专利名称：：与猪肉质性状系水力相关的分子标记克隆及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于猪的分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与肉质性状中系水力相关的分子标记的克隆及应用。猪经济性状的遗传基础十分复杂，国际上动物遗传育种领域的科学家和研究人员已经开展了大量的研究工作，但功能基因的鉴定及能用于育种实践的分子标记还十分有限；20世纪80年代以来，分子标记研究取得飞速发展，形成了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种方法相结合，大大提高了猪的育种效率。肉质性状主要包括肌肉pH值、肌内脂肪含量、大理石纹、系水力、剪切力、肉色、嫩度、肌纤维直径等指标。其中系水力是指当肌肉受到外力作用时保持其原有水分和添加水分的能力，常用滴水损失或失水率来衡量肌肉的系水力。肌肉系水力不仅关系到肉品的质地、风味和组织状态，而且具有重要的经济价值。例如，2000年我国猪肉产量4031.4万吨，如果因系水力不良造成多损失1%重量，则将损失40,31万吨食肉。据报道，美国仅肌肉系水力下降一项每年约损失l万吨肉，因此，无论养猪生产者、屠宰厂、加工业、贮存、运输和销售业都非常重视这类性状。但是由丁-系水力等肉质性状是一类活体难丁-度量的性状，因此对这类性状的改良一直是遗传改良T.作的难点，若通过寻找可用的分子标记进行标记辅助选择，将会加快肉质性状的改良速度。目前发现与猪肉质性状相关的的QTL儿乎分布于猪的所有染色体上，通过功能候选基因法或位置克隆的策略筛选了一些与肌肉品质相关的分子标记。目前已发现许多与肌肉品质存在显著相关的基因，如/I77基因(Fujii,J等,Identificationofamutationinporcineryanodinereceptorassociatedwithmalignanthyperthermia.&;ece，1991，253:448-451)，研究表明该基因的C1843T错义突变可以导致猪产生应激综合症而发生肌肉品质的下降。(2)il脇GJ基因(Milan,D等，AmutationinPRKAG3associatedw他excessglycogencontentinpigskeletalmuscle.Scfe"ce,2000,288:1248-1251)，研究表明该基丙的一个突变是导致汉普夏猪产生"酸肉"的主要原因。目前已有多个与肉质性状紧密连锁的功能基因分子标记被发现并申请专利Rothschild等发现基因与肉质性状中的嫩度关联并在猪肉质性状改良中进行标记辅助选择应用(专利号US,WO2003060151-A2);Rothschild等检测了与肌肉生长和肉质性状相关的C/QW，SCJW"/p/w,ZZW冲to三个基因的变异，为猪育种提供了分子标记(专利号US,WO2004081194-A2);Gerbens等发现//-MM基因的变异与肌内脂肪含量相关(专利号EP,W09735878-A);Kojima等发现pi五/，i基因的变异能提高猪的产肉量(专利号US,WO2005017204-A2)等。M45Ti是Creemers等人在2006年研究Myocardin(MTOCD)基因的功能时发现的'DNA分子中含有SAP结构域和MEF2结合序列，其中SAP结构域是一个由33个氨基酸残基形成的保守模序；MEF2结合序列是MEF2的共激活物，和Myocardin家族同属于含SAP结构域转录因子家族。目前对该基因的研究主要集中在非洲蟾蜍属和小鼠，Esther等(2006)研究发现雄S77基因可以通过增加内源性MEF2的活性
背景技术：
：进而增强肌形成(Esther等CoactivationofMEF2bytheSAPDomainProteinsMyocardinandMASTR.Mo/CW/.2006,23(1):83-96)。在非洲蟾蜍属中，M4S77在早期骨骼肌中呈特异性表达，MASTR和MYOD、MYF5共表达协同激活一些肌肉分化(marker)基因的表达，是胚胎期肌肉基因表达所必须的(Stiyder等Themyocardin-relatedtranscriptionfactor,MASTR,cooperateswithMyoDtoactivateskeletalmusclegeneexpression.TW^S,2008,105(5):1545-1550)。另外，MASTR基因参与MRF4、MEF2D和myocardin蛋白的功能，这些蛋白在调控肌肉发育和生理学中起着重要作用。本专利申请者将猪M4SJK基因定位于猪6号染色体上SSC6qll-q21。目前报道猪的6号染色体上存在有多个与肌肉品质相关的QTL，其中与系水力相关的QTL有6个(G.Yue等LinkageandQTLmappingforSusscrofachromosome6.JAnimBreedGenet.,2003,120(1);45-55)。另外，EllenMarkljung等研究发现，在6号染色体的51-69cM区域存在有影响滴水损失的QTL(EllenMarkljung等，Genome-wideidentificationofquantitativetraitlociinacrossbetweenHampshireandLandraceII:Meatqualitytraits.SMCGe""!'".2008，9:22。通过以上研究结果我们可以得出M4S7K基因在肌肉发育过程中发挥重要作用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了猪M4S77基因的克隆和SNP筛査、基因型检测及与性状关联分析。
发明内容本发明的目的在于克隆一种作为猪标记辅助选择的与肉质性状系水力相关的分子标记，为猪标记辅助选择提供有用的分子标记。本发明通过以下技术方案实现利用比较基因组方法根据人的MASTR基因序列信息克隆猪MASTR基因，获得其编码区序列，在编码区筛査SNP并建立检测方法，在已经建立的试验群体中检测MASTR基因型并进行基因型-性状间关联分析，得到SNP与性状间的关联结果。申请人通过克隆得到一种与猪肉质性状系水力相关的MASTR基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所述。序列表SEQIDNO:1的400bp处有1个C400-T400的碱基突变，导致MspARFLP多态性。制备了检测上述序列表SEQIDNO:1基因片段突变的引物对，所述的引物对的正向引物为5'-CCTCACTTTCCCGCATCTTC-3',反向引物为5'-GCTCCCTATTCTTCCTTTCCAG-3'。利用上述制备的与猪肉质性状系水力相关的分子标记对外来猪和中国地方猪进行了关联分析的应用，从而完成了本发明。(1)猪M45TR基因片段cDNA序列的获得。禾拥人M4Sri基因mRNA为信息探针,作同源序列筛选，获得同源性80。/o以上的表达序列标签(EST);然后拼接猪EST-重叠群，与人同源比对，根据表达序列标签-重叠群设计引物；用成年大白猪(外来猪)组织样提取总RNA，RT-PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序'进行序列分析。申请人设计了一对克隆猪旭S77基因的cDNA序列(CDS)引物'该引物扩增的CDS如SEQIDNO:1所述(它包括完整CDS区)。(2)SNP发现与检测方法建立。利用不同猪品种的RNA进行RT-PCR，通过混合池测序筛査存在于编码区的SNP，结果发现存在于序列表SEQIDNO:1所示的第400位碱基处有一个C400-T400的碱基突变，该突变位于第4外显子内，且引起丝氨酸-脯氨酸的改变，导致My/-RFLP多态性。申请人设计了扩增包含该SNP引物，该基因扩增片段有221bp，当第145bp位置是T145时，则该/酶切位点不存在，/酶切后检测结果只有1个片段，长度是221bp(定为等位基因T);当存在C145—T145的转换时，其结果导致第145bp处一个jl^p/酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为145bp和77bp(定为等位基因C),三种基因型CC,CT,TT如图4所述。(3)基因型-肉质性状间关联结果。根据方差分析中的最小二乘法原理，使用SAS(视窗V8版)软件中的一般线性模型(GeneralLinearModel,GLM)程序对基因型与性状进行关联分析，具体模型如下y,jk=p+G,+Cj+Pk+Bj+%。其中，yijk是性状观察值，p为总体均数，Gi为基因型效应，Cj为品种效应，Pk为父本效应，Bj为批次效应，Ew为随机误差，假定E;jk相互独立，服从N(0，a2)分布。性状关联分析表明M4S77基因SNP位点对失水率和滴水损失有显著影响(P<0.05)，此位点对其它肉质性状没有显著影响。更详细的技术方案见《具体实施方式》。SEQIDNO:1是本发明克隆的与猪肉质性状系水力相关的M4S77基因片段的核苷酸序列(cDNA序列)；图l:是本发明的技术流程图2:是本发明中猪M4S77基因用于克隆的CDS片段。下划线为引物，英文字母Y后的括号内为碱基突变；图3:是本发明中猪M4S77基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段。下划线为引物，英文字母Y后的括号内为碱基突变；图4:是本发明中猪，577基因^^/-1^1^的三种基因型(<:(:<:丁11:)电泳结果。图中m:dna分子量标准(DL2000ladder)。具体实施例方式实施例l、iW^s37基因的克隆1、引物设计用人M4S77基因cDNA(GenBank收录号NM—001130915)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80<>/。以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCB〖中用ENTREZ(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov八Veb/Search/index.html)査询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计一对引物M-F和M-R，序列如下M-F5;-CCCAAGGGGAATCTGACATAC-3'M-R5'-GCTCCCTATTCTTCCTTTCCAG-3z2、PCR产物的克隆和测序将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体在4'C水浴过夜连接；无菌状态下取100~120nl感受态细胞于1.5mlEpendorff管中，将5nl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min,42°C热激卯s，后冰浴3~4min，加入400nl无抗生素的LB液体培养基，37。C振荡培养45min。取100pl涂布于IPTG(Isopropy他io-P-D-galactoside,中文名称为异丙基硫代一P-D—半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37'C平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2—3mlLB中，37'C300r/min培养过夜。用1.5mlEP管12000r/min离心数秒收集菌体进行制备少量的质粒。验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成。用GeneTooll.O软件中的ASSEMBLY程序进行拼接，得到一条长度为827bp的CDS序列(见SEQIDNO:1所述)。DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与人M4S77基因DNA(GenBank收录号NM—001130915)的部分序列同源性达83%。实施例2、SNP的筛査和PCR-RFLP诊断方法的^):1、SNP的筛査运用M-F和M-R引物分离猪基因组片段，通过在不同猪种的基因组中扩增，回收进行pool产物送公司测序，发现在该基因片段的第400位碱基处有一个C-T的碱基突变，并且引起丝氨酸-脯氨酸的改变，导致^/^/-1;11>多态性。基因组测序的弓嫩序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2、PCR-RFLP诊断方法的ji5！1、引物序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2、PCR扩增条件PCR反应总体积20^1,其中猪基因组DNA约100ng,含1Xbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150nmol/L，引物终浓度为0.4nmol/L'2UT辨DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是94'C3min，循环35次94。C30s，59°C30s，然后72。C20s，最后72。C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。3、PCR-RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是101，其中lxbufferlpl，PCR产物3~5pl，限制性内切酶Msp/为0.3^1(10U)，用H2O补足10nl，将样品混匀后离心'37。C水浴4h'用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果'记录基因型'在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显述'在该221bp片段中存在一个i4^/酶切位点(GTCTCi)，其中第145bp处为多态性切点，位于外显子4中。当第145bp位置是T145时'则该/酶切位点不存在，Afep/酶切后检测结果只有1个片段，长度是221bp(定为等位基因T);但存在C145—T145的替换时，其结果导致第145bp处一个A&p/酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为145bp和77bp(定为等位基因C)，三种基因型CC，CT,TT如图4所述。4、PCR—RFLP—Msp/多态性在各猪品种中的分布情况利用PCR-RFLP-A&;7/检测了6个不同中外猪品种其中国外猪品种有大白，长白和杜洛克，中国地方猪品种有通城猪、荣昌猪和二花脸猪。该突变位点在不同猪种中的基因型和基因频率如表1所示，结果显示M4S77基因各基因型在荣昌猪、人白猪、大白猪和杜洛克猪都有分布，在通城猪和二花脸猪中只有TT基因型。^检验6个不同中外猪品种间基因型频率差异如表2所示，结果显示国内外不同品种间基因频率分布存在着极显著差异。表l:几个猪品种M4SZR基因M印/多态性的基因型和基因频率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:猪^4577基因]^77/-1^0>多态性位点在不同品种中分布的差异性检验结，<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表示"PO.Ol,丰表示P0.05。5、本发明的分子标记在猪肉质性状标记性状关联分析中的应用试验共检测了169个猪个体中国地方猪通城纯种34头，外来猪大白纯种23头，长白纯种25头，中国地方猪与外来猪的杂交猪大长通(大白X(长白X通城))37头、长大通(长白X(大白X通城))47头，确定其基因型，并进行基因型与生产性状(出生至上市平均日增重、胴体直长、胴体斜长、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、滴水损失、肌肉pH值、肌内脂肪含量、肉色、眼肌面积、臀部膘厚)的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型yijk=H+Gi+Cj+Pk+Bj+sljk其中，y砂是性状观察值，^为总体均数，Gi为基因型效应，Cj为品种效应'Pk为父本效应'Bj为批次效应，&化为随机误差，假定e欣相互独立，服从N(0，cj2)分布。基因型检测结果表明在169个个体中CC基因型，有43个，CT基因型有72个个体，TT基因型有50个个体。基因型与性状关联分析的结果是M4S77基因与失水率和滴水损失呈显著相关。由表3可知，M4S77基因SNP位点对失水率和滴水损失有显著影响(P<0.05),此位点对其它肉质性状没有显著影响。表3ikL45r及基因M^/-RFLP多态不同基因型与部分肉质性状的关联分析肉质性状__肉质性状P值肉色0.504失水率0.04"pH值0.093滴水损失0.0174大理石纹0.986肌内脂肪含量0.336剪切力0.358对失水率和滴水损失有显著影响(PO.05)的M4S77基因的SNP位点基因型的最小二乘均数如表3所示=表4:SNP位点(AL4S2K)基因型滴水损失和失水率的最小二乘均数<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"表示PO.Ol,表示P0.05。表3表明，CC基因型个体的滴水损失和失水率都显著高于TT基因个体的对应值，CT基因型个体居中。肉此可以看出TT基因型个体的滴水损失和失水率较低。<110><120><130〉<141><160><170>〈210><211〉<212〉〈213><220〉<221><222><223〉<220〉<221〉<222><223〉<220><221〉<222〉<223〉<220〉<221>〈222><223><220><221〉<222><223><400>华中农业大学与猪肉质性状系水力相关的分子标记克隆及应用2008-10-132Patentlnversion3.11827廳猪(Susscrofa)gene(l)..(827)primer—bind(806)..(827)primer—bind(l)..(21)mutation(400)(400)CDS(31)..(801)1ccc卿ggga3tctg織teicc3cc3gtac3tgcctccagagcca卿c肌gggMetProProGluProArgGinGly54acgagggcagacccccaggetgaaThrArgAlaAspProGinAlaGlu1015ccacctctgtgggaagggacacacProProLeuTrpGluGlyThrHis2530犯gcccLysProccccctProPro8CggtcThrValtctgggSerGly90ccccgcProArg105ccctggProTrpggatcgGlySercatgccHisAlaacgacgThrThr170actThrteaSerteaSer75acgThrg&gGluProttcPhegcgAla155getAlacccProC3CHis60gagGlu肌gLyseggArgcgcArg卿Lys140g犯GluccgProttcPhe45LysetcLeutcgSerProttcPhe125ccgProaccThrgetAlaactThrttgLeucgaArgatgMet犯gLys110郷ArgagtSergttValcca>ProtecSerg朋Gluc服GinetcLeu95ccgProgccAlaccaProstgMetgcgAla175tecSercttLeucagGin80ctgLeueggArgaaaLysThratgMet160ccgProgggGlyteaSerPro卿Gin65ctgLeugagGlucgcArggetAlacctPro145getAlaatelietcggccSerAlacagcagGinGin35Pro503CCThrcgcArgcgcArggagGluttgLeu130HisccgProcctPro卿GlyetcLeuctgLeuatgMetgeicAsp115ggaGlytcgSergetAlattcPhettgggtLeuGly20cca_cctProProgtcValaaaLyseggArgcgcArg100agtSergccAlacctProccgProteaSer180cccProctgLeuggcGly85ggcGlycccProtecSercctProgetAla165gcaAlaccccctggaProProGlycctaggatgProArgMet40cccPro55102150ggtGlytcgSer眺Glu70etcLeuggtGlyctgLeueggArgcctPro150ccgProCC￡lPro卿GluccgProgccAlagatAspaggArg135cctProcctProgccAlactgLeugtgValycgX犯getAla120cccProProgcgAlatcgSer198246294342390438486534582gCCCtg3C3ctggaggagThrAlaLeuThrLeuGluGlu185190cagctgcttccgaaceggggcGinLeuLeuProAsnArgGly205gaacctgagggtaagagecgaGluProGluGlyLysSerArg220gettctgggtctgagggagggAlaSerGlySerGluGlyGly235etaagg鄉agtgggctggatLeuArgArgSerGlyLeuAsp250255<210>2<211>256<212>PRT<213>猪(Susscrofa)<220><221>misc—feature<222>(104)..(104)<223>The'Xaa'at<400〉2MetProProGluPro15GlySerAlaLeuGly20SerGinGinProPro35ProProGlyValPro50gagGluatelieactThrseaThr2403CCThrctgLeuAspctgLeu225ggtGlyt33gcgatecgcAlalieArgetag肌gatLeuGluAspgggctgaggGlyLeuArg230tggtgtctgaattectgggtcTrpCysLeuAsnSerTrpVal2458CttCtgg833gg33g38t3ggg3gCC3gGingacAsp2103gCSerg肌Glu195atelietttPhe卿gcgArgAla200casgtgGinVal215ttctggPheTrp630location104standsforPro,orSer.ArgGinGlyThrArgAlaAsp10ProProGlyProProLeuTrp25ProArgMetLysProThrPro40GlyProSerProProSerHis5560ProGinAlaGlu15GluGlyThrHis30PheThrSerSer45LysLeuGluLeu678726774827GinThrLeuLysLeu65LeuArgGluGluLeuThrVal70LeuProValLeuArgGlyLeuProValSerGly8590GluArgMetArgGlyGlyAlaXaaProArg100105ArgGluAspSerProLeuAspAlaProTrp115120AlaLeuGlyAlaSerArgArgProGlySer130135ProProHisAlaProHisSerProPro145AlaProAlaProPro150ProProAlaThrAla165AlaProAlaSerlieProPheSer180AlalieArgArgLeuGinGlu195lieLeuGluAspThr185GinAspAsp210SerPheGlyLeuLeu225GlyTrpCysLeuAsn245Arg230SerTrpValLeuThr170AlaLeuAla200ValGluProGin215PheTrpAlaSerArg250SerGluLeuArgGinGin7580ThrLysSerMetLeuLeu95GluArgProLysProArg110ProArgPheArgAlaLys125PheLysProSerProThr140AlaGluThrValMetMet155160AlaProAlaProAlaPro175LeuThrLeuGluGluGlu190LeuProAsnArgGlylie205GluGlyLysSerArgThr220GlySerGluGlyGlyThr235240ArgSerGlyLeuAspThr25权利要求1、一种与猪肉质性状系水力相关的MASTR基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、根据权利要求1所述的与猪肉质性状系水力相关的MASTR基因片段，其特征在于，序列表SEQIDNO:1的400bp处有1个C400-T400的碱基突变，导致MspI-RFLP多态性。3、检测权利要求2所述的一种猪肉质性状系水力相关的MASTR基因片段突变的引物对，所述的引物对的正向引物为5'-CCTCACTTTCCCGCATCTTC-3',反向引物为5'-GCTCCCTATTCTTCCTTTCCAG-S"4、制备如权利要求2所述的与猪肉质性状系水力相关的MASTR基因片段的方法，按照以下步骤利用权利要求3所述的引物进行PCR扩增，PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，利用限制性内切酶MspI对PCR产物进行酶切鉴定，最后用2%琼脂糖凝胶电泳检测CC，CT，TT基因型的分布。5、权利要求2所述的与猪肉质性状系水力相关的MASTR基因片段在猪分子标记辅助选择中的应用。全文摘要本发明属于家畜分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪肉质性状系水力相关的分子标记的克隆及应用。所述的分子标记由MASTR基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO1的第400bp处有一个C400-T400的碱基突变，导致MspI-RFLP多态性。本发明还公开了扩增MASTR基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性的检测方法。本发明为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。文档编号C12N15/10GK101376884SQ20081019723公开日2009年3月4日申请日期2008年10月13日优先权日2008年10月13日发明者榜刘,彭中镇,徐学文,韩雪蕾申请人:华中农业大学