专利名称：一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法
技术领域：
本发明属于微生物生物技术、生物制药领域，具体涉及一种快速筛选 产紫杉醇内生真菌的方法。
背景技术：
紫杉醇是目前国际上公认的重要抗肿瘤药物。由于红豆杉资源的不足 导致紫杉醇价格的昂贵，影响其在临床上的广泛应用。利用微生物发酵生 产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的有效途径之一。
自1993年Stierle等首次报道了从太平洋红豆杉树中分离到一株可产紫 杉醇的内生真菌以来，国内外只有几十种产紫杉醇内生真菌的报道，原因 之一就是产紫杉醇内生真菌的筛选不易。直至目前，对于产紫杉醇内生真 菌的筛选方法依然和1993年Stierle等所用方法相似，即通过对分离的内生 真菌用大瓶发酵培养后，从发酵液或菌丝体中提取紫杉醇，用薄层层析、 高效液相色谱、质谱、单抗免疫分析等手段对抽提物进行分析，通过确定 抽提物是否含有紫杉醇进而确定内生真菌是否产紫杉醇。然而，薄层层析 法虽简单廉价，但检测的准确度不够；高效液相色谱、质谱、单抗免疫分 析等方法虽检测灵敏、准确度高，但其使用成本也很高。如果对几十株、 上百株真菌都进行大量培养、紫杉醇提取、纯化，并利用高效液相色谱、 质谱、单抗免疫分析等这些灵敏、准确的检测方法进行检测、筛选，将是 一个十分耗时耗材的工作。
所以，建立一种快速有效的高通量筛选产紫杉醇内生真菌的方法是提 高其开发利用的必需因素之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，该方 法具有速度快、筛选率高等优点，有助于更好地开发利用产紫杉醇内生真 菌资源。
本发明提供的快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，包括以下步骤-(1 )采用常规的内生真菌的分离法从红豆杉及红豆杉近缘科属植物的 树皮组织分离、纯化内生真菌；
(2)对步骤(1)得到的内生真菌中进行必"/基因的扩增 分离、纯化后的内生真菌接种在30 50 mL的土豆葡萄糖液体培养基 中，23。C 28。C、 120 200rpm培养3 5天，采用SDS-CTAB法提取真 菌基因组DNA，然后，5 50株真菌基因组DNA作为一个筛选组，各取 0.2 0.5 (aL混合做模板，进行10-去乙酰巴卡亭III-lO-O-乙酰基转移酶基因 (10-deacetylbaccatin III-10-(9-acetyl transferase, DBAT)的扩增检测；其引 物为必W-F (5，-GGGAGGGTGCTCTGTTTG-3,)和必W画R (5'画GTTACCTGA ACCACCAGAGG-3')。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA， 50 100 ,必W-f和50 100 jjM必W画R， 100 200 pM dNTPs， 5 pL 10xPCR reaction buffer, 1 2.5 units DNA polymerase, 用灭菌ddH20补足至U 50 ML;
PCR扩增条件为94。C 96。C、3 6min; 93°C、50 sec 1 min， 50。C 53。C、 30 sec 50 sec, 68。C 72。C、 50 sec 1 min，共进行30 35个循环； 之后，68。C 72。C再延伸7 10 min。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有必W基因条带的内生 真菌筛选组，进行再次分组扩增必W基因，或者直接对筛选组内的每个真 菌进行必W基因的扩增，最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有扩增 有必W基因条带的内生真菌；(3)对含有必W基因的内生真菌进行^^基因的扩增，得到产紫杉醇
内生真菌
对扩增有WW基因条带的真菌再进行C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转 移酉每(C-13 phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase, BAPT)基因的 扩增检测。引物为&/^-F (5'-CCTCTGTCCGCCATTGACAA-3，)和6"j^-R (5 ，-TCGCCATCTCTGCGATACTT-3 ，)；
反应体系采用标准的PCR反应体系，包括30 100 ng真菌基因组 DNA， 5G 100 (xM 6a/^画F和50 100 joM Z>a/^-R， 100 200 jxM dNTPs， 5 jiL 1 OxPCR reaction buffer, 1 2.5 units DNA polymerase，用灭菌ddH20补 足到50 JlL;
PCR扩增条件为94。C 96。C、3 6min; 93°C、 50 sec 1 min， 53。C 55°C、 50 sec 1 min， 68。C 72。C、 1 min 1.2 min,共进行30 35个循 环；之后，68。C 72。C再延伸7 10min;
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，并收集扩增有6"A基因条带的真菌， 即产紫杉醇内生真菌。
本发明是关于以紫杉醇合成的关键酶基因做分子标记(molecular markers),基于PCR扩增技术快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法。它根据已 经报道的红豆杉的lO-去乙酰巴卡亭III-lO-O-乙酰基转移酶基因(必W)和 C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶基因(&^)的保守区设计引物，对从红 豆杉以及红豆杉近缘科属植物的树皮中分离得到的真菌依次进行扩增筛 选，然后对可以扩增出这两个基因的真菌进行发酵培养并提取紫杉醇，用 高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)禾口质谱(mass spectroscopy, MS)对真菌紫杉醇进行分析，并最终确定产紫杉醇的内生真 菌。
本发明的有益效果包括(l)利用PCR技术，以紫杉醇合成的关键酶基 因必W和^^为分子标记，建立了一种快速有效的高通量筛选产紫杉醇内生真菌的方法；(2)和传统筛选方法相比，几十个甚至上百个内生真菌的筛 选只需3 5天的时间，经过筛选后，只有少数几个内生真菌需要进一步用 昂贵的HPLC-MS等方法进行确定，极大地简化了筛选过程，提高了筛选效 率，突破了传统筛选方法耗时费力却不易取得结果的不足。(3)相对于紫 杉醇合成的其它关键酶基因，应用必W和6q^做分子标记筛选产紫杉醇真菌 更具有判断性(diagnostic)，因为必W基因的编码产物，即10-去乙酰巴卡 亭III-10-O-乙酰基转移酶是专一性催化紫杉醇合成的直接萜类前体巴卡亭 m的合成，有必W基因存在，可以从基因水平上判断有巴卡亭III的合成；而 6"内基因的编码产物，即C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶是专一性催化巴
卡亭m和官能侧链基团连接形成紫杉醇的第一步反应，有必",和6"^基因的
存在可以从基因水平上判断有紫杉醇的合成。(4)通过该方法从红豆杉树 皮和穗花杉树皮中筛选获得了5株可以产紫杉醇的内生真菌。
图l为产紫杉醇内生真菌的快速高通量筛选过程示意图。
具体实施例方式
本发明的理论依据目前虽尚无关于产紫杉醇内生真菌的紫杉醇合成 酶基因以及紫杉醇合成途径的报道，但"内共生理论"和相关文献报道推测，
内生真菌可能是通过和宿主红豆杉之间的基因转移(genetic transfer)或者 共进化(co-evolution)关系而获得合成紫杉醇能力的，内生真菌的紫杉醇 合成酶基因和红豆杉的紫杉醇合成酶基因可能有着高的相似性(Young"a/., 1992,五x戸'e我48: 882-885; Li "a/" 1996， M.c油Wogy, 142: 2223- 2226; Lie^/., 2006,所ofec/zM。/og);5M〃劝'"，SI, 356-371)。所以，从理论上可根据 已报道的红豆杉和6"/ /基因的保守区设计引物，基于PCR扩增技术 筛选产紫杉醇的内生真菌。对利用该方法筛选获得的内生真菌的发酵物进 行紫杉醇分析，结果表明这些真菌是可以产紫杉醇的。对这些内生真菌的紫杉醇用核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)分
析，结果表明这些真菌的紫杉醇和标准品紫杉醇具有一样的化学结构。这 些结果说明了该方法的可行性。 本发明方法的具体步骤包括
1. 内生真菌的分离、纯化、保藏
采集红豆杉或者红豆杉近缘科属植物树皮组织，用无菌小刀切成(
0.5x 0.5x 0.5 cm)小块，用70% (v/v)酒精进行表面消毒3 min，用灭 菌的ddH20漂洗3次，然后用无菌小刀剥去外表片，剩余的内表皮均匀放 置在含有50 100 jig/mL的氨苄青霉素的PDA (potato dextrose agar medium)培养基平板上，在23。C 28。C的培养箱中静置培养，根据内生 真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法将形态不同的内生真菌分离到新 的PDA培养基平板上。分离后的内生真菌在23。C 28。C培养传代并检测 纯度，直至获得单克隆。纯化后的内生真菌接种到PDA斜面进行保藏，并 收集其孢子制备孢子悬液，加入终浓度为15% (v/v)的甘油在-70。C进行 低温保藏。
2. 产紫杉醇内生真菌的筛选 产紫杉醇内生真菌的快速、高通量筛选过程示意如图1。 (1)必W基因的扩增
将分离、纯化后的内生真菌接种在30 50 mL的土豆葡萄糖液体培养 基中，23。C 28。C、 120 200rpm培养3 5天，采用SDS -CTAB法(Kim 1990， C朋c/淑，68: 1898-1902)提取真菌基因组DNA，然后，5 50 株真菌基因组DNA作为一个筛选组，各取0.2 0.5 (iL混合做模板，进行 10-去乙酰巴卡亭m-io-o-乙酰基转移酶基因(必W)的扩增检测。弓l物为 必W画F (5，-GGGAGGGTGCTCTGTTTG-3，)和必a/画R (5'-GTTACCTGAAC CACCAGAGG國3,)。一个筛选组的混合真菌基因组DNA， 50 100 jiM必W-F和50 100 pM必W-R， 100 200 dNTPs， 5 pL 10xPCR reaction buffer, 1 2.5 units %《DNA polymerase，用灭菌ddH20补足至!j 50
PCR扩增条件为94。C 96。C、3 6min; 93。C、50sec 1 min， 50°C 53°C、 30sec 50sec， 68。C 72。C、 50sec lmin，共进行30 35个循环； 之后，68。C 72。C再延伸7 10 min。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有必"/基因条带的内生 真菌筛选组，进行再次分组扩增必W基因，或者直接对筛选组内的每个真 菌进行必W基因的扩增，最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有扩增 有必W基因条带的内生真菌进行基因的扩增筛选。
(2) ^^基因的扩增
对扩增有必"/基因条带的真菌再进行C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转 移酶基因(6a/ /)的扩增检测。引物为6a;^-F (5'-CCTCTGTCCGCCATTGAC AA-3，)和—國R (5'-TCGCCATCTCTG CGATACTT國3，)；
PCR反应体系组成包括30 100 ng真菌基因组DNA， 50 100 pM —-F和50 100 [iM 6丰-R，画 200 jiM dNTPs， 5 |iL 10xPCR reaction buffer, 1 2.5 units DNA polymerase,用灭菌ddH20补足至U 50 [iL。
PCR扩增条件为94。C 96。C、 3 6 min; 93°C、 50 sec lmin， 53。C 55°C、 50 sec 1 min， 68。C 72。C、 1 min 1.2 min，共进行30 35个循 环；之后，68。C 72。C再延伸7 10min。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，收集扩增有^^基因条带的真菌 进行下一步的分析。
3.真菌紫杉醇的分析
接种由步骤2筛选得到的既有必W基因也有k^f基因条带的真菌到含有 300 500mL土豆葡萄糖液体培养基中，23。C 28。C、 120 200 rpm条件下 培养10 15天。然后将培养物用纱布过滤，收集菌体，50。C烘干并研磨成粉，过200目筛子后称取0.5 g依据紫杉醇提取方法(Strobel W a/., 1996， M/cra6/o/ogy, 142: 435-440)进行提取、纯化，并对每个真菌的紫杉醇抽提 物用HPLC-MS分析。仪器为Agilentl 100 LC/MSD Trap;柱型C18分离柱 (5x300 mm, Waters)。
注PDA培养基组分和含量为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g。 配制时马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和 琼脂，溶化后补足水至1L，高温灭菌待用。土豆葡萄糖液体培养基组分和 含量同PDA培养基，只是不含有琼脂。
下面通过借助实施例将更加详细说明本发明，且以下实施例仅是说明 性的，本发明并不受这些实施例的限制。 [实施例1]
从华中科技大学校园苗圃采集曼地亚红豆杉(roxM cv. ///cfo/O
树干部树皮，切成约( 0.3x0.5x0.3cm)小块，采用常规的内生真菌的分 离法对组织小块进行处理，并分离内生真菌。树皮内表皮组织小块放置在 含有50 pg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上，在23°C的培养箱中静 置培养，根据真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化获得167 株内生真菌。
167株内生真菌分别接种到30 mL的土豆葡萄糖液体培养基，23°C、 120 rpm培养3天，提取这些真菌的基因组DNA， 50株真菌基因组DNA 各0.2 ]iL混合为一个筛选组，有A、 B、 C三组，另有一个包含67株真菌 基因组DNA各0.2 (xL的D筛选组。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA， 50 (xM必W-F和50 d6w-r， 100 (jM dNTPs， 5 jiL10xPCR reaction buffer, 1 units 72^ DNA polymerase,用灭菌ddH20补足至U 50 (iL。
PCR扩增条件为94。C、 6min; 93。C、 50 sec， 50。C、 30 sec， 68。C、 50sec共进行30个循环；之后，68。C再延伸7min。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，其中A筛选组和D筛选组可以扩增出和 预计大小相同的约200 bp的必W基因片段。
对A筛选组真菌再次进行分组，每10株真菌基因组DNA为一个筛选组， 有A1-A5共5个筛选组；对D筛选组真菌再次进行分组，每10株真菌基因组 DNA为一个筛选组，有D1-D6 6个筛选组和一个包含7株真菌基因组DNA的 筛选组D7，依上述必W扩增条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现 A3和D7两个筛选组可以扩增出和预计大小相同的约200 bp的必w基因片 段。
分别以A3和D7两个筛选组的17株真菌基因组DNA为模板，依上述必w 扩增条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，其中有12株内生真菌的 基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约200bp的必W基因片段。
对这12株内生真菌进行6"^基因的扩增。PCR反应体系组成包括30 ng 真菌基因组DNA， 50 fiM 6a/^-F和50 pM 6"pf-R， 100 jiM dNTPs， 5 jiL 1 OxPCR reaction buffer, 1 units Tag DNA polymerase，用灭菌ddH20补足至U 50 foL。
PCR扩增条件为94°C、 6min; 93。C、 50 sec， 53。C、 50sec， 68。C、 lmin，共进行30个循环；之后，68°C再延伸7 min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，其中有2株内生真菌可以扩增出k^基 因。将这2株内生真菌接种到300mL土豆葡萄糖液体培养基中，23°C、 120 rpm条件下培养10天，提取紫杉醇并进行HPLC-MS分析，结果表明，这 2株真菌可以产紫杉醇。
从武汉植物园采集云南红豆杉(Km >;z#2"fl"era& C7zewg"ZJ:.FM)茎 部树皮组织，用无菌小刀切成( 0.5x0.5x0.5cm)小块，然后采用常规的 内生真菌的分离法对组织小块进行处理，并分离内生真菌。树皮内表皮组 织小块放置在含有75 pg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上，在26°C 的培养箱中静置培养，根据内生真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化内生真菌，并最终获得31株内生真菌。
31株内生真菌分别接种到3.0 mL的土豆葡萄糖液体培养基，26°C、 150 rpm培养3天，提取这些真菌的基因组DNA，各取0.3 pL进行分组筛选， 每IO株真菌基因组DNA为一个筛选组，有A、 B两组，另有一个包含ll 株真菌基因组DNA的C筛选组。以混合真菌基因组DNA为模板进行必w 基因扩增。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA、 75 )iMtta-F、 75iiMcte-R、 150^MdNTPs、 5 pL 10xPCR reaction buffer、 2 units ra《DNA polymerase,用灭菌ddH20补足至J 50 jxL。
PCR扩增条件为96。C、 3min; 93。C、 55 sec， 53。C、 40 sec, 72。C、 lmin，共进行35个循环；之后，72。C再延伸7min。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析表明，其中A筛选组可以扩增出和预计 大小相同的约200 bp的必W基因片段。
依上述必"/扩增条件，对A筛选组的10株真菌基因组DNA分别进行必W 基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有5株内生真菌的基因组DNA可 以扩增出和预计大小相同的约200bp的必W基因片段。
之后，对这5株内生真菌进行k^f基因的扩增。PCR反应体系组成包 括50 ng真菌基因组DNA， 75 k^-F和75 pM k / Ml， 150 pM dNTPs， 5 jiL 10xPCR reaction buffer, 1.5 units DNA polymerase,用灭菌ddH20 补足到50 pL。
PCR扩增条件为:95。C、 5min; 93。C、 55 sec， 55。C、 55 sec, 72。C、 1.2 min，共进行35个循环；之后，72。C再延伸7min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，其中有1株内生真菌可以扩增出^W基 因。将这1株内生真菌接种到400mL 土豆葡萄糖液体培养基中，26°C、 200 rpm条件下培养10天后，提取紫杉醇并进行HPLC-MS分析，结果表明， 这l株真菌可以产紫杉醇。从华中科技大学校园瑜珈山上，采集东北红豆杉(rax^cw^Wata57e6. "Zwcc.)近根部树皮，用无菌小刀切成( 0.1x0.3x0.5cm)小块，然后采 用常规的内生真菌的分离法对组织小块进行处理，并分离内生真菌。树皮 内表皮组织小块放置在含有100pg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上， 在28。C的培养箱中静置培养，根据真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化 法分离、纯化获得45株内生真菌。
45株内生真菌分别接种到50 mL的土豆葡萄糖液体培养基，28°C、 200 rpm培养5天，提取这些真菌的基因组DNA，各取0.5 进行分组筛选， 每5株真菌基因组DNA为一个筛选组，有A I共9组，以混合真菌基因 组DNA为模板进行必W基因扩增，
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA， 100 pM必W-F， 100 [xM cte國R， 200 jxM dNTPs， 5 [iL 10xPCR reaction buffer, 2.5 units ra《DNA polymerase,用灭菌ddH20补足至U 50 jiL。
PCR扩增条件为:96。C、 3min; 93。C、 1 min， 53。C、 50 sec, 68。C、 lmin，共进行35个循环；之后，68。C再延伸10 min。
凝胶电泳检测分析，其中有D、 F、 G筛选组可以扩增出和预计大小相 同的约200 bp的必"遂因片段。
依上述必W扩增条件，对D、 F、 G筛选组共15株真菌基因组DNA分别 进行必W基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有8株内生真菌的基因 组DNA可以扩增出和预计大小相同的约200 bp的必a遂因片段。
对这8株内生真菌进行基因的扩增。PCR反应体系组成包括100 ng 真菌基因组DNA， 100 jxM 6a/^-F， 100 (iM Z^pMl， 200 一 dNTPs， 5 1 OxPCR reaction buffer, 2 units %《DNA polymerase，用灭菌ddH20补足至!j 50 pL。
PCR扩增条件为96。C、 6 min; 93°C、 55 sec， 55°C、 1 min， 72°C、 lmin，共进行35个循环；之后，72°C再延伸10 min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，有1株内生真菌可以扩增出^內基因。 将这1株内生真菌接种到500mL土豆葡萄糖液体培养基中，28°C、 150rpm条件下培养15天后，提取紫杉醇并进行HPLC-MS分析，结果表明，这1 株真菌可以产紫杉醇。
从武、汉植物园米集禾惠花杉(v4附e"totoxws (//a"ce)尸z7ger)近
根部树皮组织，用无菌小刀切成( 0.5x0.5x0.3cm)小块，然后采用常规 的内生真菌的分离法对组织小块进行处理，并分离内生真菌。树皮内表皮 组织小块放置在含有75 pg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上，在28。C 的培养箱中静置培养，并根据真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分 离、纯化获得64株内生真菌。
64株内生真菌分别接种到40 mL的土豆葡萄糖液体培养基，2S。C、 150 rpm培养4天，提取这些真菌的基因组DNA，各取0.2 进行分组筛选， 每8株真菌基因组DNA为一个筛选组，有A H共8组，以混合真菌基因 组DNA为模板进行必W基因扩增。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA， 50 |iM d6w國F， 50 piM cfew-R， 150 jiM dNTPs， 5 jxL 10xPCR reaction buffer, 2.5 units K2《DNA polymerase,用灭菌ddH20补足至u 50 [jL。
PCR扩增条件为95°C、 5min; 93。C、 1 min， 51°C、 40 sec, 72。C、 55 see,共进行30个循环；之后，72。C再延伸10 min。
经凝胶电泳检测分析发现，其中A、 G两个筛选组可以扩增出和预计大 小相同的约200 bp的必W基因片段。
依上述必W扩增条件，对A、 G两个筛选组共16株内生真菌基因组DNA， 分别进行必W基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有8株内生真菌的 基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约200bp的必"蓬因片段。
对这8株内生真菌的基因组DNA进行基因的扩增。PCR反应体 系组成包括80 ng真菌基因组DNA， 50 pM 6fl/^-F和50 6a/^-R， 150 joM dNTPs， 5 |_iL 10xPCR reaction buffer, 2.5 units ra《DNA polymerase,用灭菌 ddH20补足到50 pL。PCR扩增条件为96°C、 3min; 93。C、 1 min， 54°C、 55 sec, 68°C、 1.2 min，共进行35个循环；之后，68°C再延伸10 min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，有1株内生真菌可以扩增出6"^基因。 将这1株内生真菌接种到500 mL 土豆葡萄糖液体培养基中，28°C、 150 rpm 条件下培养15天后，提取紫杉醇并进行HPLC-MS分析，结果表明，这l 株真菌可以产紫杉醇。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于上述实 施例所公开的内容，所以，凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效 或修改，都落入本发明保护的范围。
权利要求
1、一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，包括以下步骤(1)从红豆杉树皮组织采用常规的内生真菌的分离法分离、纯化内生真菌；(2)对步骤(1)得到的内生真菌中进行dbat基因的扩增分离、纯化后的内生真菌接种在30～50mL的土豆葡萄糖液体培养基中，23℃～28℃、120～200rpm培养3～5天，采用SDS-CTAB法提取真菌基因组DNA，然后，5～50株真菌基因组DNA作为一个筛选组，各取0.2～0.5μL混合做模板，进行10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶基因(dbat)的扩增检测；其引物为dbat-F(5’-GGGAGGGTGCTCTGTTTG-3’)和dbat-R(5’-GTTACCTGAACCACCAGAGG-3’)；反应体系采用标准的PCR反应体系，包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，50～100μMdbat-F和50～100μMdbat-R，100～200μMdNTPs，5μL10×PCR reaction buffer和1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH2O补足到50μL；PCR扩增条件为94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，50℃～53℃、30sec～50sec，68℃～72℃、50sec～1min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有dbat基因条带的内生真菌筛选组，进行再次分组扩增dbat基因，或者直接对筛选组内的每个真菌进行dbat基因的扩增，最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有扩增有dbat基因条带的内生真菌；(3)对含有dbat基因的内生真菌进行bapt基因的扩增，得到产紫杉醇内生真菌对扩增有dbat基因条带的真菌再进行C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶基因(bapt)的扩增检测；引物为bapt-F(5’-CCTCTCTCCGCCATTGACAA-3’)和bapt-R(5’-TCGCCATCTCTGCCATACTT-3’)；反应体系采用标准的PCR反应体系，包括30～100ng真菌基因组DNA，50～100μMbapt-F和50～100μMbapt-R，100～200μM dNTPs，5μL10×PCR reaction buffer，1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH2O补足到50μL；PCR扩增条件为94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，53℃～55℃、50sec～1min，68℃～72℃、1min～1.2min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，并收集扩增有bapt基因条带的真菌，即产紫杉醇内生真菌。
全文摘要
本发明公开了一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，该方法以紫杉醇合成的关键酶基因作为分子标记，基于PCR扩增技术快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，它根据已经报道的红豆杉的10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶和C-13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶基因的保守区设计引物，对从红豆杉树皮中分离得到的真菌依次进行扩增筛选，然后对可以扩增出这两个基因的真菌进行发酵培养并提取紫杉醇，用HPLC和MS对真菌紫杉醇进行分析，并最终确定产紫杉醇的内生真菌。本发明为实现由微生物发酵法取代从红豆杉植物组织中提取紫杉醇的转化，提供了有效的菌种分离筛选方法及一批有效的出发菌株。
文档编号C12Q1/04GK101418341SQ200810197858
公开日2009年4月29日 申请日期2008年11月21日 优先权日2008年11月21日
发明者付春华, 余龙江, 周蓬蓬, 鹏 张, 赵春芳 申请人:华中科技大学