一种检测口蹄疫病毒基因组rna的单细胞实时荧光定量rt-pcr的方法

专利名称：：一种检测口蹄疫病毒基因组rna的单细胞实时荧光定量rt-pcr的方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR的方法，适用于在单细胞水平上研究口蹄疫病毒的复制，进而分析病毒的急性感染与持续性感染的机理，探究在感染过程中病毒与宿主细胞的关系。
背景技术：
：口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus:FMDV)属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，其所在的RNA病毒科在医学和兽医学上具有重要地位，该病毒主要引发偶蹄动物发生口蹄疫。基因组由一条正义的RNA链组成，约含8500个核苷酸，其复制经由一条互补的负链RNA作为模板。病毒感染其敏感细胞系(如仓鼠肾细胞系BHK-21或猪肾细胞系IB-RS-2)，宿主细胞会发生致细胞病变效应(CPE),表现为细胞变圆，内细胞膜重排等。除急性感染外，口蹄疫病毒还能在动物和细胞中建立持续性感染。基于口蹄疫病毒基因组的特点，现已建立了许多相关的检测方法包括杂交实验(Verheyden,B,Lauwers,S,etal.QuantitativeRT-PCRELISAtodeterminetheamountandratioofpositive-andnegative-strandviralRNAsynthesisandtheeffectofguanidineinpoliovirusinfectedcells.J.Pharm.Biomed.Anal[J],2003,33:303-308.)、常规RT-PCR(Hofmann,MA，Thiir，B,etal.Rescueofinfectiousclassicalswinefeverandfoot-and-mouthdiseasevirusbyRNAtransfectionandvirusdetectionbyRT-PCRafterextendedstorageofsamplesinTrizol[J].J.Virol.Methods,2000,87:29-39.)以及近年建立的实时荧光定量RT-PCR(King,DP,Ferris,NP,etal.Detectionoffoot-and-mouthdiseasevirus:comparativediagnosticsensitivityoftwoindependentreal-timereversetranscriptionpolymerasechainreactionassays[J].J.VetDiagn.Invest"2006,18:93-97;Horsington,J,Zhang,Z.Analysisoffoot-and-mouthdiseasevimsreplicationusingstrand-specificquantitativeRT-PCR[J].J.Virol.Methods,2007,144:149-155.)。与其他的检测方法相比，荧光定量RT-PCR技术优势明显，如灵敏度高、速度快、特异性强，可减少交叉污染等。然而所有的这些检测方法都是基于群体细胞的检测(组织块或细胞系)，所获得是群体细胞中病毒复制的数据，只能反映群体细胞中的病毒量而不能获悉单个细胞中病毒的感染及其复制情况。从上个世纪80年代末，生物学家们开始探索单细胞PCR和单细胞RT-PCR的可行性。1988年，Jeffrey等从单个人体细胞中扩增出了微卫星DNA，标志着单细胞PCR技术的建立(Jeffreys,AJ，Wilson,V，etal.Amplificationofhumanminisatellitesbythepolymerasechainreaction:towardsDNAfingerprintingofsinglecells[J].Nucleic.Acids.Res.，1988，16:10953-10971.)。近几年荧光定量PCR技术又被成功的用于检测单个神经元细胞中的基因以及研究胚胎发育细胞(Rice，JE,Sanchez,JA,etal.Real-timePCRwithmolecularbeaconsprovidesahighlyaccurateassayfordetectionofTay-Sachsallelesinsinglecells[J].Prenat.Diagn.,2002,22:1130-1134;Pierce,KE,Rice,JE,etal.Detectionofcysticfibrosisallelesfromsinglecellsusingmolecularbeaconsandanovelmethodofasymmetricreal-timePCR[J],Mol.Hum.Reprod.，2003,9:815-820)等。Wagatsuma等(Wagatsuma,A,Sadamoto,H，etal.DeterminationoftheexactcopynumbersofparticularmRNAsinasinglecellbyquantitativereal-timeRT-PCR[J].J.Exp.Biol"2005,208:2389-2398.)利用实时荧光定量RT-PCR技术检测单个蛇脑巨细胞中环AMP应答元件结合蛋白(英文名称CREB)的量，成功解决单细胞RT-PCR的两大难题。首先，他们用激光切割术分离体细胞后用膜片钳吸液术将细胞内含物吸出，并成功地从单个细胞中提出mRNAs;其次，选用高灵敏度的荧光定量RT-PCR技术代替核酸杂交和竞争性PCR进行基因检测，能够检测微量的目标基因，特别适合于单细胞的定量分析。但是其分离单细胞技术存在一定的问题，因为膜片钳技术不能保证完全能把细胞内含物吸出而激光切割术也不能避免周围其他非巨细胞的污染。Parhar等(Parhar,IS,Ogawa,S,etal.Single-cellreal-timequantitativepolymerasechainreactionofimmunofluorescentlyidentifiedneuronsofgonadotropin陽releasinghormonesubtypesincichlidfish[J].Endocrinology,2003,144:3297-3300)利用实时荧光定量方法同时检测单个鱼神经元细胞中的促性腺激素释放激素的三个亚型首先他们用连接在荧光显微镜上的显微操纵仪分离单个神经元细胞，利用负压将单个细胞转入装有50nl细胞裂解液的1.5ml离心管中，冻入-8(TC;再将分离出来的单细胞样品进行蛋白消化和DnaseI酶解，用ISOGEN和RNA提取试剂盒提取细胞总RNA;最后将提取的细胞RNA分步进行RT与PCR。用连接在显微镜上的显微操纵仪分离细胞具有可监控性、快速、易操作等优点，可以完全监控整个分离的过程，而其裂解细胞的过程确保无细胞蛋白和DNA污染，并且能完全释放细胞RNA，使得后续的反转录和扩增反应有高纯度的模板。该技术缺点也比较明显，即裂解细胞歩骤较多并且从分离单细胞到进行定量PCR反应之间操作步骤繁琐，会造成RNA的降解从而非真实地反应原细胞目的基因的拷贝数。另外，两步法(two-step)实时荧光定量RT-PCR也在一定程度上增加了反应时间和误差几率。总而言之，迄今单细胞荧光定量PCR技术还未被应用于检测感染细胞中的病毒的基因拷贝数，因此能否将之用于检测感染细胞中携带的病毒量是我们所关注的科学问题。
发明内容本发明的目的在于提供了一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR方法，包括了分离和裂解单细胞技术以及实时荧光定量RT-PCR技术，该方法能实现单细胞水平上的病毒复制及其与宿主细胞关系的研究，为阐明病毒复制机制及探究病毒持续感染的成因等提供了一种新的技术手段。该方法还具有操作简便、快速、稳定性高、灵敏度高等特点，为研究病毒与宿主细胞关系提供了新的技术支持。另外，分离细胞和裂解细胞的技术具有广泛适用性、能用于任何其他细胞(悬浮细胞与贴壁细胞)的分离与预处理，为在单细胞水平上进行的各种研究奠定基础。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR的方法，其歩骤是A、单细胞的分离与裂解a、病毒感染用50100PFU滴度的口蹄疫病毒感染单层BHK-21细胞，1836h后，用胰酶将细胞消化，加入610倍于胰酶量的新鲜MEM生长培养基灭活胰酶，充分分散细胞，调整细胞浓度至104106个/1111，最后，取lml细胞悬液于直径6cm的无菌培养皿中，进行单细胞分离；b、分离单细胞分离单细胞需用到以下技术措施a)拉针器，b)磨针仪，c)显微注射仪，d)细胞储液，其特征是用拉针器和磨针仪制作精细的细胞挑针，通过与显微注射仪连接的倒置显微镜可直接观察到待分离的细胞并能随时监控整个分离挑取单细胞的过程，准确快速地获得所需的单细胞样品(60min内约可挑选分离3565个单细胞样品)。具体实施步骤是首先将细胞挑针与显微操纵仪的右导管相连，调节显微注射仪的平衡(balance)旋钮使提供的平衡压减小(即表现为毛细管向内吸液)，然后再将挑针前端伸入培养皿中至液面下，在显微镜下挑取单个细胞。挑起一个单细胞后，将带有单细胞的挑针提起伸入PCR管液面下，增大平衡压，将细胞送入PCR管内的细胞储液中。c、细胞裂解每30min60min处理一批单细胞样品，以在裂解细胞前最大限度维持细胞原状(60min内约可挑选分离3565个单细胞样品)。单细胞样品于94T:98'C热变性28min(可在水浴中变性也可在PCR仪中变性)后，迅速浸入液氮中，用蛋白酶K于53'C消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min为避免病毒衣壳蛋白和细胞蛋白对逆转录的影响，蛋白酶解后立刻冻入液氮中直至进行荧光定量RT-PCR反应。B、荧光定量RT-PCR:荧光定量RT-PCR采用一步法扩增(One-stepRT-PCR)，即在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖一步完成，减少加样误差和交叉污染，特别是对单细胞样品而言减少操作步骤无疑有利于精确定量。另外用已知浓度的体外转录RNA作为标准品建立标准曲线，使定量结果更准确、直接，避免了用DNA为标准品时逆转录效率不稳定，而影响定量的准确性。其具体步骤如下首先是一步法荧光定量反应液(反应总体积是50)il):2Xbuffer25^1,正义引物FP和反义引物RT各2pl(25(imol/L)，25pmol/L的荧光探针0.5nl，反转录和热启动TaqDNA聚合酶lpl，RNA酶抑制剂(40U/pl)1^1，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5^1，标准品或待测的单细胞样品均为5pl，无RNase的灭菌双蒸水13pl组成。荧光探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。其次是反应条件如下cDNA合成50°C30minPCR:95。C5min94°C30s，60°C90s}45cycles在每个循环第二步结束时进行荧光检测(即6(TC90s后采集荧光信号)。对口蹄疫病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，ThresholdCycle)相比较以标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。第三是细胞总RNA的提取，将感染FMDV1836h后的BHK-21细胞离心收集起来，加入裂解液(Trizol，购自Invi加gen)400pl充分混匀，室温(20-25。C以下相同)静置10min，加80pl氯仿，室温静置3min，于4。C12000g/min离心15min，上清液转移到另一个离心管中，力B200nl异丙醇，室温沉淀10min，4'C12000g/min离心10min，弃上清，力卩lml75X乙醇充分洗涤沉淀，于4。C7500g/min离心5min，弃上清，沉淀RNA并在室温下自然干燥，加无RNase水10[il于6(TC10min溶解，置-7(TC保存。该RNA作为单细胞荧光定量PCR的阳性对照。第四是取48个不同稀释度的标准品，12个第三步所提的RNA作为阳性对照，若干个单细胞样品，24个阴性对照按照第一步所列出的配制反应液，而后进行荧光定量PCR反应。采用单细胞实时荧光定量方法检测，可以获得有关病毒感染与复制的数据并解释说明其中一部分现象，例如在病毒感染过程中是否每个细胞都被感染上了(即检测为阳性的细胞)；在病毒感染过程中每个细胞中所携带的病毒量是否相同或差异显著；细胞中携带的病毒量是否存在极限等等。这些直观的数据进一步揭示病毒与宿主细胞的关系以及病毒感染机制等。在本发明的一个具体方案中，配套使用拉针器与磨针仪制备分离单细胞所需的精细细胞挑针，所述的细胞挑针用拉针器和磨针仪制作的步骤是将无芯的外径为1.0mm的玻璃管置于拉针器的中间部，温度调至6064'C，使用一步法加热(旋钮调至"一步法"键)，打开开始键，由于重力作用，可使加热的吸管拉长变细成两根吸管，即制成粗细胞吸管；粗细胞挑针经磨针仪打磨至尖端部直径略大于细胞直径(20~100nm)，即制成分离单细胞所需的精细细胞挑针。在本发明的一个具体方案中，采用与显微注射仪连接的显微操纵仪半手动进行单细胞分离工作，整个分离过程都是在显微镜视野下观测完成的，以避免分离单细胞不成功或分离出多于一个细胞等类似情况的出现，准确而快速地分离所需细胞，挑取出的单个细胞直接转入装有细胞储液的PCR管中，半个小时内完成单细胞的裂解。在本发明的一个具体方案中，细胞储液选用0.9。/。NaCl(加入2U/ialRNase抑制剂)，0.9%NaCl(与水相比较)可增加细胞的渗透压便于在热变性的过程中细胞膜破裂完全，加入RNase抑制剂抑制RNase的活性，尽可能减少在分离和预处理过程中RNA的降解。在本发明的一个具体方案中，采用直接裂解法，热变性使细胞膜破裂蛋白质变性，再用蛋白酶消化除去蛋白对逆转录反应的影响，避免加入任何的化学试剂(如裂解液、碱等)裂解细胞以增加反应步骤和污染、降解RNA的机率。在本发明的一个具体方案中，采用94°C~98°C热变性28min热变性使宿主细胞膜破裂，释放出其内含物，随后立即浸入液氮中降低RNA降解的可能性，最后选用蛋白酶K在53°。消化蛋白40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣壳蛋白和细胞蛋白对逆转录的影响。在本发明的一个优选方案中，采用一步法荧光定量RT-PCR，即在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖使反应一步完成，对于处理大量单细胞样品而言，一歩法省时且易于操纵，更可减少加样误差和交叉污染；荧光定量反应的引物序列分别为正义引物(FP)5，-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3'，反义引物(RT)5'-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3'，扩增子大小为121bp，荧光探针序列为5，FAM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3，。在本发明的一个优选方案中，标准阳性RNA模板由含有插入目的片段的pGEM-Teasy(购自PROMEGA公司)载体体外转录制备，转录后RNA于紫外分光光度计测A26o定量并10倍梯度稀释。检测所用的标准品制备过程如下PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用Omega公司的凝胶回收试剂盒回收纯化，与pGEM-Teasy载体4'C过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR鉴定阳性后送博亚生物工程有限公司测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆菌接种到含氨苄青霉素的LB培养基培养过夜，用Omega公司的质粒提取试剂盒制备质粒DNA，Qiagen公司的纯化试剂盒纯化后，NcoI酶切后，并利用SP6启动子(根据测序结果)体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀纯化后于紫外分光光度计测A26o定量，并稀释至梯度10^10i拷贝/1(^1，-7(TC保存，转录所用一切物品均需无RNA酶处理。在本发明的一个具体方案中，荧光定量反应液由2Xbuffer溶液25pl，25nmol/LiH义(FP)、反义(RT)引物各2nl，25pmol/L荧光探针0.5^1,反转录和热启动TaqDNA聚合酶lnl，RNA酶抑制剂lpl，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5pl，无RNA酶的灭菌双蒸水13pl组成。其中荧光探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记以荧光淬灭基团TAMRA。在本发明提供的制作精细细胞挑针的方法中，针对显微注射仪和BHK-21细胞的特点进行了一系列的优化，反复实验，以及与传统的制作玻璃管的方法相比较，建立了一套制作精细细胞挑针的方法。具体如下外径1.0mm的无芯管与显微操纵仪相配套，采用半自动的拉针器代替手动拉制毛细管，选用6064'C的加热温度恰好能拉断玻璃管又不至于使玻璃管前端部过短，制作出均匀细长并有一定弯度的吸管，再经磨针仪微微打磨成直径略大于细胞直径的精细细胞挑针。与传统的酒精喷灯手动拉制相比，拉针器半自动制作能更快更均一地拉制品质等同的毛细管，避免出现毛细管拉不断，温度不均一造成毛细管使用不便等情况。此外，拉针器还具有操作简便，易上手等特点，便于使用。在本发明提供的分离单细胞的方法中，基于现有的一些分离方法的比较和优化，采用与显微注射仪连接的显微操纵仪半手动分离单细胞，使用显微注射仪平衡压的功能，利用微毛细管内的压差吸入或排出液体从而实现分离单个细胞的目的。本发明提供的检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞荧光定量RT-PCR的方法是首次将单细胞荧光定量PCR技术与检测病毒基因组RNA相结合，将在单细胞水平上研究病毒的复制及其与宿主细胞的关系变为可能，为病毒基因组复制、转录的研究提供了一种新的手段，并进一步完善了病毒学研究的方法。与现有一些单细胞分离处理技术和荧光定量PCR相比具有以下的优点和效果1.与现有的一些分离单细胞的方法(流式细胞仪分选，膜片钳技术等)相比，本发明中提供的显微操纵仪分离法具有可视化操作、快速、高效、适用性广等特点，分离后即转入细胞储液当中进行预处理，大大减少操作步骤，最大限度地维持细胞原状(减少细胞核酸降解)使得定量结果更为准确可靠。2.与现有的一些细胞裂解法(碱裂解法、反复冻融法、加入裂解试剂法等)相比，本发明中提供的细胞裂解法具有操作步骤少而简单、无须加入额外试剂或需中和裂解等优点，并且经实验证实裂解过程既不会造成RNA降解又能使细胞完全裂解致RNA释放。3.与两步法荧光定量RT-PCR相比，本实验采用的一步法扩增，在处理大量重复样品时易于操作，在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖，因而有助于减少交叉污染、加样误差和小量样品的损失，便于进行单细胞水平的样品检测与定量。灵敏度高，最低可检测至10copies，检测范围更可以达到九个数量级，是很多其他的定量方法所不能比拟的。图l荧光定量RT-PCR反应所获得的标准曲线，表明该定量检测的范围为101109，且线性非常好。线性方程为copynumber=10(—()，CT+11629)，其斜率为-3.497，112值为0.9999。图2单细胞常规RT-PCR的凝胶电泳图。(具体说明见实例3)M，Marker,泳道14为一个单细胞样品的不同稀释度结果；泳道l:五分之一的细胞量；泳道2为五十分之一的细胞量；泳道3为五百分之一的细胞量；泳道4为五千分之一的细胞量，泳道5为阴性对照。具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D丄.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；F.M.奥斯伯等主编，科学出版社，2005，精编分子生物学实验指南，或按照制造厂商建议的条件。实施例l单细胞荧光定量RT-PCR检测急性感染细胞中口蹄疫病毒基因组RNA的拷贝数一、实验试剂与仪器A)试剂a)胰酶、MEM培养基、胎牛血清(均购自Invitrogen公司)b)细胞储液每管含有5~10pl0.9%NaCl，分装于PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制剂(分别购自Amesco和TAKARA公司)e)—步法反应试剂盒(包括反转录酶和热启动TaqDNA聚合酶以及buffer)、牛血清蛋白、RNase抑制剂、无RNase的水。前两者购自Invitrogen公司，后两者购自TAKARA公司。f)RT、FP引物，探针(Invitrogen公司合成)g)Trizol细胞裂解液(购自Invitrogen公司)B)仪器a)显微注射仪(购自Narashige公司)b)荧光定量PCR仪(购自Eppendorf公司)c)PCR仪(购自Biometra公司)d)冷冻离心机(购自Eppendorf公司)二、具体实施步骤如下A)单细胞的分离与裂解a)病毒感染用50100PFU(PFU:蚀斑形成单位)滴度的口蹄疫病毒感染单层BHK-21细胞，约18或20或24或26或29或32或34或36h后，用胰酶将细胞消化下来，加入IO倍于胰酶量的新鲜MEM生长培养基灭活胰酶，调整细胞量至约104106个/1111。最后，取lml至直径6cm的培养皿中(市售)，即可进行单细胞分离。b)分离单细胞将精细细胞挑针与显微操纵仪的右导管相连，调节显微注射仪的平衡(balance)旋钮使提供的平衡压减小(即表现为毛细管向内吸液)，再将挑针前端伸入培养皿中至液面下，用操作仪控制，在显微镜下挑取单个细胞。挑起一个单细胞后，将带有单细胞的挑针提起伸入PCR管液面下，增大平衡压，将细胞送入PCR管内的细胞储液中。c)细胞裂解每30或34或38或42或47或50或53或57或60min处理一批单细胞样品，以在裂解细胞前最大限度维持细胞原状。单细胞样品于94'C98'C热变性2或4或6或8min后，迅速浸入液氮中，用lpg的蛋白酶K(加入2U4aRNase抑制剂)于53。C消化40或45或49或54或58或63或68或72或75min以避免病毒衣壳蛋白和细胞蛋白对逆转录的影响，蛋白酶解后立刻冻入液氮中直至进行荧光定量RT-PCR反应。B)荧光定量RT-PCR首先是一步法荧光定量反应液(反应总体积是50nl):2Xbuffer25^1，正义引物FP和反义引物RT各2pl(25pmol/L)，25^imol/L的荧光探针0.5pl，反转录和热启动TaqDNA聚合酶lpl,RNA酶抑制剂(40U尔l)lpl，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5^1，标准品或待测的单细胞样品均为5pl，无RNase的灭菌双蒸水13pl组成。荧光探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。其次是反应条件如下cDNA合成50°C30minPCR:95。C5min94°C30s，60°C90s}45cycles在每个循环第二步结束时进行荧光检测(即60'C90s后采集荧光信号)。对口蹄疫病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，ThresholdCycle)相比较，并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。第三是细胞总RNA的提取将感染FMDV18或21或25或28或32或34或36h后的BHK-21细胞离心收集起来，加入裂解液(Trizol，购自Invitrogen)400pl充分混匀，室温静置10min，加80pl氯仿，室温静置3min，于4。C12000g/min离心15min，上清液转移到另一个离心管，力B200(il异丙醇，室温沉淀10min，4'C12000g/min离心10min，弃上清，力口lml75X乙醇充分洗涤沉淀，于4。C7500g/min离心5min，弃上清，沉淀RNA并在室温下自然干燥，加无RNase水10^于6(TC10min溶解，即放入-70°C保存。将该RNA作为单细胞荧光定量PCR的阳性对照。第四是取4个不同稀释度的标准品，一个第三步所提的RNA作为阳性对照，48个单细胞样品，2个水作为阴性对照按照第一步所列出的配制反应液，而后进行荧光定量PCR反应。反应结果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>以上结果表明在口蹄疫病毒急性感染过程中，并不是每个细胞都被病毒感染(即检测结果为阳性细胞)，细胞的阳性率为83.33%，且细胞中的病毒RNA拷贝数差异较大(从十几到几十万拷贝数不等)。该实例很好的证实了单细胞荧光定量RT-PCR可以成功地应用于检测细胞内病毒量，且灵敏度可检测1Ocopies。注荧光定量RT-PCR在10、10^/r有极好的线性关系，R2=0.9998，其检测范围可以达到九个数量级，灵敏度可检测至10copies，且重复性很好。实施例2单细胞荧光定量RT-PCR检测持续性感染细胞中口蹄疫病毒基因组RNA的拷贝数一、材料A)持续性感染口蹄疫病毒的BHK-21细胞的获得用弱碱法建立持续性感染细胞(口蹄疫病毒持续性感染细胞系的快速选择及其特性研究顾潮江，中国病毒学，第18巻第5期2003)。B)试剂与仪器a)胰酶、MEM培养基、胎牛血清(均购自Invitrogen公司)b)细胞储液每管装有510i^l0.9y。NaCl，分装于PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制剂(分别购自Amesco和TAKARA公司)e)—步法反应试剂盒(包括反转录酶和热启动TaqDNA聚合酶以及buffer)、牛血清蛋白、RNase抑制剂、无RNase的水。前两者购自Invitrogen公司，后两者购自TAKARA公司。f)RT、FP引物，探针(Invitrogen公司合成)g)Trizol细胞裂解液(购自Invitrogen公司)h)显微注射仪(购自Narashige公司)i)荧光定量PCR仪(购自Eppendorf公司)j)PCR仪(购自Biometra公司)k)冷冻离心机(购自Eppendorf公司)二、实验方法及具体步骤A)单细胞的分离与裂解持感细胞传代至第25代，加入胰酶消化3或4或5或6min，再加入610倍于胰酶量的新鲜MEM生长培养基灭活胰酶，调整细胞浓度至约104106个/1111。取lml至直径6cm的培养皿中，立刻进行单细胞分离。将细胞挑针与显微操纵仪的右导管相连，调节显微注射仪的平衡(balance)旋钮使平衡压减小(即表现为毛细管向内吸液)，再将挑针前端伸入培养皿中至液面下，用操作仪控制，在显微镜下进行单细胞分离。挑起一个单细胞后，将挑针提起伸入PCR管液面中，增大平衡压，将细胞转入PCR管内的细胞储液中。每30或32或37或41或45或49或52或56或60min处理一批单细胞样品，以在裂解细胞前最大限度维持细胞原状。单细胞样品于94'C98'C热变性2或4或6或8min后，迅速浸入液氮中，用lpg的蛋白酶K(加入2U尔1RNase抑制剂)于53'C消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣壳蛋白和细胞蛋白对逆转录的影响，蛋白酶解后立刻冻入液氮中直至进行后续荧光定量RT-PCR反应。B)荧光定量RT-PCR首先是一步法荧光定量反应液(反应总体积是50pl):2Xbuffer25ul，正义引物FP和反义引物RT各2ul(25umol/L)，25umol/L的荧光探针0.5ul，反转录和热启动TaqDNA聚合酶lul，RNA酶抑制剂(40U4d)1ul，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5ul，标准品或待测的单细胞样品均为5ul，无RNase的灭菌双蒸水13ul组成。荧光探针5'端标记的荧光报告基团是FAM,3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。其次是反应条件如下cDNA合成50°C30minPCR:95°C5min94°C30s，60°C90s》45cycles在每个循环第二步结束时进行荧光检测(即60'C90s后采集荧光信号)。对口蹄疫病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，ThresholdCycle)相比较，并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。第三是细胞总RNA的提取将25代的持感细胞离心收集起来，加入裂解液(Trizol，购自Invitrogen)400(xl充分混匀，室温静置10min，加80nl氯仿，室温静置3min，于4。C12000g/min离心15min,上清液转移到另一个离心管，力卩200pl异丙醇，室温沉淀10min，4。C12000g/min离心10min，弃上清，力Blml75%乙醇充分洗涤沉淀，于4。C7500g/min离心5min,弃上清，沉淀RNA并在室温下自然干燥，加无RNase水10pl于60。C10min溶解RNA，即放入-70。C保存。将此RNA作为单细胞荧光定量RT-PCR的阳性对照。第四是取4个不同稀释度的标准品，一个第三步所提的RNA作为阳性对照，26个单细胞样品，2个水作为阴性对照按照第一步所列出的配制反应液，而后进行荧光定量PCR反应。反应结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以上数据表明持续感染细胞中所携带的病毒量大大低于急性感染细胞中的病毒量，这也许是病毒能与细胞共存的原因。该实例证明了单细胞荧光定量PCR技术可以被应用于检测少量目的片段，具备了很高的灵敏度，并且便于操作。注荧光定量RT-PCR在10、10k/r有极好的线性关系，R2=0.9999，其检测范围可以达到九个数量级，灵敏度可检测至10copies,且重复性很好。其它实施步骤与实施例l相同。实施例3分离与裂解单细胞技术在单细胞RT-PCR中的应用一、试剂与仪器a)胰酶、MEM培养基、胎牛血清(均购自Invitrogen公司)b)细胞储液每管装有510nl0.9n/。NaCl，分装于PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制剂(分别购自Amesco和TAKARA公司)e)RT反应液M-MLV反转录酶、5X缓冲液、dNTP、RNase抑制剂。前两者购自Promega公司，后两者购自TAKARA公司。f)PCR反应液PremixTaq酶，无菌水。购自TAKARA公司。g)RT、FP引物(Invitrogen公司合成)h)显微注射仪(购自Narashige公司)i)PCR仪(购自Biometra公司)二、实验方法及具体步骤A)单细胞的分离与裂解将培养在T-25瓶中的BHK-21细胞消化下来，即加入胰酶消化3或4或5或6min，再加入610倍于胰酶量的新鲜MEM生长培养基灭活胰酶，调整细胞浓度至约10"10MVml。最后，取lml至直径6cm的培养皿中，立刻进行单细胞分离。将细胞挑针与显微操纵仪的右导管相连，调节显微注射仪的平衡(balance)旋钮使平衡压减小(即表现为毛细管向内吸液)，再将挑针前端伸入培养皿液面下，用操作仪控制，在显微镜下进行单细胞分离。挑起一个单细胞后，将挑针提起伸入PCR管液面中，增大平衡压，细胞转入PCR管内的细胞储液中。每30或33或37或41或46或49或52或56或60min处理一批单细胞样品，以在裂解细胞前最大限度维持细胞原状。单细胞样品于94'C98'C热变性28min后，迅速浸入液氮中，用1吗的蛋白酶K(加入2U/nlRNase抑制剂)于53T:消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣壳蛋白和细胞蛋白对逆转录的影响，蛋白酶解后立刻冻入液氮中直至进行RT-PCR反应。B)常规RT-PCR将单细胞的分离与裂解技术应用于常规RT-PCR，该反应的耙基因为持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(英文简称GAPDH)的mRNA，引物序列为正义引物是5'-TGGCAAGTTCAAAGGCACA-3，，反义引物是5，-AGATCCACGACGGACACG-3，，扩增子大小为576bp。反应为两步法，第一步是反转录反转录反应液包括5Xbuffer5^1，反义引物RTl[il(25拜ol/L)，反转录酶lpl，RNA酶抑制剂(40，)ljil，10mMdNTP1^1，待测的单细胞样品为lnl，无RNase的灭菌双蒸水15pl组成。反转录的条件如下42'C温育反应50min，98'C灭活反转录酶1530min。第二步是PCR，PCR的反应体系为50W由2Xbuffer25W，正义引物FP和反义引物RT各lpl(25pmol/L)，反转录产物2pl，无菌水21pl组成。PCR条件如下95。C2min95°C40s，55°C30s^45cycles72。C2min_J72°ClOtnin将A)中分离裂解的单细胞样品进行10倍稀释(从2xl0"至2x10—4)共四个样品，将水作为阴性对照，进行RT-PCR，反应结果如附图2。其它实施步骤与实施例l相同。以上结果表明单细胞RT-PCR反应的灵敏度高达五百分之一的细胞量，也就是说能完全应用于检测一个细胞基因组中的mRNA。同时，也证实了单细胞分离与裂解技术成功应用于正常BHK-21细胞中mRNA的定性检测。权利要求1、一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR方法，其步骤是A、单细胞的分离与裂解a、病毒感染用50～100PFU滴度的口蹄疫病毒感染单层BHK-21细胞，18～36h后，用胰酶将细胞消化，加入6～10倍于胰酶量的新鲜MEM生长培养基灭活胰酶，分散细胞，调整细胞浓度至104～106个/ml，最后，取1ml细胞悬液于直径6cm的无菌培养皿中，进行单细胞分离；b、分离单细胞分离单细胞采用a)拉针器，b)磨针仪，c)显微注射仪，d)细胞储液，用拉针器和磨针仪制作细胞挑针，通过与显微注射仪连接的倒置显微镜直接观察待分离的细胞并能随时监控整个分离挑取单细胞的过程，用细胞挑针挑起单细胞后，直接提起伸入PCR管液面下，完成将单细胞送入PCR管内的细胞储液全过程；c、细胞裂解每30～60min处理单细胞样品，单细胞样品于94℃～98℃热变性2～8min后，浸入液氮中，用蛋白酶K于53℃酶解40-75min，随后冻入液氮中直至进行荧光定量RT-PCR反应；B、荧光定量RT-PCR一步法荧光定量反应液，反应总体积是50μl，2×buffer25μl，正义引物FP和反义引物RT各2μl，25μmol/L的荧光探针0.5μl，反转录和热启动TaqDNA聚合酶1μl，RNA酶抑制剂1μl，牛血清蛋白0.5μl，标准品或待测的单细胞样品5μl，无RNase的灭菌双蒸水13μl组成，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA；反应条件如下cDNA合成50℃30minPCR95℃5min细胞总RNA的提取，将感染口蹄疫病毒18～36h后的BHK-21细胞离心收集，加入裂解液400μl混匀，室温静置10min，加80μl氯仿，室温静置3min，于4℃12000g/min离心15min，上清液转移到另一个离心管内，加200μl异丙醇，室温沉淀10min，4℃12000g/min离心10min，弃上清，加1ml75％乙醇充分洗涤沉淀，于4℃7500g/min离心5min，弃上清，沉淀RNA并在室温下自然干燥，加无RNase水10μl于60℃10min溶解，放入-70℃保存；取4～8个不同稀释度的标准品，1～2个细胞总RNA作为阳性对照，2～4个阴性对照按照前面所列出的配制反应液，进行荧光定量PCR反应。2、根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR方法，其特征是所述的正义引物5'-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3，，反义引物5'-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3'，扩增子大小为121bp，荧光探针序列为5，FAM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3，，探针的5'端标记荧光发射基团FAM，靠近3'端标以荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性RNA模板由己插入口蹄疫病毒基因组3D区121bp基因片段的pGEM-T载体转化大肠杆菌DH5ct，增殖后提取质粒进行体外转录制备RNA，并于紫外分光光度计测A260值定量并10倍梯度稀释。3、根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR方法，其特征是所述的细胞挑针用拉针器和磨针仪制作的步骤是将无芯的外径为1.0mm的玻璃管置于拉针器的中间部，温度调至6064'C，使用一步法加热，打开开始键，重力作用，使加热的玻璃管拉长成两根均匀细长吸管，即制成粗细胞挑针；粗细胞挑针经磨针仪打磨呈弯度且尖端部直径大于细胞直径20100pm。全文摘要本发明公开了一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR方法。该方法利用显微注射仪分离感染口蹄疫病毒的单个细胞，裂解后即用荧光定量RT-PCR进行定量分析。显微注射仪的可视化操作能快速准确地分离单个细胞，与高灵敏度的荧光定量RT-PCR相结合可实现检测单个细胞内病毒基因组RNA的量。该方法可用于在单细胞水平上研究病毒的复制及其与宿主细胞的关系，为病毒感染细胞生物学的深入研究提供一种新的方法。且分离与裂解细胞的技术具有广泛适用性，可直接应用于其它种类病毒感染的细胞或正常细胞的分离预处理，使得本发明的方法也能用于其它RNA病毒基因组检测和正常细胞基因组复制及转录的分子机制研究。文档编号C12Q1/70GK101386893SQ20081019741公开日2009年3月18日申请日期2008年10月28日优先权日2008年10月28日发明者屈三甫,勇李,郑从义,璇黄申请人:武汉大学