专利名称：一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测巴氏消毒奶的方法，具体是一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法。
背景技术：
巴氏消毒奶是指鲜奶包装后通过巴氏消毒工艺，采用72℃～75℃加热15～20秒，将细菌数量控制在国家规定的每毫升3万以内的奶产品。由于其口感风味与鲜奶相似，营养成分消耗少，已逐步成为倍受青睐的日常消费品。其最大优势是保持液体奶的新鲜口感。目前巴氏消毒奶包装在全球富奶区占有很大的市场份额，由于巴氏消毒奶中仍含有一定数量的细菌，其保鲜期非常短，在4℃以下的环境中只能保鲜一周左右，因此对仓储、运输、销售各环节的冷藏条件要求非常严格。当前判断巴氏消毒奶货架期一般是以巴氏消毒奶产品标签显示的货架期来确定，而生产厂家由于货架期检测耗时较长，而巴氏消毒奶保鲜期很短，因此所标示的货架期常借助以往经验数据类推判定。通过实验室检测可进行货架期的精确判定，已知用于检测巴氏消毒奶货架期的方法有Moseley质量保持测试法、预培养(PI)法、正向荧光过滤技术法(DEFT)以及阻抗法等。Moseley质量保持测试法需要7℃、5d的预培养，最终耗时7d才能预测货架期，而PI方法需耗时5d，DEFT法技术要求高，常规应用较少。
研究表明，采用阻抗法可较快获得结果，阻抗法是通过微生物生长代谢将培养基中蛋白质和碳水化合物转变为氨基酸及乳酸等，引起培养基电阻抗微弱变化，通过阻抗测定仪器记录阻抗测定时间(Impedance Detect Time，DT)。通过建立DT值与实际保质期之间的标准曲线及预测方程，进行包装巴氏消毒奶保质期测定。以风味评价法判定液体牛奶货架期为标准，采用阻抗法的相关系数r＝0.88～0.92，远高于采用Moseley法的相关系数r＝0.77，显示较好的预测准确性。但Peter K，Ruth F E.Prediction of shelf-life of pasteurized milk and other fluid dairy productsin 48 hours.J.Dairy Sci.，1987，701544~1550报道的传统阻抗法由于主要针对嗜冷菌，采用了18℃、18h的预培养过程，耗时48h才能预测货架期。
由于阻抗方法的检测灵敏度为10cfu/mL，而刚生产出来的巴氏消毒奶中细菌含量常低于此浓度，造成阻抗法难以直接进行测定。而且，由于传统阻抗法测定需要建立细菌数与DT之间的标准曲线，再进行货架期的换算测定，而标准曲线的建立一般需要有效数据100对以上、跨幅为4～5个数量级，通常耗时几个月甚至1～2年，难以适应快速检测的要求。
发明内容
本发明的目的在于针对已有技术存在的缺点，提供一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法。本发明的方法具有快速、准确、简便等优点。
为达到上述发明目的，本发明采取了如下技术方案本发明提供了一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其包括下列步骤(1)巴氏消毒奶样品预培养；(2)建立巴氏消毒奶货架期快速检测标准曲线及预测方程；(3)巴氏消毒奶阻抗测定；(4)检测巴氏消毒奶货架期。
对不同来源、不同巴氏消毒及加工工艺的包装巴氏消毒奶在进行货架期检验前，应首先建立实际货架期与DT值之间的标准曲线及预测方程。
将同一批次包装巴氏消毒奶自生产之日起贮存于4℃直至包装奶变质，以备检测之用。
自生产之日至样品变质前每d(天，以下同)任取3个检样按照GB4789.2进行菌落总数测定后，剩余奶样按照GB5408.1进行感官检验。出现下列情况之一，可判断为包装巴氏消毒奶变质，不适合饮用细菌总数＞30 000/mL者；色泽及组织形态、滋味和气味不符合GB5408.1者；自生产之日至样品变质前每d再任取3个检样，经预培养处理后，无菌操作取样进行测定DT。预培养的温度为4～37℃，优选为25～37℃，更优选为35～37℃。预培养时间为0～15h，优选为2～8h，更优选为4～6h。
以阻抗测定仪器记录的整个货架期周期内DT值(单位h)为横坐标，以货架期(单位d)为纵坐标，得到巴氏消毒奶货架期与DT值的标准曲线。巴氏消毒奶阻抗测定加样量为100～400μL，优选为200～400μL，更优选为300～400μL。巴氏消毒奶阻抗测定反应温度为18～37℃，优选为25～37℃，更优选为30～37℃。
根据标准曲线采用最小二乘法回归获得货架期预测方程，要求预测方程相关系数的绝对值大于0.85，否则应重新优化预培养、加样量及反应仓培养温度等参数，直至获得的预测方程符合要求。
标准曲线及预测方程建立后，每3～6个月需按上述要求重校1次。
在建立标准曲线及预测方程后，同类巴氏消毒奶检样在相同条件下进行阻抗测定，获得DT值。
将DT值代入预测方程，计算出保质期。保质期计算值≤0，结果表示为保质期结束或产品变质，取样当时的巴氏消毒奶不适合人类饮用；保质期＞0，表明取样当时的巴氏消毒奶仍可饮用，剩余保质期为实际计算值。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明主要针对巴氏消毒奶中的嗜温菌及嗜热菌，采用不同预培养处理前增菌、增大加样量保证满足阻抗法检测灵敏度的要求，同时提高阻抗检测反应温度的方案，使阻抗检测结果放大，进一步缩短整个货架期检测周期。
本发明克服了传统阻抗法难以直接测定细菌数低的巴氏消毒奶货架期的问题，使刚生产出来的盒装巴氏消毒奶同样能够进行货架期的检测。
本发明直接建立货架期与DT时间之间的标准曲线，大幅度地压缩了建立标准曲线所需要的有效数据，从以往的100对以上，跨幅4～5个数量级，减少到依据整个货架期长短仅需要10多对有效数据，预测方程式的建立需时仅需10d左右，整个预测周期控制在20h以内，方法检测精确度为±1d，从而实现了对盒装巴氏消毒奶货架期的快速预测。
图1为实施例1所测得的香满楼巴氏消毒牛奶货架期与DT之间的关系图；图2为实施例2所测得的风行巴氏消毒牛奶货架期与DT之间的关系图。
具体实施例方式
以下结合说明书附图来对本发明作进一步说明，但本发明所要求保护的范围并不局限于实施例所描述的范围。
实施例1香满楼巴氏消毒牛奶货架期预测自生产之日起，将样品于4℃保藏，每d取1份样品进行检测。其中一半样品进行货架期测定，另一半样品在阻抗测定前进行如下预培养处理不预培养；30℃、6h预培养；37℃、6h预培养后，分别取样100～400μL上阻抗检测仪器进行阻抗测定，结果如图1所示。
从图1A可见，采用100～400μL加样量，不预培养的牛奶样品上阻抗检测仪器有部分DT值未能出现，而且得到的DT时间值较大且变化无规律，难以用来进行货架期的预测。
同不预培养相比，采用30℃、6h预培养测得的DT时间变短，在100～400μL加样量范围内，货架期与DT时间呈现一定的相关关系，即货架期越长，DT时间越长，但100μL及200μL加样量条件下仍有部分DT值未能出现，因此这两种加样量方式也难以用于货架期的预测。进一步增加奶样加样量，在300μL及400μL加样量条件下可显示出全部DT值(结果见图1B)。图1C则显示了在37℃、6h预培养后测得的DT值与货架期之间的关系，在此条件下测得的DT时间大为缩短，在100～400μL加样量范围内，能够显示出全部DT值。
对货架期(d)与相应的DT时间(h)进行回归分析，得到如下一组回归方程式，如表1所示。
表1香满楼巴氏消毒牛奶货架期与DT之间的回归方程加样量预培养 回归方程r2(μL)30℃，6h300Shelf life(d)＝-0.45(DT)2+10.39DT-47.90 0.94400Shelf life(d)＝-0.62(DT)2+13.18DT-56.62 0.8637℃，6h100Shelf life(d)＝0.28(DT)2+13.5DT-15.32 0.92200Shelf life(d)＝-0.45(DT)2+9.85DT-37.79 0.97300Shelf life(d)＝-0.97(DT)2+16.69DT-58.18 0.91400Shelf life(d)＝-0.30(DT)2+8.06DT-30.95 0.93Firstenberg-Eden R，Eden G.Impedance Microbiology.John Wiley & SonsInc.，New York，1984，7认为，当回归系数在0.85以上即r2≥0.7225可视为相关性良好，可应用于食品检测。因此，采用30℃、6h预培养，加样量为300μL及400μL得到的回归方程式可应用于香满楼牛奶的货架期预测，其临界值(Cutoff time)分别为6.36h和5.98h(DT值小于临界值则可视为该牛奶样品已经变质)，包括预培养6h，整个货架期预测时间可控制在20h以内，同传统阻抗法需要48h相比，大幅度缩短了预测周期。
另外，采用37℃、6h预培养、加样量100～400μL得到的回归方程式不仅可用于香满楼巴氏消毒牛奶货架期预测，而且可进一步缩短预测周期，整个预测时间控制在14h以内，对变质样品或货架期即将结束的牛奶样品可在12h左右作出判断。经计算，100～400μL加样量对应临界值(Cutoff time)分别为5.37h、4.96h、4.86h及4.64h，同采用30℃、6h预培养相比，采用37℃、6h预培养后运用阻抗法预测奶样的货架期，可进一步缩短预测周期，因而具有更好的应用价值。
香满楼巴氏消毒牛奶货架期预测验证试验将4批货架期未知的香满楼牛奶各自均分2份，取1份进行37℃、6h预培养和30℃、6h预培养后，再各取100～400μL加样上阻抗检测仪器进行阻抗测定预测货架期；剩余1份按Bishop J R.A simple shelf-life estimation method as anintegral part of a total dairy quality assurance program.Dairy，Food andEnviron.Sanit，1989，9698-701方法进行货架期测定。结果如表2所示。
表2香满楼巴氏消毒牛奶货架期预测验证试验加样量批次预培养 DT(h)估测货架期(d)实测货架期(d)(μL)30℃、6h300 9.910.86400 8.811.3537℃、6h100 7.510.56111.0200 7.611.08300 7.111.42400 7.111.1530℃、6h300 7.44.34400 6.73.8537℃、6h100 6.34.3024.0200 5.84.20300 5.54.27400 5.33.3430℃、6h300 7.02.78400 6.42.3337℃、6h100 6.02.8633.0200 5.52.77300 5.33.02400 5.22.854 30℃、6h300 6.71.51 1.0400 6.10.71
37℃、6h1005.71.472005.21.263005.11.714004.80.83对每一处理方法的货架期预测结果与实际测量值进行卡平方(χ2)测验，结果见表3。
表3各种处理方法预测货架期与实测货架期的χ2分析表预培养加样量(μL) χ230℃、6h300 0.31400 0.2537℃、6h100 0.27200 0.10300 0.12400 0.15从表3可见，各种处理方法测验的χ2值均小于χ20.05，3(7.815)，表明各种处理方法得到的预测货架期与实测货架期在α＝0.05水平上相符合，因此得到的上述回归方程可以用来预测盒装香满楼巴氏消毒奶货架期。
实施例2风行巴氏消毒牛奶货架期预测将风行巴氏消毒牛奶样品进行3种预培养处理不预培养、30℃ 6h预培养、37℃ 6h预培养，每d取样100～400μL进行DT测定。结果如图2所示。
从图2A可知，采用100～400μL加样量，不预培养的牛奶样品上阻抗检测仪器得到的DT时间值较大且变化无规律，难以用来进行货架期的预测。估计是由于未经预培养的牛奶样品中含细菌数较少，特别是在牛奶潜在的货架期较长时，牛奶中的细菌数更少，在设定的24h试验时间内，会偶尔不出现DT检测时间。
同不预培养相比，采用30℃、6h预培养(图2B)测得的DT时间变短，在100～400μL加样量范围内，货架期与DT时间呈现一定的相关关系，即货架期越长，DT时间越长。对货架期(d)与DT时间(h)进行回归分析，得到一组回归方程式如表4所示。
表4 30℃、6h预培养不同加样量条件下货架期与DT值回归方程式加样量(μ回归方程式 r2L)100Shelf life(d)＝-8.09(DT)2+85.78DT-218.520.7946200Shel flife(d)＝2.16(DT)2-10.28DT+6.89 0.7549300Shel flife(d)＝3.26(DT)2-21.53DT+33.20 0.6068400Shel flife(d)＝12.50(DT)2-101DT+202.97 0.7000当回归系数在0.85以上即r2≥0.7225可直接应用于食品检测。因此，本实验中采用30℃、6h预培养，加样量为100μL及200μL得到的回归方程式可应用于风行牛奶的货架期预测，其临界值(Cutoff time)分别为4.3h和4.0h，包括预培养6h，整个货架期预测时间可控制在14h以内，大幅度缩短了预测周期。
图2C显示，采用37℃、6h预培养测得的DT时间大大缩短，在100～400μL加样量范围内，货架期与DT时间呈现更为密切的正相关关系。对货架期(d)与DT时间(h)进行回归分析，得到一组回归方程式如表5所示。
表5 37℃、6h预培养不同加样量条件下货架期与DT值回归方程式加样量(μL)回归方程式 R2100Shelf life(d)＝-1.29(DT)2+12.67DT-23.120.9573200Shelf life(d)＝-2.24(DT)2+19.61DT-35.220.9072300Shelf life(d)＝-1.12(DT)2+12.76DT-26.050.9658400Shelf life(d)＝-0.91(DT)2+10.65DT-21.900.9258从回归结果可知，采用37℃、6h预培养比采用30℃、6h预培养具有更明显的优势，首先是模拟曲线相关系数高，有助于提高货架期预测的准确性和可靠性；整个货架期预测时间控制在11h以内，对变质样品或货架期即将结束的牛奶样品可在9h左右作出判断，100~400μL加样量对应的DT临界期(Cutoff time)分别为2.4h、2.5h、2.7h及2.7h。
风行巴氏消毒牛奶货架期证实试验将4批货架期未知的风行巴氏消毒牛奶各自均分2份，1份进行相应的预培养后，再各取100～400μL加样上阻抗检测仪器进行阻抗测定预测货架期；剩余1份按Bishop J R.A simple shelf-life estimation method as an integral part of atotal dairy quality assurance program.Dairy，Food and Environ.Sanit，1989，9698-701方法进行货架期测定。证实试验结果如表6所示。
表6阻抗法预测风行巴氏消毒牛奶货架期的证实试验批次预培养 加样(μL) DT(h) 估测货架期(d)实测货架期(d)30℃、6h预培 100 4.86.83养 200 4.65.31100 3.76.1016.037℃、6h预培 200 3.56.34养 300 3.75.83400 4.06.1430℃、6h预培 100 4.53.66养 200 4.43.47100 2.92.7723.037℃、6h预培 200 2.92.81养 300 3.23.31400 3.22.8630℃、100预培100 4.30.75养 200 4.00.33100 2.4-0.143037℃、6h预培 200 2.5-0.19养 300 2.70.24400 2.70.224100 4.2-0.95-1
30℃、6h预培(货架期结束后1d)2003.9-0.34养1002.3-0.8037℃、6h预培2002.4-1.06养 3002.5-1.154002.5-0.96由于表中货架期有出现负数，因此对每一处理方法货架期预测结果与实际测量值进行配对方差分析，得到结果见表7。
表7各种处理方法预测货架期与实测货架期的方差分析表预培养加样量(μL)SS F值 P＞300μL23.88 0.620.5930℃、6h预培养400μL14.65 0.370.72100μL15.57 0.550.62200μL16.04 0.530.6337℃、6h预培养300μL12.64 0.440.68400μL13.83 0.470.66从表7可见，上述6种处理方法预测货架期与实测货架期之间差异不显著(P＞0.05)。综合验证试验及其方差分析，确认在30℃、6h预培养下加样量300、400μL及37℃、6h预培养下加样量100～400μL得到的回归方程式均可用于盒装风行巴氏奶货架期预测。
实施例3燕塘巴氏消毒奶货架期检测将燕塘巴氏消毒奶样品分别经过30℃、6h或37℃、6h预培养，取样100~400μL进行阻抗检测，阻抗检测反应温度为37℃，按实施例1的方法快速检测货架期，并与实际货架期进行比较，结果见表8。
表8燕塘巴氏消毒奶货架期的检测批次预培养加样量/μL DT/h估测货架期/d实测货架期/d
130℃、6h3006.81.942.04006.42.3337℃、6h1005.92.392005.31.773005.11.714005.12.35230℃、6h3007.96.106.04007.26.1437℃、6h1006.76.292006.25.983005.85.994005.96.16330℃、6h3008.78.438.04007.78.1137℃、6h1007.18.382006.78.003006.17.534006.37.92从上表可知，采用本发明方法可应用于燕塘巴氏消毒奶货架期的快速检测，全部检测周期可在11-15h内完成，回归方程计算的货架期检测结果误差为±1d。
以上用实例对本发明进行了描述。本领域的普通技术人员在上述的基础之上可以作出多种变动而不脱离本发明的精神。
权利要求
1.一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于包括下列步骤(1)巴氏消毒奶样品预培养；(2)建立巴氏消毒奶货架期快速检测标准曲线及预测方程；(3)巴氏消毒奶阻抗测定；(4)检测巴氏消毒奶货架期；其中，预培养的温度为4～37℃，预培养时间为0～15h；巴氏消毒奶阻抗测定加样量为100～400μL，巴氏消毒奶阻抗测定反应温度为18～37℃。
2.根据权利要求1所述的一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于预培养的温度为25～37℃。
3.根据权利要求2所述的一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于预培养的温度为35～37℃。
4.根据权利要求1所述的一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于预培养的时间为2～8h。
5.根据权利要求4所述的一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于预培养的时间为4～6h。
6.根据权利要求1所述的一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于巴氏消毒奶阻抗测定加样量为200～400μL。
7.根据权利要求6所述的一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于巴氏消毒奶阻抗测定加样量为300～400μL。
8.根据权利要求1所述的一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于巴氏消毒奶阻抗测定反应温度为25～37℃。
9.根据权利要求8所述的一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于巴氏消毒奶阻抗测定反应温度为30～37℃。
全文摘要
本发明公开了一种巴氏消毒奶货架期快速检测方法，其特征在于包括下列步骤1.巴氏消毒奶样品预培养；2.建立巴氏消毒奶货架期快速检测标准曲线及预测方程；3.巴氏消毒奶阳抗测定；4.检测巴氏消毒奶货架期。本发明采用不同预培养处理前增菌、增大加样量保证满足阻抗法检测灵敏度的要求，同时采取提高阻抗检测反应温度的方案，使阻抗检测结果放大，进一步缩短整个货架期检测周期，克服了传统阻抗法难以直接测定细菌数低的巴氏消毒奶货架期的问题，使刚生产出来的盒装巴氏消毒奶同样能够进行货架期的检测。本发明的方法具有快速、准确、简便等优点。
文档编号C12Q1/06GK1645121SQ20051003265
公开日2005年7月27日 申请日期2005年1月4日 优先权日2005年1月4日
发明者王菊芳, 李志勇 申请人:华南理工大学