次)。将含血清白蛋白的洗脱液置于透析袋内，4℃对水充分透析去盐3天(其间换液至少6次)，真空冷冻干燥。用12％SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，对纯化的血清白蛋白进行纯度鉴定。
2.东方田鼠血清白蛋白氨基端测序。
用Edman降解法对东方田鼠血清白蛋白进行氨基端序列测定，得到氨基端序列DAHKSEIAHR，结合生物信息学分析技术，确认得到的蛋白质为血清白蛋白。
3.东方田鼠血清白蛋白基因克隆与分析。
根据小白鼠血清白蛋白基因的序列，设计如下引物ALBUMIN1 5’-ACCGGAATTCTAGCCTCTGGCAAAATGA-3’ALBUMIN2 5’-CCGGAATTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTT-3’在乙醚麻醉下，处死东方田鼠，取东方田鼠肝脏，提取总RNA，使用引物ALBUMIN1和ALBUMIN2，利用聚合酶链式反应(PCR)技术，对该基因进行体外扩增。将扩增的白蛋白基因片段进行DNA序列测定和生物信息学分析。得到东方田鼠血清白蛋白基因的序列。根据东方田鼠血清白蛋白基因序列，推导其编码产物为608个氨基酸残基的多肽链。东方田鼠血清白蛋白基因在翻译后的蛋白质加工过程中，信号肽序列被剪切掉，形成成熟的血清白蛋白。
4.体外杀日本血吸虫童虫试验。
将纯化的东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫一起培养，在光学显微镜下每24小时计数一次，连续计数96小时。以东方田鼠血清作为阳性对照，牛血清白蛋白作为阴性对照。分别计算活血吸虫童虫数与死血吸虫童虫数。
5.对感染血吸虫的小白鼠的治疗作用。
将小白鼠先感染日本血吸虫尾蚴，再经腹腔、静脉或肌肉注射，使东方田鼠血清白蛋白进入小白鼠体内，以牛血清白蛋白作为阴性对照。41天后，处死小白鼠，计算小白鼠体内血吸虫成虫数、每克肝组织的虫卵数，计算减虫率和减卵率。
6.东方田鼠血清白蛋白真核表达产物的制备及应用。
真核表达载体用限制性核酸内切酶消化，将东方田鼠血清白蛋白基因插入真核表达载体，转化大肠杆菌，从大肠杆菌中提取重组真核表达载体。用重组真核表达载体转染真核细胞(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞等)，利用真核表达系统，在真核细胞中表达和生产东方田鼠血清白蛋白，并且分泌到细胞培养液中，收集含有白蛋白的细胞培养液。
含有东方田鼠血清白蛋白的细胞培养液用缓冲液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀释，经10000转/每分钟，离心去除不溶性物质后，上样于蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析柱顶部。层析柱用缓冲液I洗脱，以去除未结合蛋白质。随后用缓冲液II(0.05M KH2PO4，1.5M KCl，pH7.0)对血清白蛋白进行洗脱，收集洗脱液。透析袋(透析分子量8000-14000 kDa)用缓冲液I透析平衡24小时(其间换液至少3次)。将洗脱液置于透析袋内，4℃对水充分透析去盐3天(其间换液至少6次)，真空冷冻干燥。用12％ SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，对纯化的血清白蛋白进行纯度鉴定。将纯化的血清白蛋白与兔血清脱尾的血吸虫童虫一起培养，在光学显微镜下连续计数96小时，以东方田鼠血清作为阳性对照，观察活日本血吸虫童虫数量。
7.含东方田鼠血清白蛋白基因重组真核表达载体的直接注射。
真核表达载体用限制性核酸内切酶消化，将东方田鼠血清白蛋白基因插入真核表达载体，转化大肠杆菌，提取重组真核表达载体。经腹腔、静脉或肌肉注射，使血清白蛋白基因进入小白鼠体内，再感染日本血吸虫尾蚴，41天后，处死小白鼠，数小白鼠体内血吸虫成虫数、每克肝组织的虫卵数，计算减虫率和减卵率。
8.用病毒载体将东方田鼠血清白蛋白基因导入动物体内。
逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒载体用限制性核酸内切酶消化，将东方田鼠血清白蛋白基因插入逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒载体，经腹腔、静脉或肌肉注射，使血清白蛋白基因进入小白鼠体内，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。在感染日本血吸虫尾蚴前后，给予病毒介导的血清白蛋白基因，41天后，处死小白鼠，数小白鼠体内血吸虫成虫数、每克肝组织的虫卵数，计算减虫率和减卵率。
9.东方田鼠血清白蛋白原核表达产物的制备及应用。
原核表达载体用限制性核酸内切酶消化，将东方田鼠血清白蛋白基因插入原核表达载体，转化大肠杆菌。经过诱导后，在大肠杆菌中表达东方田鼠血清白蛋白。分离纯化大肠杆菌中的东方田鼠血清白蛋白。在感染日本血吸虫尾蚴前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
10.使用蛋白质工程技术，改变东方田鼠血清白蛋白基因的核苷酸序列，导致其氨基酸序列结构改变，产生东方田鼠血清白蛋白突变体。使用东方田鼠血清白蛋白突变体，在感染日本血吸虫尾蚴前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
11.将东方田鼠血清白蛋白突变体基因插入真核表达载体，在感染日本血吸虫尾蚴前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，将血清白蛋白基因突变体导入体内，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
12.将东方田鼠血清白蛋白突变体基因插入病毒(逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等)载体，在感染日本血吸虫前后，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等方式给药，将血清白蛋白基因导入体内，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
13.将东方田鼠血清白蛋白突变体基因序列插入真核表达载体，利用真核表达系统，在真核细胞(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)中表达和生产东方田鼠指名亚种血清白蛋白突变体，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
14.将东方田鼠血清白蛋白突变体基因序列插入原核表达载体，利用原核表达系统，在原核细胞(包括大肠杆菌和其它细菌)中表达和生产东方田鼠指名亚种血清白蛋白突变体，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
15.将东方田鼠血清白蛋白基因和东方田鼠血清白蛋白基因突变体序列插入各种真核表达载体，包括逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体等病毒载体，通过基因导入技术，建立转基因动物(包括水牛和其它家畜)，使这些动物对血吸虫产生永久抗性，用于阻断血吸虫病的传播和蔓延。
权利要求
1.东方田鼠血清白蛋白系利用亲和层析法、聚丙烯酰氨凝胶电泳、透析、冷冻干燥，从东方田鼠长江亚种和宁夏指名亚种血清中分离得到。东方田鼠白蛋白对在体外培养的日本血吸虫童虫有明显的杀灭作用，对在体内接种血吸虫尾蚴的小白鼠有明显的预防和治疗作用。将成年东方田鼠用乙醚麻醉，眼框取血。血液收集于试管中，冰箱4℃过夜，使血液凝固。血液凝固后，3000转/每分钟，离心5分钟，收集血清。东方田鼠血清用缓冲液I(0.05M KH2PO4，pH7.0)按1∶1稀释，经10000rpm离心去除不溶性物质后，上样于蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析柱顶部。层析柱用缓冲液I洗脱，以去除未结合蛋白质。随后用缓冲液II(0.05M KH2PO4，1.5MKCl，pH7.0)对血清白蛋白进行洗脱，收集洗脱液。透析袋(透析分子量8000～14000kDa)用缓冲液I透析平衡24小时(其间换液至少3次)。将含有血清白蛋白的洗脱液置于透析袋内，4℃对水充分透析去盐3天(其间换液至少6次)，真空冷冻干燥。用12％SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，对纯化的白蛋白进行纯度鉴定。
2.用Edman降解法对东方田鼠指名亚种(来自宁夏)和长江亚种血清白蛋白进行氨基端序列测定，并结合生物信息学分析技术，得到白蛋白的氨基酸序列。东方田鼠指名亚种血清白蛋白氨基酸序列为DAHKSEIAHRYNDLGEKYFKGLVLITFAQHLQKCPYEEHIKLVNEVTDFAKACAADESAENCDKSLHTLFGDKLCAIPNLGDNYAEMAECCAKQEPERNQCFLKHKDDKPSLPPFVRPEAEVMCTSFQENPASFMGHYLHAVARRHPYFYAPELLYYAEKQSAIMTECCAEADKAACLGPKLDALKEKALLSSVKQRLKCSSLEKFGERAFKAWAVARMSQKFPKADFAEITKLATDLTKVTQECCHGDLLECVDDRLELAKYMCDNQATISSKLHTCCDKPVLQKAHCLAEVDHDEMPADLTPLADDFVEDKDVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYARRHPDYSVALLLRLAKKYEATLEKCCAEADPHACYGKVFDEFQPLVEEPKNLVKANCELFEKLGEYGFQNALLVRYTQKAPQVSTPTLVEVSRNLGKVGTKCCALPEADRLPCVEDYLSAILNHLCVLHEKTPVSEQVTKCCTGSVVERRPCFSALPVDEHYVPKEFKAESFTFHADICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATGDQLKTVMGEFSAFLEKCCKADDKEACFSEEGPKLVATSQAALA东方田鼠长江亚种血清白蛋白氨基酸序列为DAHKSEIAHRYNDLGEKYFKGLVLITFAQHLQKCPYEEHIKLVNEVTDFAKACAADESAENCDKSLHTLFGDKLCAIPNLGDNYAEMAECCAKQEPERNQCFLKHKDDKPNLPPFVRPEAEVMCTSFQENPASFMGHYLHAVARRHPYFYAPELLYYAEKQSAIMTECCAEADKAACLGPKLDALKEKALLSSVKQRLKCSSLEKFGERAFKAWAVARMSQKFPKADFAEITKLATDLTKVTQECCHGDLLECADDRLELAKYMCDNQATISSKLHTCCDKPVLQKAHCLAEVDHDEMPADLTPLADDFVEDKDVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYARRHPDYSVALLLRLAKKYEATLEKCCAEADPHACYGKVFDEFQPLVEEPKNLVKANCELFEKLGEYGFQNALLVRYTQKAPQVSTPTLVEVSRNLGKVGTKCCALPEADRLPCVEDYLSAILNHLCVLHEKTPVSEQVTKCCTGSVVERRPCFSALPVDEHYVPKEFKAESFTFHADICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATGDQLKTVMGEFSAFLEKCCKADDKEACFSEEGPKLVATSQAALA
3.根据小白鼠白蛋白基因的序列，设计如下引物ALBUMIN1 5′-ACCGGAATTCTAGCCTCTGGCAAAATGA-3′ALBUMIN2 5′-CCGGAATTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′在乙醚麻醉下，处死动物，取东方田鼠肝脏，提取总RNA，使用引物ALBUMIN1和ALBUMIN2，利用聚合酶链式反应(PCR)技术，对东方田鼠白蛋白基因进行体外扩增。将扩增的基因片段进行DNA序列测定和生物信息学分析，得到东方田鼠白蛋白基因的序列。东方田鼠指名亚种血清白蛋白基因的核苷酸序列为TAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACTTTCCTCCTCCTTCTCTTTGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGCTTGTTTCGCCGAGATGCACACAAGAGTGAGATCGCTCATCGGTACAATGATTTGGGAGAAAAATATTTCAAAGGCCTAGTCTTGATCACCTTCGCCCAGCATCTCCAGAAATGCCCGTATGAAGAACACATAAAATTAGTGAATGAGGTAACCGACTTTGCAAAGGCATGTGCTGCTGACGAGTCTGCTGAAAACTGTGACAAGTCACTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGCTTTGTGCCATCCCAAATCTTGGTGATAACTATGCTGAGATGGCTGAGTGCTGCGCCAAACAAGAACCTGAGAGAAACCAATGTTTCCTGAAACACAAGGATGACAAGCCCAGCCTGCCCCCCTTTGTGAGGCCAGAGGCTGAGGTCATGTGCACCTCCTTCCAGGAAAATCCTGCTTCATTTATGGGACACTATCTGCACGCAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCTGAGCTCCTTTACTATGCTGAGAAGCAAAGTGCCATCATGACCGAGTGCTGTGCCGAAGCTGACAAAGCCGCCTGCCTGGGACCAAAGCTTGATGCTCTGAAGGAGAAAGCGCTGCTTTCCTCTGTCAAGCAGAGACTGAAGTGCTCCAGCCTGGAGAAATTTGGAGAGAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTATGAGCCAGAAATTCCCCAAAGCTGACTTCGCAGAAATTACCAAACTGGCAACAGACCTCACCAAAGTCACCCAGGAGTGCTGCCATGGCGACCTGCTTGAGTGCGTAGACGACAGGTTGGAACTCGCCAAGTACATGTGTGATAACCAAGCAACCATCTCTAGCAAACTGCACACTTGCTGTGACAAACCCGTGCTGCAGAAAGCCCATTGCCTTGCTGAGGTGGACCATGATGAGATGCCTGCTGATCTGACCCCACTGGCTGATGATTTTGTTGAGGATAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCGGAAGCCAAAGACGTCTTCCTGGGCACGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCACCCTGACTACTCTGTGGCCTTGCTGCTGAGGCTCGCTAAGAAATACGAAGCCACCTTGGAAAAGTGCTGTGCTGAAGCTGACCCTCATGCCTGCTACGGCAAAGTGTTTGATGAATTCCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTAGTCAAAGCTAACTGTGAACTTTTTGAGAAGCTTGGAGAGTATGGATTCCAAAATGCGCTCCTAGTGCGTTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACTCCAACTCTCGTCGAAGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCACCAAGTGCTGTGCGCTCCCTGAAGCAGACAGACTGCCATGCGTGGAAGACTATCTCTCTGCCATCCTCAACCATTTGTGTGTGCTGCACGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCAGGTCACCAAGTGCTGTACTGGCTCCGTGGTGGAAAGGCGACCTTGCTTCTCTGCTCTGCCAGTTGATGAACATTATGTCCCCAAAGAATTTAAAGCCGAATCCTTCACCTTCCATGCCGACATCTGCACACTTCCAGACAAGGAGAAGCAGATAAAGAAACAAACCGCCCTTGCTGAGCTCGTGAAACACAAACCCAAGGCCACAGGTGACCAGTTGAAGACCGTGATGGGCGAGTTCTCAGCTTTCTTGGAAAAGTGCTGCAAGGCTGACGACAAGGAGGCCTGCTTCTCTGAAGAGGGTCCAAAACTTGTTGCTACGAGCCAAGCTGCCTTAGCCTAAATACATCACAAGCATCTCAGTTTACCCTGAGAAAAAGAGAGACCTGAAGACTCATCTTTTGTGTTGGTGTAAAATCAACACCCTAAGGAACAAAAATTTCTTTAAACATTTAACTTCTTTTCTCTGTATTGCAATTAATAAAAAATGAAAAGAATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAA东方田鼠长江亚种血清白蛋白基因的核苷酸序列为TAGCCTCTGGCAAAATGAAGTGGGTAACTTTCCTCCTCCTTCTCTTTGTCTCCGGCTCTGCTTTTTCCAGGGGCTTGTTTCGCCGAGATGCACACAAGAGTGAGATCGCTCATCGGTACAATGATTTGGGAGAAAAATATTTCAAAGGCCTAGTCTTGATCACCTTCGCCCAGCATCTCCAGAAATGCCCGTATGAAGAACACATAAAATTAGTGAATGAGGTAACCGACTTTGCAAAGGCATGTGCTGCTGACGAGTCTGCTGAAAACTGTGACAAGTCACTTCACACTCTTTTTGGAGATAAGCTTTGTGCCATCCCAAATCTTGGTGATAACTATGCTGAGATGGCTGAGTGCTGCGCCAAACAAGAACCTGAGAGAAACCAATGTTTCCTGAAACACAAGGATGACAAGCCCAATCTGCCCCCCTTTGTGAGGCCAGAGGCTGAGGTCATGTGCACCTCCTTCCAGGAAAATCCTGCTTCATTTATGGGACACTATCTGCACGCAGTTGCCAGAAGACATCCTTATTTCTATGCCCCTGAGCTCCTTTACTATGCTGAGAAGCAAAGTGCCATCATGACCGAGTGCTGTGCCGAAGCTGACAAAGCCGCCTGCCTGGGACCAAAGCTTGATGCTCTGAAGGAGAAAGCGCTGCTTTCCTCTGTCAAGCAGAGACTGAAGTGCTCCAGCCTGGAGAAATTTGGAGAGAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGTATGAGCCAGAAATTCCCCAAAGCTGACTTCGCAGAAATTACCAAACTGGCAACAGACCTCACCAAAGTCACCCAGGAGTGCTGCCATGGCGACCTGCTTGAGTGCGCAGACGACAGGTTGGAACTCGCCAAGTACATGTGTGATAACCAAGCAACCATCTCTAGCAAACTGCACACTTGCTGTGACAAACCCGTGCTGCAGAAAGCCCATTGCCTTGCTGAGGTGGACCATGATGAGATGCCTGCTGATCTGACCCCACTGGCTGATGATTTTGTTGAGGATAAGGACGTGTGCAAGAACTATGCGGAAGCCAAAGACGTCTTCCTGGGCACGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCACCCTGACTACTCTGTGGCCTTGCTGCTGAGGCTCGCTAAGAAATACGAAGCCACCCTGGAAAAGTGCTGTGCTGAAGCTGACCCTCATGCCTGCTACGGCAAAGTGTTTGATGAATTCCAGCCTCTTGTAGAAGAGCCTAAGAACTTAGTCAAAGCTAACTGTGAACTTTTTGAGAAGCTTGGAGAGTATGGATTCCAAAATGCGCTCCTAGTGCGTTACACCCAGAAAGCACCTCAGGTGTCAACTCCAACTCTCGTCGAAGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCACCAAGTGCTGTGCGCTCCCTGAAGCAGACAGACTGCCATGCGTGGAAGACTATCTCTCTGCCATCCTCAACCATTTGTGTGTGCTGCACGAGAAGACCCCAGTGAGTGAGCAGGTCACCAAGTGCTGTACTGGCTCCGTGGTGGAAAGGCGACCTTGCTTCTCTGCTCTGCCAGTTGATGAACATTATGTCCCCAAAGAATTTAAAGCCGAATCCTTCACCTTCCATGCCGACATCTGCACACTTCCAGACAAGGAGAAGCAGATAAAGAAACAAACCGCCCTTGCTGAGCTCGTGAAACACAAACCCAAGGCCACAGGTGACCAGTTGAAGACCGTGATGGGCGAGTTCTCAGCTTTCTTGGAAAAGTGCTGCAAGGCTGACGACAAGGAGGCCTGCTTCTCTGAAGAGGGTCCAAAACTTGTTGCTACAAGCCAAGCTGCCTTAGCCTAAATACATCACAAGCATCTCAGTTTACCCTGAGAAGAAGAGAGACCTGAAGACTCATCTTTTGTGTTGGTGTAAAATCAACACCCTAAGGAACAAAAATTTCTTTAAACATTTAACTTCTTTTCTCTGTATTGCAATTAATAAAAAATGAAAAGAATCTAAAAAAAAAAAAAAAAA根据东方田鼠血清白蛋白基因序列，推导其编码产物为608个氨基酸的白蛋白前体。东方田鼠指名亚种血清白蛋白前体氨基酸序列为MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGLFRRDAHKSEIAHRYNDLGEKYFKGLVLITFAQHLQKCPYEEHIKLVNEVTDFAKACAADESAENCDKSLHTLFGDKLCAIPNLGDNYAEMAECCAKQEPERNQCFLKHKDDKPSLPPFVRPEAEVMCTSFQENPASFMGHYLHAVARRHPYFYAPELLYYAEKQSAIMTECCAEADKAACLGPKLDALKEKALLSSVKQRLKCSSLEKFGERAFKAWAVARMSQKFPKADFAEITKLATDLTKVTQECCHGDLLECVDDRLELAKYMCDNQATISSKLHTCCDKPVLQKAHCLAEVDHDEMPADLTPLADDFVEDKDVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYARRHPDYSVALLLRLAKKYEATLEKCCAEADPHACYGKVFDEFQPLVEEPKNLVKANCELFEKLGEYGFQNALLVRYTQKAPQVSTPTLVEVSRNLGKVGTKCCALPEADRLPCVEDYLSAILNHLCVLHEKTPVSEQVTKCCTGSVVERRPCFSALPVDEHYVPKEFKAESFTFHADICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATGDQLKTVMGEFSAFLEKCCKADDKEACFSEEGPKLVATSQAALA东方田鼠长江亚种血清白蛋白前体氨基酸序列为MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGLFRRDAHKSEIAHRYNDLGEKYFKGLVLITFAQHLQKCPYEEHIKLVNEVTDFAKACAADESAENCDKSLHTLFGDKLCAIPNLGDNYAEMAECCAKQEPERNQCFLKHKDDKPNLPPFVRPEAEVMCTSFQENPASFMGHYLHAVARRHPYFYAPELLYYAEKQSAIMTECCAEADKAACLGPKLDALKEKALLSSVKQRLKCSSLEKFGERAFKAWAVARMSQKFPKADFAEITKLATDLTKVTQECCHGDLLECADDRLELAKYMCDNQATISSKLHTCCDKPVLQKAHCLAEVDHDEMPADLTPLADDFVEDKDVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYARRHPDYSVALLLRLAKKYEATLEKCCAEADPHACYGKVFDEFQPLVEEPKNLVKANCELFEKLGEYGFQNALLVRYTQKAPQVSTPTLVEVSRNLGKVGTKCCALPEADRLPCVEDYLSAILNHLCVLHEKTPVSEQVTKCCTGSVVERRPCFSALPVDEHYVPKEFKAESFTFHADICTLPDKEKQIKKQTALAELVKHKPKATGDQLKTVMGEFSAFLEKCCKADDKEACFSEEGPKLVATSQAALA东方田鼠血清白蛋白基因在翻译后的蛋白质加工过程中信号肽序列被剪切掉。白蛋白信号肽序列如下MKWVTFLLLLFVSGSAFSRGLFRR
4.使用基因工程和蛋白质工程技术，改变东方田鼠血清白蛋白和白蛋白基因的一级结构，或者通过化学修饰而改变该白蛋白中氨基酸的化学性质，而获得白蛋白和白蛋白基因的突变体。
5.通过经静脉、腹腔或肌肉注射，利用东方田鼠血清白蛋白及其突变体对人、畜血吸虫感染和血吸虫病进行预防和治疗。
6.上述东方田鼠血清白蛋白基因及其突变体的DNA序列插入逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体等病毒载体，并包装成有感染能力的病毒颗粒，纯化后，经静脉、腹腔或肌肉注射，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
7.上述东方田鼠血清白蛋白基因及其突变体的DNA序列插入其它真核表达载体，经静脉、腹腔或肌肉直接注射，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
8.上述东方田鼠血清白蛋白基因及其突变体的DNA序列插入真核表达载体，利用真核表达系统，在真核细胞(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞等)中表达和生产抗性蛋白质，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
9.上述东方田鼠血清白蛋白基因及其突变体的DNA序列插入原核表达载体，利用原核表达系统，在原核细胞(包括大肠杆菌和其它细菌)中表达和生产抗性蛋白质，用于人、畜血吸虫感染和血吸虫病的预防和治疗。
10.上述东方田鼠血清白蛋白基因及其突变体的DNA序列插入各种真核表达载体，包括逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体等病毒载体，通过基因导入技术，建立转基因动物(包括水牛和其它家畜)，使这些动物对血吸虫产生永久抗性，用于阻断血吸虫病的传播和蔓延。
全文摘要
本发明公开了一种杀灭日本血吸虫童虫及预防、治疗日本血吸虫感染的蛋白质序列和相应基因序列及其用途。该蛋白质系利用亲和层析法、聚丙烯酰氨凝胶电泳、透析、冷冻干燥和蛋白质氨基端测序，从东方田鼠血清中分离得到血清白蛋白。利用聚合酶链式反应技术，获得东方田鼠血清白蛋白基因序列。将该基因以及修饰后的突变体插入真核表达载体，导入动物体内，可用于日本血吸虫感染的基因预防和治疗。可利用基因工程技术，生产东方田鼠血清白蛋白及其突变体，用于血吸虫病的预防和治疗。通过建立转基因动物，使疫区动物对日本血吸虫产生永久性抗性，阻断日本血吸虫的传播和血吸虫病的蔓延。
文档编号C12N15/12GK1800215SQ20051003232
公开日2006年7月12日 申请日期2005年11月1日 优先权日2005年11月1日
发明者胡维新, 邬国军, 秦志强 申请人:中南大学