一株高环多环芳烃降解菌及其应用的制作方法

专利名称：：一株高环多环芳烃降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于环境有机污染物生物处理
技术领域：
，具体涉及一株降解高环多环芳烃组分的真菌及其在污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。
背景技术：
：多环芳烃是一类憎水性有机污染物，低水溶性是造成这类化合物持久性的主要原因。由于这类化合物具有致癌、致畸和致突变的特性而倍关注。近几十年来，环境中的PAHs(多环芳烃)含量不断增加，美国EPA已经列出了16种PAHs作为优控物，因此，修复PAHs污染的水土环境己成为研究的热点。尽管PAHs能够通过化学氧化、光解和挥发等途径降解和转移，但是微生物降解是影响自然界中PAHs持久性的最关键因素。生物修复被认为是目前去除环境中有机物的最经济有效的方法，然而生物修复的成功应用局限于低环PAHs，这是因为高环PAHs水溶性更低，易于吸附于有机物质，从而降低了生物可利用性。关于高环多环芳烃的生物修复方面研究，大部分是一种菌株对单一PAH进行的，然而实际环境中多环芳烃的污染大都以混合形式出现，它们的相互作用使得混合多环芳烃的生物降解更为复杂。国内外关于菌株降解高环PAH的报道，主要是以苯并[a]芘作为研究对象，如OlivierPotin等人分离出一株半知类真菌Cte/aypon'MW^/zaem^emww，4天对液体培养基中的苯并[a]芘降解了18%(OlivierPotin,EtienneVeignie,CatherineRafin.Biodegradationofpolycyclicaromatichydrocarbons(PAHs)byC/(3cfo5por/画s;Aaeras77e/7wwmisolatedfromanagedPAHcontaminatedsoil,FEMSMicrobiologyEcology2004，51:71-78.);国内苏丹等人研究了当土壤中BaP的初始浓度为50mg/kg时，芽孢杆菌SB02、动胶杆菌SB09和黄杆菌SB10在42d内对BaP的降解率分别为33.04%、25.39%和22.02%(苏丹，李培军，王鑫等.3株细菌对土壤中芘和苯并芘的降解及其动力学.环境科学，2007，28(4):913-917.)。然而，关于其他高环PAH的报道很少，我们应该加大这方面的研究力度。'
发明内容本发明的目的是针对上述现有多种高环多环芳烃的修复技术存在的问题，提供一种能高效、快速降解高环多环芳烃物质的菌种。本发明的另一目的是提供上述菌种在污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。本发明所提供的高效降解菌F6来源于广州某油罐区石油污染地表层(020cm)土，经人工富集、筛分及纯化所得到，菌株命名为F6。该菌株具有以下分类学特征在察氏平板培养基的生长形态为菌落表面奶酪色，部分黄色，老后灰绿色，质地毡状，反面暗棕色；电子显微镜下观察该菌体的形态为菌丝发达有隔，子囊球形至亚球形，直径78um，含孢子八个，分生孢子梗自分生菌丝生出，5080x2.5um，小梗单独直接生于菌丝上，与菌丝间具一横隔，或呈双叉状生出，1535x2.53.0um，分生孢子椭圆形，2.54.5umxl.82.5um，生成很长纠结链状。此外，该菌株的18SrDNA序列与宛氏拟青霉(Paea7omycMv鎖'o报)的同源性达94.9%。结合以上分类学形态特征和18SrDNA序列的比对结果，该菌株命名为宛氏拟青霉(Azed/om_ycMv肌'WOF6。上述菌株于2008年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，编号为CCTCCNo:M208118。与现有技术相比，本发明菌株在纯培养条件下30天内对苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽和茚并[l，2，3-cd]芘五种高环多环芳烃混合体系中PAH(多环芳烃)的降解率为16.06%24.57%，单一体系中PAH的降解率为10.42%'33.25%。同时PAH单体与混合体系中PAH的降解率存在一定差异，苯并[k]荧蒽和苯并[b]荧蒽在单一体系中降解率增大，而其他则减小。利用这些特点，本发明菌株可用于降解单一高环多环芳烃污染物或高环多环芳烃混合物污染物，或者用于土壤生物修复，并为高环多环芳烃共代谢机理研究提供了一种新的种质资源。图1为菌株宛氏拟青霉(paecilomycesvariotii)F6对混合体系和单一体系中高环PAH的降解效果。图2为菌株宛氏拟青霉(paecilomycescariotii)对土壤介质中的高环PAH的降解效果。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。实施例l:高环多环芳烃降解菌宛氏拟青霉(尸fle"7omycMvan'加7)F6的筛选分离及其多环芳烃降解性能。新鲜土样10g放入250ml锥形烧瓶中，加入90ml灭菌的无菌水溶液，在往复震荡器上震荡30min，28°C(150r/min)。待固体颗粒稳定静置30mm后，取部分悬浮液进行稀释得到一系列悬浮液10"，10—2，10—3，l(T4，10—5，10—6，10—7，分别各取lml均匀地涂布在含高环PAHs的琼脂平板上(三个平行样)，28。C时培养。经过5-12天的生长，挑选特征不同(菌丝体)生长旺盛的单菌落，转接至无PAHs的MYEA培养基中。在固体培养基平板上反复划线分离获得纯菌种。纯化的菌种4"C斜面保存。真菌培养基(MYEA):麦芽膏提取物，0.2%;酵母膏提取物0.2%，pH7.0，以及补充0.02%氯霉素溶液。121°C高压蒸汽处理灭菌20min;高环多环芳烃混合培养基将苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、茚并[l，2，3-cd]芘丙酮溶液添加到MYEA培养基中，每种物质含量均为50mg丄"；高环多环芳烃单质培养基将苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、茚并[l，2，3-cd]芘丙酮溶液分别添加到MYEA培养基巾，PAH浓度均为50mg丄—1。经反复分离纯化得到的真菌进行高环多环芳烃混合降解实验，在菌种接种前，用5ml无菌水冲洗纯化菌的固体斜面，用接种环轻刮斜面，直至菌体完全洗脱下来。然后将此孢子悬液接种到含95mL5mg'ml-1的葡萄糖溶液的250mL锥形烧瓶内，摇床培养(150。m，28°C)36h,以诱导孢子萌发和菌丝体的生长。萌发的孢子最终浓度控制在大约1071/1。将10mL孢子悬浮液加到装有50mL髙环多环芳烃单质(混合)液体培养基的150ml三角瓶，28°C，150rpm下培养，另外一份高环PAHs培养基不接种真菌，作为非生物作用降解PAHs对照。每个处理进行3个平行样，均在无菌条件下操作。30天后取样分析培养液中的PAHs含量及生物量。实验结果见图1。由图l可以看出，PAH混合和单一体系中多环芳烃都有一定的降解并且存在一定差异，培养30d后的单一体系中各PAH的降解率大小顺序为苯并[k]荧蒽〉苯并[b]荧蒽〉茚射l，2，3-cd]芘〉苯并[a]芘〉苯并[a]蒽。在混合体系中苯并[k]荧蒽和苯并[b]荧蒽的降解率分别为21.21%和21.11%，而单一体系中的降解率分别为33.25%和26.44%,均有所上升；而单一体系对苯并[a]蒽、苯并[a]芘和茚并[l，2，3-cd]芘的降解率却下降了。本实施例说明分离所得到的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)F6可以对五种单一或混合的高环PAH具有一定的降解能力。实施例2:各生长因子对高环多环芳烃降解菌降解效果的影响1、选取pH值，温度，污染物浓度，C:N作为影响因子(葡萄糖为C源，(NH》2S04为N源)，设计成L9(34)正交实验，结果如表1所示。2、向一系列装有50mL不同碳氮比的无机盐培养基的锥形瓶中接入数量相同的优势真菌孢子(培养基中最终孢子数约为107个七—"，设3个重复；振荡培养(150rpm，28°C)57天，测定ZPAHs的降解率，结果如表2所示。上述无机盐培养基的配置方法为无机盐基础培养基(g'L-1):MgS04-7H2O，0.2;CaCl2.2H2O，0.01;FeSO4.7H20，0.005;KH2PO4，0.4;Na2HPO4'12H2O，0.6;蒸馏水定容至1.0L，pH7.0，120。C蒸汽灭菌30min。采用葡萄糖为C源，(NH》2S04为N源。表1和表2的结果表明高环多环芳烃降解菌宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)Fe在条件为pH值为7、温度为20°C、C:N为10:1、PAHs初始浓度为100mg丄"时，对PAHs的降解效果最好，各因素主次为pH〉C:N〉CPAHs〉温度。表l生长因子对宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)F6降解效果影响正交试验<table>complextableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2宛氏拟青霉(i^ea7o/z^c^vfl/vW//)F6在不同条件下对高环PAH的降解<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table><row><column>较优水平</column><column>2</column><column>1</column><column>2</column><column>2</column></row><row><column>因素主次</column><column>1</column><column>4</column><column>2</column><column>3</column></row><table>实施例3:宛氏拟青霉(paecilomycesvariotil)F6对PAHs人工污染土壤的降解效果1.如表4，人工配土的含C，N量都比较低(PAHs微量可忽略)，根据实例2确定的最佳C:N比添加葡萄糖和硫酸铵调整含量为C:8g/kg，N:0.8g/kg，调节含水率为60%-70%。配制营养液葡萄糖19.2g/L，硫酸铵3.5g/L，去离子水1L。(按葡萄糖20g/kg计算)。表3土壤中各营养元素含量<table><row><column>样品</column><column>有机碳(g/kg)</column><column>全氮(g/kg)</column><column>有效磷(g/kg)</column><column>速效钾(mg/kg)</column></row><row><column>清洁土样</column><column>4.16</column><column>0.43</column><column>0.007</column><column>0.9</column></row><table>2.取50g土壤12份，各添加营养液25ml/份，即C:8g/kg，N:0.8g/kg(10:1)，混合均匀装入灭菌培养皿中。其中(1)非生物降解对照三份加5mlHgCl2(0.7g/L)+5ml细菌发酵液并进行高压灭菌；(2)土著微生物降解对照三份加经高压灭菌的F6孢子悬浮液5ml+5ml细胞菌发酵液；(3)三份土壤投加降解F6孢子悬浮液5ml(48h)+高压灭菌的51111细菌发酵液(48h);(4)三份投加F6孢子悬浮液5ml+5ml细胞菌发酵液。每份含水量为70%。将准备好的各土样培养皿称重并封上封口膜(防止水分流失保证供氧)，室温避光下培养，每7天称重并补充适量水分。30天后取土样10g左右，冷冻干燥均质化，测定PAHs残余浓度。从表4和图2可以看出，30天后添加了菌株F6的土壤实验(3)与(4)与非生物对照中5种PAH含量都有明显减少，其中(3)的ZPAHs减少了149.26mg/kg，(4)的ZPAHs减少了120.26mg/kg，而土著微生物对照(2)各PAH含量变化不大，ZPAHs仅减少了去10.99mg/kg，所以(3)和(4)中PAH降解的主要贡献者是菌株F6。本实例这说明菌株F6对土壤介质中的高环PAH也是具有一定降解能力。表430天后土壤中PAHs含量(mg/kgDW)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1、一株高环多环芳烃降解菌，其特征在于该菌株为宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)F6CCTCCNoM208118，具备降解单一高环多环芳烃和高环多环芳烃混合物的能力。2、根据权利要求1所述高环多环芳烃降解菌，其特征在于所述高环多环芳烃化合物为四环、五环或六环的苯环稠和化合物。3、权利要求1或2所述高环多环芳烃降解菌在降解单一高环多环芳烃污染物或高环多环芳烃混合物污染物，或者在土壤生物修复中的应用。全文摘要本发明公开了一株高环多环芳烃降解菌及其应用，本发明所提供的一株高环多环芳烃降解菌宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)F₆，具备降解单一高环多环芳烃和高环多环芳烃混合物的能力。在多环芳烃复合体系中培养30d后，对多环芳烃的降解率为16.06％～24.57％；而在单一多环芳烃体系中降解率为10.42～33.25％，其中对苯并[k]荧蒽和苯并[b]荧蒽的降解率最高，分别为33.25％和26.44％。本发明提供的菌株可为开展多种高环多环芳烃降解的共代谢机理研究和多环芳烃复合污染水土环境修复技术的构建提供了新的种质资源。文档编号C12R1/79GK101343616SQ20081019826公开日2009年1月14日申请日期2008年9月2日优先权日2008年9月2日发明者慧李,李伯威,蔡信德申请人:环境保护部华南环境科学研究所