专利名称：：一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其基因的克隆。技术背景木聚糖是一种杂合多聚五碳糖，主链绝大部分都是都是d型吡喃木糖通过e-1,4糖苷键连接，主要的侧链取代基有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、4-0-甲基葡萄糖醛酸、乙酰基、半乳糖基等。木聚糖是半纤维素的主要成分，占植物碳水化合物的1/3，是继纤维素之后的第二大可再生资源。所以，水解木聚糖是利用半纤维素的重要步骤。木聚糖酶广泛用做饲料工业的添加剂、食品工业的改良剂、和造纸工业中纸浆的生物漂白剂等(Polizeli等，2005)。木聚糖酶最早应用于饲料工业。木聚糖酶能破坏植物细胞壁，将营养物质释放出来，提高养分的利用率(Kiin等,2005)。另外木聚糖酶能降低食糜的粘度，提高饲料的表观代谢能(Eun等，2006)。总之，木聚糖酶作为饲料添加剂，能有效的解除木聚糖的抗营养作用。食品工业方面，木聚糖酶能改善面包的质量；降解木聚糖生成具有保健功能的低聚木糖；在酿酒工业中，木聚糖酶降解木聚糖，能提高发酵效率，改善口感等。木聚糖酶在工业中最重要的应用是作为造纸工业中纸浆的生物漂白剂。木聚糖酶能降解凝结于纤维表面的半纤维素，增加漂白剂与纤维的接触面积，提高漂白效率。但是，在利用木聚糖酶进行预漂白时，纸浆为温度较高的碱性浆，PH值在8.0以上，温度在60'C左右，这就要求所用的木聚糖酶具有耐碱和耐高温的特性(Ahlawat等,2007)。同时，造纸工业中使用的木聚糖酶不能同时具有纤维素酶活性，以免降解纸浆中的纤维，影响成浆质量(SubramaniyanandPrema,2000)。到目前为止，国内外已有300余种不同来源的木聚糖酶基因的报道,细菌、真菌、链霉菌、植物和原生动物中均有报道(Srivastava等，1991;Suzuki等，2002;Devillard等，1999)，其中IOO多种基因在合适的宿主中被克隆和表达(WamalTO等，2007)。但是，由于木聚糖酶产量不高或酶的耐受性不够等问题，以至于酶在工业上的大规模使用受到限制。而解决这一问题的方法主要有1、对现有的木聚糖酶进行遗传改造，提高酶的性质；2、从极端环境中筛选优良的木聚糖酶产生菌，并获取优良理化性质的木聚糖酶基因。尤其是后者，已成为广泛应用木聚糖酶降低生产成本的突破口之一。随着时间的推移，陆地资源日渐贫瘠，而世界海洋占据了地表面积的70%以上，是一个巨大的生物资源的宝库。海洋环境包括了高压、低温、无光照、局部的高温、高盐等生命极限环境，以及从营养丰富区到只有少数微生物能生存的营养馈乏区等等，生态环境非常复杂而多样。在这样的生态环境下，海洋的微生物在长期的进化中，发展了一些独特的结构和功能，以维持其生命活动。海洋微生物的复杂多样使其产生的代谢产物也具有多样性、复杂性和特殊性，因而海洋微生物成为重要的基因库和开发新颖生物活性物质的极好的天然资源。因此，利用海洋微生物生态环境的复杂和多样性，从中筛选耐受高压、高盐、低温等极端性质的木聚糖酶类是海洋微生物研究与开发的一个很好的方向。海洋微生物的木聚糖酶在环境保护、食品加工和其它生物技术过程中具有很大的应用潜能。
发明内容本发明的目的是提供一种性质优良、适合于在造纸工业中应用的木聚糖酶及其编码基因，为进一步通过基因工程的方法，利用重组生物反应器来工业化生产廉价木聚糖酶提供很好的基因资源。本发明人从国家海洋局第三研究所提供的深海细菌中筛到一株被命名为Kocuriasp.Mn22的天然菌株，它所产生的木聚糖酶(简称为Kxyn)适合在造纸工业中使用。该木聚糖酶具有高活性，良好的耐碱性和热稳定性、对十二烷基磺酸钠(SDS)也有一定耐受性，而且没有纤维素酶活性，只特异性降解木聚糖。Kxyn最适pH为8.5，在不同pH缓冲液中4。C过夜处理后，在pH7.5-12的范围内维持80%以上的酶活性；最适温度为55'C,在60。C处理一小时，酶活为30%左右；5mMSDS处理后还有90%的酶活。以羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、槐豆胶、桦木木聚糖和燕麦木聚糖为底物测定Kxyn的底物特异性，Kxyn只降解木聚糖，酶活分别为132土lIU/rog和22土2IU/rag，对桦木木聚糖的Km为5.4mgml—1,Vmax为272Wnolrain—1mg—1'本发明克隆到此木聚糖酶的编码基因，它具有序列表SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过鸟枪法(Charles等,2005)构建DNA文库，得到了这个木聚糖酶基因Kxyn。序列分析结果表明，该基因全长为1170bp,编码390个氨基酸。其完整的氨基酸序列与GeneBank上各种木聚糖酶的氨基酸序列同源性比较，最高的仅为63%，属于第10家族糖苷水解酶中的一种新木聚糖酶。Kxyn的氨基酸序列中只有活性催化区，没有纤维素结合区或其他功能区。申请人已将包含该基因质粒的大肠杆菌(&c力en'cA'accJ"DH5a/Mn22/6p/Kxyn，于2008年11月5日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCCNO:M208201号。序列表SEQIDNO:l是本发明克隆的耐碱、高活性的碱性木聚糖酶Kxyn基因序列，序列全长为1170bp,其中l-1170位bp处为编码区。图1:纯化后的重组木聚糖酶Kxyn的SDS-PAGE分析图中l.标准蛋白分子量2.纯化的木聚糖酶Kxyn图2:木聚糖酶的最适PH值。图3:木聚糖酶的PH稳定性。图4:木聚糖酶的最适反应温度。图5:木聚糖酶的热稳定性。具体实施方式实施例l产木聚糖酶的天然菌株的筛选方法将由中国海洋微生物菌种保藏中心(地址福建省厦门市中国海洋局三所)提供的海洋菌株(共计IOO个菌株)在高盐LB(1%的蛋白胨，0.5%酵母培养物和2%氯化钠，pH7.0)平板上活化后，挑出单菌落在产酶培养基(1%木聚糖，1%蛋白胨，1%酵母培养物，2%氯化钠(NaCl)，0.2%磷酸氢一钾(K2HP04)，0.03%硫酸镁(MgS04)，0.02呢氯化钙(CaCl2)和1.5%的琼脂糖，pH7.0)平板上，28'C培养36小时后，用1柳J果红染色10-15分钟，然后lM的NaCl脱色，挑取产生较大透明圈的菌株。经此实验，筛选得到一株属于放线菌属的考克氏菌，将该菌株命名为Kocuriasp.Mn22进行后续实验。实施例2DNA文库的构建和木聚糖酶阳性克隆的筛选1、提取细菌染色体DNA:(1)将实施例的筛选的Kocuriasp.Mn22菌株，用实施例1所述的高盐LB液体培养基于28'C培养24小时后，取1.5ml菌液于一灭菌Ep管中，12000转/分钟离心1分钟，弃上清，收集菌体；(2)用TEbuffer(50咖ol/LTris-HClp朋.0,10咖ol/LEDTApH8.0)洗菌体2次，之后加入50u1100wg/ml溶菌酶(购于sigma公司)悬浮菌体，37。C水浴一小时；(3)加入520ulTEbuffer,30ul10%SDS和3yL20mg/ml的蛋白酶K(购于si柳a公司)混匀后，37'C水浴一小时；(4)然后加入100yl5mol/L的氯化钠溶液充分混匀，再加溴代十六烷基三甲胺(CTAB)/氯化钠(愿CTAB，0.7MNaCl)溶液80uL混匀，70。C水浴10分钟；(5)加入等体积的酚氯仿异戊醇(体积比为25:24:1)，混匀，室温放置5-10分钟。12000rpm离心10分钟，抽提两次，得到上清；(6)取步骤(5)的上清加入2/3体积的异丙醇轻轻混匀，12000转/分钟离心10分钟；(7)弃上清，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置-20。C保存备用。部分酶解KocuriaspMn22染色体DNA染色体DNA用限制性内切酶&w3AI(购自TAKARA公司)部分酶解，酶解反应(50u1)为5y110X酶解缓冲液(购自TAKARA公司)，30y1染色体DNA，0.5U限制性内切酶&u3AI，加水至终体积为50ul，在37'C下酶解5分钟后，每两分钟取样5"1终止酶解，琼脂糖电泳确定最佳酶解时间，然后放大体系酶解酶解最佳时间后，琼脂糖电泳酶解产物，根据DNAmarker切胶回收4-9Kb片段。纯化酶解产物按Qiagen公司琼脂糖胶DNA纯化试剂盒(QIAquickgelpurificationkit)及操作程序进行.具体过程是取600ulPB缓冲液(购自Qiagen公司)，与150mg含有酶解产物的琼脂糖胶于50'C加热溶胶，待琼脂糖胶充分熔解后,上纯化柱(购自Qiagen公司)，以12000转/分钟离心1分钟,弃去流出液，再加750p1PE缓冲液(购自Qiagen公司)，用12000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后，力n50u1无离子水，用12000转/分钟离心1分钟，离心收集纯化酶解DNA。酶解、脱磷PUC18载体用限制性内切酶及^HI(购自TAKARA公司)充分酶解质粒载体pUC18(购自TAKARA公司)，酶解反应(150lU)为15ulIOX酶解缓冲液(购自TAKARA公司)，100u1染色体DNA,1-2yl限制性内切酶及Mffl,加水至终体积为150u1,在37。C下酶解2-3小时后，再加lulCIAP(购自TAKARA公司)37'C反应1小时。琼脂糖电泳酶解产物，根据DNA隨rker切胶回收2.7Kb左右片段。连接20ul连接反应含有2u1IOX连接缓冲液(购自TAKARA公司)，2-4ul预先用feMH酶解和CIAP脱磷的pUC18载体(购自TAKARA公司)，7-10u1酶解PCR产物，1u1TJ)NA连接酶(购自TAKARA公司)，加水至终体积20ul，放4。C保温过夜。转化:取2ul连接混合物与20w1大肠杆菌感受态细胞DH10B(购自Invitrogen公司)混合，加入到预冷的lmm的电转杯(购自BioRad公司)，1.5KV电击，然后迅速加入800u1液体LB培养基(其中含1%胰蛋白胨，l%Nacl,0.5%酵母粉pH7.0),37。C保温l小时。与40ul2%X-gal和4ul20呢的IPTG(均购自sigma公司)混匀，铺含IOOPg/ml氨苄青霉素固体LB培养基(配方如下1%胰蛋白胨，l%Nacl，0.5%酵母粉，1.5%琼脂糖，pH7.0)平皿，37'C保温14小时,获得蓝白斑筛选的Jocw/a印.Mn22的DNA文库。筛选木聚糖酶阳性克隆用灭菌牙签将白斑挑出同时接种在含IOO化/ml氨苄青霉素固体木聚糖平板和LB平板上，培养过夜后，用O.5%刚果红染色木聚糖平板10-15分钟，然后用lMNaCl脱色，筛选产生透明圈的克隆，并在LB平板上保存相对应的克隆。根据这种方法，我们从3000个转化子中挑出一个能在木聚糖平板上产生透明圈的阳性克隆，插入的质粒被命名为pUC-Kxyn。插入木聚糖酶基因的重组质粒的制备将产生透明圈的阳性克隆从LB固体平板上接种到含100化/ml氨苄青霉素LB液体培养基中37。C培养过夜，取1.5ml菌液于一灭菌Ep管中，12000分钟/转离心1分钟,弃上清液，收集菌体。加入100iil溶液I(50mMTris-HC1，pH7.5，10mM乙二胺四乙酸(EDTA),核糖核酸酶A100ug/ml)充分混匀，然后加入溶液II(0.2MNaOH，1%SDS)轻轻混匀，室温静置3-5分钟，最后加入溶液III快速混匀，12000转/分钟离心5分钟，收集上清；加入等体积的酚氯仿异戊醇(体积比为25:24:1)，混匀，室温放置5-10分钟，12000转/分钟离心5分钟；再次收集上清，力Q2/3倍体积的异丙醇混匀后12000转/分钟离心5分钟沉淀DNA;弃上清，沉淀用70%乙醇洗1次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置-2(TC保存备用序列分析根据pUC18/M13通用引物为测序引物(引物l:AGTCACGACGTTGTA;引物2:CCCAGTCACGACGTT)，以pUC-Kxyn重组质粒为模板，由北京华大生物公司测序。测序结果通过BLAST比对发现，插入片段确实含有木聚糖酶基因，基因全长为1170bp，编码390个氨基酸，其完整的氨基酸序列与GeneBank上各种木聚糖酶的氨基酸序列同源性比较，最高的仅为63%，属于第10家族木聚糖酶。实施例3大肠杆菌中克隆、表达和纯化木聚糖酶Kxyn的方法构建重组表达载体pGEX-6P-Kxyn:根据测序结果，设计引物，该引物对的序列如下止向引物(F):5'--ACCGGATCCATGAGCAGACGAGCCCCCCT反向引物(R):5'_(ffcoRI)-GCGGAATTCTCAGCGGAACGCGGGGT以pUC-Kxyn为模板，PCR扩增Zov7。PCR体系如下10XPCR缓冲液(购自TAKAKA公司)5iUMncl2(5mM)3P1d證(10mM)1u1模板质粒pUC-Kxyn1u1正向引物FC10nM)1u1反向引物K(10uM)1ii1TaqDNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，即TAKARA,2.5U/ul)1ul加无离子水至50ulPCR条件95°C预变性4分钟；95。C40秒；6(TC30秒；72°C60秒，30个循环；72'C延伸10分钟，4'C5分钟结束。酶解PCR产物和质粒载体pGEX-6P-l:PCR产物用限制性内切酶fe/z/HlAfcoRI(购自TAKARA公司)酶解，酶解反应(IOOul)含有10ul10X酶解缓冲液(购自TAKAM公司)，70wlPCR产物，3u1限制性内切酶Hl/fe凍I,加水至终体积为100ul,在37'C下保温3-5小时。质粒载体pGEX-6P-l酶解条件和体系同上一致。纯化酶解产物按Qiagen公司PCR纯化试剂盒(QIAciuickPCRpurificationkit)及试剂盒说明书介绍的操作程序进行。具体过程是取400nlPB缓冲液(购自Qiagen公司)，与100ulPCR产物充分混匀后，上纯化柱(购自Qiagen公司)，以12000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，再加750u1PE缓冲液(购自Qiagen公司)，用12000转/分钟离心1分钟，弃去流出液，最后，加50w1无离子水，用12000转/分钟离心1分钟，离心收集纯化酶解DNA。纯化质粒pGEX-6P-l酶解产物方法参照实施例中"纯化酶解产物"的方法。连接20ul连接体系含有10X连接缓冲液(购自TAKARA公司)2u1Sa迈HI/fcoRI酶解pGEX-6P-12u15a辺Hl/fcdI酶解PCR产物8u1T4DNA连接酶(购自TAKARA公司)1u1加无离子水至20n14'C保温过夜。转化将连接混合物与100ii1大肠杆菌感受态细胞DH5a混合,冰浴放置30分钟，42°C处理90秒，加800ulLB培养基(其中1%胰蛋白胨，1%氯化钠，0.5%酵母粉，pH7.0)，37'C保温1小时，铺含100Pg/ml氨苄青霉素固体LB平皿，37'C保温14小时,挑取转化子抽提质粒。质粒制备方法同实施例2中"带有木聚糖酶基因的重组质粒的制备"序列测定以pGEX-6P-Kxyn重组质粒为模板，以pGEX-6P-1的通用引物为测序引物，交由北京华大生物公司测序。结果与pUC-Kxyn的木聚糖酶核苷酸序列完全一致。表达纯化木聚糖酶将重组质粒pGEX-6P-Kxyn转化致大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化木聚糖酶。具体步骤是转化将质粒pGEX-6P-Kxyii与100u1大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)混合，冰浴放置30分钟，42°C处理90秒，加800p1LB培养基(其中1W胰蛋白胨，l%Nacl，0.5%酵母粉，PH7.0),37'C保温1小时，铺含100M/ml氨苄青霉素固体LB平皿，37'C保温14小时，挑取转化子诱导表达木聚糖酶。重组木聚糖酶在大肠杆菌中的诱导表达将过夜活化的转化子以m的接种量转接至lL含100^Ail氨苄青霉素LB液体培养基中，37'C培养2-3hrs,使A600达到0.6-0.7,加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，18°C200转/分钟培养10小时。离心收集菌体，然后用PBS缓冲液(pH7.4,140.0mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10.0mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸氢二钾)洗涤一次，再用50ralPBS悬浮，然后用高压细胞破碎仪破碎细胞，收集细胞破碎液。于4。C、12000转/分钟离心30分钟，收集上清。对上清进行初步活性实验和SDS-PAGE检测上清是否有目的蛋白表达。亲和层析纯化木聚糖酶根据GST融合蛋白纯化试剂盒(购自Pharmacia公司)及试剂盒说明书操作。(1)装柱取lmL柱材料GSHS印harose4B至层析柱中，用50mlPBS(pH7.4，140.0mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10.0mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸氢二钾)缓冲液过柱，平衡柱材料。(2)上样将细胞破碎液的上清以O.5ml/min的流速过柱(3)洗脱再用200mlPBS缓冲液过柱，洗脱没有结合的蛋白(4)酶解取10ul浓度为10个单位/ul的3C蛋白酶(购自Pharmacia公司)与lml的PBS缓冲液混匀，加入层析柱酶切，在4'C酶解16小时。(5)收集蛋白收集上次添加的PBS缓冲液，然后再加lmlPBS缓冲液第二次洗脱收集。PBS缓冲液中即溶有目的蛋白Kxyn。SDS-PAGE检测重组木聚糖酶纯度浓縮胶浓度为5%，配方如下H201.4ml30%Acr-Bis(29:1)0.33ral1MTris-HCl，pH8.80.25ml10%SDS0.02ml10%过硫酸铵0.02mlTEMED0.002ml分离胶浓度为12%，配方如下H201.6ml30%Acr-Bis(29:1)2ral1MTris-HC1，pH8.81.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED0.002ml取10iil纯化的蛋白样品，加等体积的蛋白上样缓冲液(2X)，沸水浴5-10min，然后上样10wl电泳检测。SDS-PAGE电泳检测结果(图l)表^a，纯化的蛋白为单一条带，大小为40KDa。测定木聚糖酶蛋白浓度根据Bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限责任公司)说明书测定木聚糖酶蛋白浓度。具体步骤是(1)取4ul蛋白标准品(购自上海生工生物工程技术有限责任公司)力口PBS稀释至100ul，使终浓度为200ng/ml。(2)取稀释后的标准品按O，1，2，4,6，8，10,15ul分别加到96孔板中，加PBS补足到20ul，每孔蛋白含量分别为O，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2和3ug,每个梯度重复3次。(3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，力nPBS到20ul，重复3次(4)各孔加入200ulBradfordReagent,混匀，室温放置5min。(5)用预热的酶标仪(购自ThermoScientific公司)测定A595读数。(6)绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度最后计算获得木聚糖酶浓度为O.17mg/ml。实施例4木聚糖酶的酶学性质的测定方法木聚糖酶最适pH和pH稳定性测定方法如下采用常规的3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定产生还原糖含量。取10ul稀释了10倍的纯化的木聚糖酶加入90ul用不同pH值缓冲液配制W的桦木木聚糖底物(pH3.0-8.O缓冲液为O.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸缓冲液；pH8.5-12缓冲液为50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，50。C反应30min，然后加入IOOn1终止液(1L溶液酒石酸钾钠182.0g,3，5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH21.Og，苯酚5.Og，无水亚硫酸钠5.0g)终止反应，并于10(TC反应10min,冷却后加双蒸水定容至lml，再取200wl酶标仪测定A540读数，以最高酶活为100%,计算不同条件下的相对酶活。图2表明，Kxyn最适pH为8.5,在pH6.5_9.5酶活均维持在最大酶活的60%以上。木聚糖酶于上述不同pH值缓冲液中4。C放置24hrs，再在pH8.5的缓冲液中测定活性，以研究Kxyn的pH值耐受性，以未处理的木聚糖酶酶活为100%，计算相对酶活。结果见图3，图3表明，在pH7.5-12,残余酶活仍在80%以上，且在pH8.5-10.5时残余酶活为100t说明此木聚糖酶Kxyn具有很好的耐碱性。木聚糖酶最适温度和热稳定性测定方法如下木聚糖酶最适温度的测定是在p朋.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中在不同温度下测定酶活。热稳定性的测定是木聚糖酶在6(TC和70。C处理不同时间，再在最适温度下测定酶活。图4和图5结果分别表明Kxyn的最适温度为55。C，在60°C和70。C处理一小时后残余酶活为3096和15^左右。木聚糖酶的Km和Vmax测定方法如下用PH8.5Gly-NaOH缓冲液配制不同浓度的桦木木聚糖底物(从O.5rag/mlto15mg/ml),在55°C测定酶活性，计算Kxyn55。C的Km和Vmax。经测定，Kxyn在55。C的Km为5.4mgnil—1，V腿为2，720Wnolmin—1mg—'。各种化学试剂对Kxyn酶活的影响测定如下各种金属离子(终浓度为lmm)和乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇、e-巯基乙醇和十二烷基磺酸钠(终浓度为5rain)与木聚糖酶混匀，然后按常规方法测定酶活。以对照酶活为100%,计算相对酶活。结果(表l)表明，Hg2+，Cu2+，Zif，Pb2+和EDTA强烈抑制Kxyn的活性，而Mg2、Na、K'，Ca2P-巯基乙醇和DTT对Kxyn没有影响。但是Kxyn对SDS具有耐受性，加入SDS后，Kxyn仍有9C^的酶活。表l各种化合物对本发明的木聚糖酶Kxyn的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>木聚糖酶的底物特异性测定方法如下以浓度均为1%的羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、桦木木聚糖、燕麦木聚糖和槐豆胶(购自sigma公司)为底物，在pH8.5缓冲液中55。C测定Kxyn对各种底物的活性。结果如表2所示，由表2可以看出，本发明制备的木聚糖酶Kxyn只对木聚糖有活性，对纤维素或葡甘露聚糖没有活性。__表2本发明的木聚糖酶Kxyn对各种底物的活性_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>槐豆胶Notdetected结晶纤维素_Notdetected_参考文献1.Polizeli，M,L.T.M.，Rizzatti,A,C.S.，Monti，R.，Terenzi,H.F,，Jorge,J.A,，Amorim，D.S.，2005.Xylanasesfromfungi:propertiesandindustrialapplications.ApplMicrobiolBiotechnol.67，577-5912.Kim，丄C.，Simmins,P.H"Mullan，B.P，2005.Thedigestibleenergyvalueofwheatforpigs,withspecialreferencetothepost-weanedanimal.AnimalFeedScienceandTechnology.122，257-2873.Eun，J.S.，Beauchemin，LA.，Hong，S.H.，2006.Exogenousenzymesaddedtountreatedorammoniatedricestraw:Effectsoninvitrofermentationcharacteristicsanddegradeability.AnimalFeedScienceandTechnology.131，86-1014.Ahlawat,S.，Battan，B.，Dhi醒，S.S.，Sharma，J.，Mandhan，R.P.，2007.Productionofthermostablepectinaseandxylanasefortheirpotentialapplicationinbleachingofkraftpulp.JIndMcrobiolBiotechnol.34,763-7705.Subr腦aniyan,S,,Prema,P.，2000.Cellulase-freexylanasesfromBacillusandothermicroorganisms.FEMSMicrobiolLett.183，1-76.Srivastava,R.，Ali,S.S.，Srivastava,B.S.，1991.Cloningofxylanasegeneof5"tr印t譜yces/7^(9^r/sew5infoc力er/c力/sco7iandbacteriophage入-inducedlysisforthereleaseofclonedenzyme.FEMSMicrobiologyLetters.78，201-206.7.Suzuki,M.，Kato，A.，Nagata，N.，2002.Axylaimse，AtXynl，ispredominantlyexpressedinvascularbundles，andfourputativexylanasegeneswereidentifiedinthe^ra力iflb/^'5^Wia/73genome.PlantCellPhysiol.43，759-767.8.Wamalwa，B.M.,Zhao，G"Sakka，M.，s丄,2007.High—levelheterologousexpressionoffeci77w力a7(9o^ra/751putativexylanasexynlla(BH0899)inA7y7^ra^cas17s"/s1.BiosciBiotechnolBiochem.71，688—693.9.Devillard，E.，Newbold，C.J.，Scott，K.P.，.1999.Axyianaseproducedbytherumenanaerobicprotozoan尸0/7A/^ytr(9/M7"7z^'msj'c〃7st咖showsclosesequencesimilaritytofamily11xylanasefromGrampositivebacteria.FEMSMicrobiolLett.181，145-152.10.CharlesC丄，RenaE.K.，KurtW.，e力s7.,2005.Cloningandcharacterizationofacold-activexylanaseenzymefrom肌environmentalDNAlibrary.Extremophiles(2006)10:295-300.序列表<110>华中农业大学<120>—种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶及其编码基因<130〉<141〉2008-10-31<歸<170><210>〈211〉〈212><213><220><221〉〈222>〈223〉<220><221><222><223〉〈220>〈221><222〉<223>〈220〉<221>〈222〉<223><400>2Patentlnversion3.111170丽大肠杆菌(Escherichiablattae)gene(l)..(1170)primer—bind(1154).(1170)primer—bind(l)..(20)CDS(1).(1170)1cgagccArgAla5tgcetcCysLeu20gagacceggccccccatg3gcagsMetSerArg1gccgccctgAlaAlaLeucccetcetccgcgccggagcggccaccgccgtc48ProLeuLeuArgAlaGlyAlaAlaThrAlaVal1015accgcggtcccccaggccgcgagegccgccccg96ThrAlaValProGinAlaAlaSerAlaAlaPro2530ggcctggcgaagcaggacaccctgcgctggaac144GluThrArgProProGlyLeuAlaLysGinAspThrLeuArgTrpAsn354045accccgaaggacttccgcateggcagegccgtggccggcggsggccac192ThrProLysAspPheArglieGlySerAlaValAlaGlyGlyGlyHis505560cacaccagegccgactacccggagcccttcccctecgaccccgagtac240HisThrSerAlaAspTyrProGluProPheProSerAspProGluTyr65707580cgctecgtcctggcgegg'gagttcagetecctgacccccgagaaccag288ArgSerValLeuAlaArgGluPheSerSerLeuThrProGluAsnGin859095atgaagtgggagttcatecaccccgaggagggggtctacgagttcggc336MetLysTrpGluPhelieHisProGluGluGlyValTyrGluPheGly100105110cccgcggacgacategtcgacttcgccgaggccaacgggcaggtcgtg384ProAlaAspA印lieValAspPheAlaGluAlaAsnGlyGinValVal115120125cgcggccacaccctgttctggcacagecagaaccccgactggetcgag432ArgGlyHisThrLeuPheTrpHisSerGinAsnProAspTrpLeuGlu130135140gaaggcgactacacccccgacgagctgcgcgccateetcaaggagcac480GluGlyAspTyrThrProAspGluLeuArgAlalieLeuLysGluHis145150155160atecacacggtggtcggccactscgagggccgcatecagcsgtggg3g528lieHisThrValValGlyHisTyrGluGlyArglieGinGinTrpGlu165170175gtcgccaacgagategtcgacgac3gcgggaacctgcgcctgcaggag576ValAlaAsnGlulieValAspAspSerGlyAsnLeuArgLeuGinGlu180185190atetggctgegggagctgggcccggagateategccgacatettc624AsnlieTrpLeuArgGlu'LeuGlyProGlulielieAlaAspliePhe195200205cgctgggcccacgaggccga_cccg肪cgcccagctgttcttcaacgac672ArgTrpAlaHisGluAlaAspProAsnAlaGinLeuPhePheAsnAsp210215220tacaacgtggagggcateaacgcgaagtecgacgcctactacgcgctg720TyrAsnValGluGlylieAsnAlaLysSerAspAlaTyrTyrAlaLeu225230235240atecaggacctgetcgcg.cagggcgtgccggtccacggcttcgggatg768lieGinAspLeuLeuAlaGinGlyValProValHisGlyPheGlyMet245250255cagacccacetcggcetccagtacggcttcgacgggcgcatgcagcag816GinThrHisLeuGlyLeuGinTyrGlyPheAspGlyArgMetGinGin260265270aacetccagcgcttcgacgacctggggctggagacggccgtcaccgag864AsnLeuGinArgPheAspAspLeuGlyLeuGluThrAlaValThrGlu275280285ategacgtccgcggaccggtcgacggcgacgaceggatgaccgacgag912lieAspValArgGlyProValAspGlyAspAspArgMetThrAspGlu290295300ctgcgcegg肌gcaggccgactggtaccgcacggccetcgaggcgtgc960LeuArgArgLysGinAlaAspTrpTyrArgThrAlaLeuGluAlaCys305310315320ctggccgtggaggactgc肌ctecttcaccgtgtggggcgtgetcgac1008LeuAlaValGluAspCysAsnSerPheThrValT卬GlyValLeuAsp325330335gagcactectgggtgccgaacaccttccccggctacggggacgccctg1056GluHisSerTrp340secatggagggcThrMetGluGly355ctgLeugagGlucacHis385gccAla370cccProgcgAlagtcValttcPheValProAsnThrPheProGlyTyrGly345gagcgc犯gccggcctacGluArgLysProAlaTyr360cccggcggcProGlyGlygeicAspcgcArgtacTyrtegSercgcArgcagGin375gacgcgAspAla380AspAlaLeu350gacAsp365aagLysgccAlatggTrpetcLeuGlucagGincacHis110411521170<210〉2<211>389〈212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichiablattae)〈400〉2MetSerArgArgAlaProLeuLeuArgAlaGlyAlaAlaThrAlaVal151015AlaAlaLeuCysLeuThrAlaValProGinAlaAlaSerAlaAlaPro202530GluThrArgProProGlyLeuAlaLysGinAspThrLeuArgTrpAsn354045ThrProLysAspPheArglieGlySerAlaValAlaGlyGlyGlyHis505560HisThrSerAlaAspTyrProGluProPheProSerAspProGluTyr65707580ArgSerValLeuAlaArgGluPheSerSerLeuThrProGluAsnGin859095MetLysTrpGluPhelieHisProGluGluGlyValTyrGluPheGlyProAlaAsp115ArgGlyHisThrLeuPhe100105AsplieValAspPheAlaGluAlaAsnGlu145lie130GlyTrp135120HisSerGinAsnPro140Gly125Asp110GinValValTrpLeuGluAspTyrThrProAspGluLeuArgAlalieLeuLysGlu150155HisThrValValGlyHisTyrGluArglieGinGinGly165170ValAlaAsnGlulieValAspAspSerGlyAsnLeuArgLeu180185190AsnlieTrpLeuArgGluLeuGlyProGlulielieAlaAspTrp175GinHis160GluGluliePheArgTyr225lieTrp210Asn—Ala195200205AlaHisGluAlaAspProAsnAlaGinLeuPhePheAsnAsp215220ValGluGlylieAsnAlaLysSerAspAlaTyrTyrAla230235GinAspLeuLeuAlaGinGlyValProValHisGlyPheLeu240MetGinThrHisGly245250255GlyLeuGinTyrGlyPheAspGlyArgMetGinGinLeu260265270AsnLeuGinArgPheAsp'AspLeuGlyLeuGluThrAlaValThrGlu275280285lieAspValArgGlyProValAspGlyAspAspArgMetThrAspGlu290295300LeuArgArgLysGinAlaAspTrpTyrArgThrAlaLeuGluAlaCys305310315320LeuAlaValGluAspCysAsnSerPheThrValTrpGlyValLeuAsp325330335GluHisSerTrpValProAsnThrPheProGlyTyrGlyAspAlaLeu340345350ThrMetGluGlyAspTyrGluArgLysProAlaTyrAspAlaLeuGin355360365GluAlaLeuValArgSerGinProGlyGlyAspAlaLysTrpGluHis370375380HisProAlaPheArg38权利要求1、一种耐碱、高活性的碱性木聚糖酶Kxyn基因，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、一种编码的耐碱、高活性的碱性木聚糖酶Kxyn基因，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所述。3、一种表达耐碱、高活性的碱性木聚糖酶Kxyn基因质粒的大肠杆菌(Eyc/^n'c/z/aco/t)DH5a/Mn22/6p/Kxyn，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCCNO:M208201号。全文摘要本发明属于基因工程
技术领域：
。具体涉及一种新的碱性木聚糖酶及其编码基因。本发明公开所述基因的序列及其编码区。包含该基因质粒的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α/Mn22/6p/Kxyn，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNOM208201。经过生物学验证，证明该木聚糖酶Kxyn具有强耐碱性和热稳定性，可专门降解木聚糖。本发明的木聚糖酶Kxyn可用于造纸等相关领域。文档编号C12N15/56GK101402964SQ20081019756公开日2009年4月8日申请日期2008年11月10日优先权日2008年11月10日发明者刘子铎,李婵娟,洪玉枝,邵宗泽申请人:华中农业大学