专利名称：：一种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于蔬菜抗病分子育种
技术领域：
，具体涉及一种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆及应用，为番茄的抗病基因的标记辅助选择提供一种分子标记。
背景技术：
：蔬菜作物在农业生产和农业产业结构中占重要地位，也是我国出口创汇的重要作物。蔬菜生产中的病危害日益严重，每年因病害可使蔬菜作物减产10%—20%，严重时可能导致绝产，因此培育抗病品种是最有效的控制病害发生的途径。目前蔬菜功能基因组的研究发展很快，番茄已经启动了测序工作，一些染色体己经测序超过一半，很多控制抗病基因已经被克隆。但目前抗病育种选育过程中所使用的分子标记与目标基因存在一定遗传距离，易发生重组交换而分离，影响选择的准确性，且大多数标记产物需要先进行酶切后才能电泳凝胶分离开来，使用起来很不方便，不利于高通量的筛选。
发明内容本发明的目的在于克服现有现有技术的缺陷，制备一种与番茄抗病性状相关的分子标记及应用，为番茄的抗病基因的标记辅助选择提供有用的分子标记。本发明的技术方案如下申请人制备了3种与番茄抗病性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1,SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所述。在序列表SEQIDNO:1的312bp处有1个A312-G312的碱基突变，在2298bp处有1个G2298-C2298的碱基突变，在2299bp处有1个T2299-G2299的碱基突变，导致序列标签位点多态性(STS)。在序列表SEQIDNO:2的3477bp处有1个A3477-G3477的碱基突变，在3516bp处有1个T3516-A3516的碱基突变，在3517bp处有1个G3517-C3517的碱基突变，在3606bp处有1个T3606-C3606的碱基突变，在3692bp处有1个C3692-G3692的碱基突变，在3693bp-3713bp之间有10bp的碱基插入，导致STS多态性。在序列表SEQIDNO:3的405bp处有1个A405-T405的碱基突变，在485bp处有1个G485-C485的碱基突变，516bp处有1个A516-C516的碱基突变，在517bp处有1个T517-G517的碱基突变，在530bp处有1个G530-A530的碱基突变，在610bp处有1个A610-C610的碱基突变，在672bp处有1个G672-A672的碱基突变，在715bp处有1个T715-C715的碱基突变，在725bp处有1个C725-G725的碱基突变，在806bp处有1个C806-A806的碱基突变，在847bp处有1个A847-G847的碱基突变，在997bp处有1个A997-C997的碱基突变，在H45bp处有1个A1145-G1145的碱基突变，在1171bp处有1个T1171-A1171的碱基突变，在1381bp处有1个A138卜T1381的碱基突变，在1543bp处有1个A1543-C1543的碱基突变，在1075bp-1081bp之间有6bp的碱基缺失，导致STS多态性。申请人根据上述SEQIDNO:1，SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的序列特征，分别设计引物，发展为STS标记。所述SEQIDNO:1，SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的引物对分别为SEQIDNO:1:正向引物为5'-GCCTCATTCMCTTCCTTCTGG-3'，反向引物为5'-GCCAGTATATMCGGTCTAMC-3'。SEQIDNO:2:正向引物为5'-CCATCTCTCMGGAACTGCGTC-3',反向引物为5'-GTAGTGGTGTGAGCAATGGGCA_3,。SEQIDNO:3:正向引物为C1:5'^GTTCTTATCCTTTAACACCCA-3'，反向引物为C2:5'-TCCCTCCAAATTATTACTTCC-3'。更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。序列表SEQIDNO:l是Tm-2a(基因登录号AF536199)分子标记的和核苷酸序列，在312bp处有l个A312-G312的碱基突变，在2298bp处有1个G2298-C2298的碱基突变，在2299bp处有1个T2299-G2299的碱基突变。序列表SEQIDNO:2是12(基因登录号AF118127)分于标记的和核苷酸序列，在3477bp处有1个A3477-G3477的碱基突变，在3516bp处有1个T3516-A3516的碱基突变，在3517bp处有1个G3517-C3517的碱基突变，在3606bp处有1个T3606-C3606的碱基突变，在3692bp处有1个C3692-G3692的碱基突变，在3693bp-3713bp之间有10bp的碱基插入。序列表SEQIDNO:3是Cf-9(基因登录号AJ002236)分子标记的和核苷酸序列。在405bp处有1个A405-T405的碱基突变，在485bp处有1个G485-C485的碱基突变，516bp处有1个A516-C516的碱基突变，在517bp处有l个T517-G517的碱基突变，在530bp处有1个G530-A530的碱基突变，在610bp处有1个A610-C610的碱基突变，在672bp处有1个G672-A672的碱基突变，在715bp处有1个T715-C715的碱基突变，在725bp处有1个C725-G725的碱基突变，在806bp处有1个C806-A806的碱基突变，在847bp处有1个A847-G847的碱基突变，在997bp处有1个A997-C997的碱基突变,在1145bp处有1个Al145-G1145的碱基突变，在U71bp处有1个T1171-A1171的碱基突变，在1381bp处有1个A1381-T1381的碱基突变，在1543bp处有1个A1543-C1543的碱基突变，在1075bp-1081bp之间有6bp的碱基缺失。图1:J基因及等位序列在翻译起始之前的intron的比对结果图2:T)z-^基因分子标记对单株的检测。泳道l-6分别为Alll、A114、A53、A115、A113;7泳道为LA1221;CK:空白对照；M:Marker图3:烟草花叶病毒接种不同番茄植株后的叶部特征。A为A53,B为LA1221。图4:/^基因分子标记对单株的PCR检测。l-6分别为A53、AlOl、A112、A114、中蔬五号、中蔬六号；7-8为LA3847、LA4026CK:空白对照M:Marker图5:必W基因分子标记对单株的检测。左为LA2819(抗病)右为A53(敏感对照)；M:Marker图6:根结线虫接种番茄植株的特征。A:番茄植株三叶期接种根接线虫后植株生长势情况。左为LA2819，右为A53。B:番茄植株三叶期接种根接线虫后根部特征。左为LA2819，右为A53图7:Cf-9基因分子标记对单株的检测。1泳道为Ont7719，2-7泳道分别为Ont7717、Ont7516、V121、Vetomold、Leafmouldresister、Moneymaker:CK:空白对照sM:Marker具体实施例方式实施例l:番茄抗烟草花叶病毒基因化-《标记的创建与应用步骤如下(l)根据文献上找到7)7/-^基因以及其等位基因to-2的登录号，r/z-i^基因登录号为AF536201'等位基因加-2的登录号为AF536199。(2)经过比对软件分析两序列后发现，搜索到SNP位点3处，分别为312A/G;22982299GT/CG。(3)设计引物并合成。根据7i-^j基因22982299GT/CG设计PCR引物，引物3'端与补，并在引物3'端第三位人为的引入错配。引物序列如下Al:5'-GCCTCATTCAACTTCCTTCTGG-3';A2:5'-GCCAGTATATAACGGTCT嵐C-3'。(4)PCR扩增与电泳检测。PCR反应总体积为25uL，10XPCRBuffer2.5uL,3.0mMMgCl2，0.2mMdNTP，各引物0.2uM,20-50ng模板，Taq酶0.5U。PCR热循环程序94°C变性5min，然后94°C45s、59°C45s、72°C1min进行33个循环，最后72'C延伸8min，结果用1%琼脂糖电压5V/cm条件下电泳30-40min，终结果用EB染色，凝胶成像系统上显示(见图2)。含7顶-^的株系能检测出469bp的片断；而不含7i7-,的株系不能检测到产物。(5)将PCR检测的植株接种病毒鉴定，在两片真叶期摩擦接种烟草花叶病毒(邵碧英等，烟草花叶病毒弱毒株的筛选及其交互保护作用，福建农业大学学报，2001，30(3):297-303)，两周后调査发病情况，确认&-/分子标记的正确性(见图3)。实施例2:番茄抗枯萎病基因/-2标记的创建与应用步骤如下(1)在文献上找到/^基因以及其等位基因信息，/^基因登录号为AF118127,/-^的等位基因/-i"序列仅知道291bp长的片断，(2)通过比对软件分析1-2与等位基因部分序列，搜索到5个SNP位点和1个插入突变位点，分别为3477A/G、35163517TG/AC、3606T/C、3692C/G、3693-3713位插入10个碱基。(3)设计引物并合成，根据2'-2基因缺失序列两端来设计引物，其中等位基因特异引物与I-2基因互补，引物序列如下Bl:5'-CCATCTCTCAAGGMCTGCGTC-3';B2:5'-GTAGTGGTGTGAGCAATGGGCA-3'。(4)PCR扩增与电泳检测PCR反应总体积为25uL,10XPCRBuffer2.5uL，3.0raMMgCl2，0.2mMdNTP，各引物0.2uM，20-50ng模板，Taq酶0.5U;PCR热循环程序94°C变性5min，然后94'C1min、58°C1min、72°C75s进行33个循环，最后72'C延伸10min,结果用1%琼脂糖电压lOV/cm条件下电泳30-40min,终结果用EB染色，凝胶成像系统上显示。含/-2基因的株系能检测出601bp的片断；而不含1-2基因的株系能检测出723bp的片断(见图4)。(5)将PCR检测的植株接种镰孢属的番茄萎蔫病菌(&5ary咖ox/邻or咖/.印./ycope/^'c/,刘晖等，山东农业大学学报自然科学版，1991,22(4):356-360)鉴定，在两片真叶期浸根接种镰孢菌，3周后调査发病情况，确认1-2分子标记的正确性。实施例3:番茄抗叶霉病基因Cf-5标记的创建与利用(l)据根相关文献信息找到C/^基因与其等位基因的信息，C/-5基因序列登录号为AJ002236，Cf-5的等位基因C/W的序列登录号为AY639604。(2)通过比对软件分析，搜索到16个SNP位点和1个插入突变位点。分别为405A/T、485G/C、516517AT/CG、530G/A、610A/C、672G/A、715T/C、725C/G、806C/A、847A/G、997A/C、1145A/G、1171T/A、1381A/T、1543A/C、1075-1081位缺失6个碱基。(3)设计引物并合成，根据Cf-5基因缺失序列处来设计引物，等位基因特异引物在3'端与C/"^基因互补配对，故该条引物与Cf-0在3'端发生错配。引物序列如下Cl:5'-GTTCTTATCCTTTAACACCCA-3';C2:5'-TCCCTCCMATTATTACTTCC-3'。(4)PCR扩增与电泳检测PCR反应总体积为25uL，10XPCRBuffer2.5uL,3.0mMMgCl2,0.2mMdNTP,上游引物O.16uM'下游引物0.24uM,20-50ng模板，Taq酶0.5U;PCR热循环程序94'C变性5min，然后94°C1min、57°C1min、72'C75s进行34个循环，最后72'C延伸10min，结果用1%琼脂糖电压10V/cm条件下电泳30-40min，终结果用EB(溴化乙啶)染色，凝胶成像系统上显示。所有材料中仅0nt7719(Cf-9/Cf-9)能扩增出约415bp大小的片段，在其他几个番茄品系中没有任何产物。因此该特异引物能特异检测Cf-S基因，可用于基因标记辅助育种(见图7)。(5)将PCK检测的植株叶霉病菌接种鉴定，在四片真叶期喷雾法接种番茄叶霉病菌(顾沛雯等，番莉叶霉病菌生物学特性研究，宁夏农学院学，2004，25(3):21-23)(1Cf个/ml)，两周后进行病情调査，确认Cf-P分子标记的正确性。实施例4:番茄抗根结线虫基因#2'-7标记的创建与应用(1)据根相关文献信息找到必'-/及其等位序列的信息。/基因的序列登录号为U81378，等位基因肌'-ZC的序列登录号为DQ863290。(2)通过比对软件分析，发现#/-7与则'-JC在翻译起始前的内含子(intron1)序列存在很大差异(见图1)。(3)设计引物并合成，根据必'-/的intron1两端序列来设计引物来扩增intronl全长序列。引物序列如下Dl:5'-TTCTCTAGCTMACTTCAGCC-3'D2:5'-TTTTCGTTTTTCCATGATTCTAC-3'(4)PCR扩增与电泳检测PCR反应总体积为25UL,10XPCRBuffer2.5uL，3.0mMMgCl2，0.2mMdNTP，上下游引物各0.2M，20-50ng模板，T叫酶0.5U。PCR热循环程序94°C变性5min，然后94。C1min、58°C1min、72°C75s进行34个循环，最后72'C延伸10min，结果用1%琼脂糖屯压10V/cm条件下电泳30-40min，终结果用EB染色，凝胶成像系统上显示。含必4基因的株系能检测出大小为556bp和1353bp的片断；而不含#/_/基因的株系能检测出大小为1287bp的片断(见图5)。(5)将PCR检测的植株进行南方根结线虫M8005(Meloidogyneincognita,赵洪海等，采自烟台市的南方根结线虫的描述，莱阳农学院学报，2000,17(2):81-85)接种鉴定，在20d苗龄时灌根法接种2000条淋的根接线虫。30d后观察根部发病情况'确认必-_/分子标记的正确性(见图6)。实施例5:抗病功能标记在优质多抗番茄品种(品系)选育中的应用(1)引进国外多抗性番茄品种Ke印sake3275，购自美国福罗里达州番茄育种公司(TomatoGrowersS叩plyCompany),自交得到F2分离群体(2)对F2单株进行PCR检测，结合田间经济性状调査(如笫l开花节位，结实率，单果重等)，选择含有三种抗性基因且性状优良的植株，F2单株继续自交得到F3群体；(3)对F3单株进行PCR检测(表l),结合田间经济性状调查，选择含有三种抗性基因且性状优良的植株，F3单株继续自交得到F4群体；(4)对F4单株进行PCR检测(表2)，结合田间经济性状调查，选择三种抗病基肉已纯合且性状优良的植株，得到的优质多抗自交系与多个优良自交系(如中蔬5号)杂交。(5)通过调査经济性状与抗病性，选择配合力好的组合用于实践生产。表1利用分子标记辅助选择对番茄分离群体F3的单株检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2利用分子标记辅助选择对番茄分离群体F4的单株检测结果(部分)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3本发明中所创建的标记与前人所创建的标记对比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明利用可隆的基因序列信息开发基因特异标记，并结合抗病接种鉴定或抗病品系来验证基因标记的准确性，所获得的4个抗病基因特异引物均能有效的区分抗病与敏感番茄材料，且在检测过程中无需酶切、准确度高(表3)。通过本发明提供的分子标记用于抗病基因分子标记的筛选，以及抗病品种杂交一代种子纯度的DNA检测、选育多抗性蔬菜品种。可对不同来源的蔬菜种质资源进行快速和早期鉴定、科学指导抗病亲本的选择，大大降低苗期抗病接种鉴定的工作量，提高抗病育种选择效率，节约成本，加快品种选育的进程。序列表<110〉华中农业大学<120>—种与番茄抗病性状相关的分子标记克隆及应用<130〉<141〉2008-10—15〈歸3〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211>9837〈212〉DNA<213>番茄(Lycopersiconesculent咖)〈220〉<221〉gene<222>(1)..(9837)〈223〉<220><221>mutation<222>(2299)..(2299)<223〉<220〉<221〉咖tation〈222〉(2298)..(2298)〈223〉<220〉〈221〉mut&tion〈222〉(312)..(312)〈223〉〈400〉1ggatccttctcatttttagattecaagttctatactcttgttctttatag60ttgtg犯ttgtaatagttga33taagttctaagttt肌ta犯atttgaggaaataattca120ctcatattttctttctactattttcatcacatacatacttcaaagatata180tcattttataatatcaattct犯tt3gC3tg3g幼ceicgtcgtgttcaac240aactaatattactaaaagtgatcaaaatcatattttatt"t300agttattt犯aggtaattttatttttattcatgatatagtgattgttc3teittataatact360attattgattactttctttt鄉gggtaaattgtatggcaatattttcag420tcttttatcattagaa犯cttatttatacttgtatactcg480ggtt卿agttttgtgttctatgagtttctttgtaattat540tgatatatttttat犯ttttgttttactatgttattatat犯tattgtag600caaatgccccctc犯cgtataactggatttccaactacac3cttaaacttteicg3g8gtc660ctatcacccccctg犯ctatcccttaaa犯3gtC3t犯CC720agatctattttcacgtgtttg3cacgacatttatttttaggg8t犯tgCC780caagtaccccctcaacctatgcccgeiaatttcag3g加acactta^ct3tactaaggtc840ctattacccccctgaacttattttattaataattttttactcctttttagcctacgtggc900actatcttgggggcccaacgatggttgactttttttttcaaactagtgccacgtaagcta960肌gttC3ggggggt犯t鄉3ccttagtat1020agtat犯gtgtgtctctgggatttcgggcataggttg卿gggtacttgtgcattttctc1080ttatttttaccatcactagaacaccataagtccattattgggtctttgag1140ttatagctcgtttgaattttgctcatttgatacctaaaat1200taacttta犯gggg卿tggggggtt柳sgacgaatattgtC3tt犯tg1260atggtcaccgatgctctcaagg3卿tgsgctatgatgtc1320tgccacatcatcttctatggcgacaacaattgatggattaactag3tt犯tagct犯犯tgatattcteittagtaaaaaaaateittttttccatattgattttctcaaattetggtccaaatttatctc犯ttgattttggatgattggtaattttg犯tcagaaatsgtcaatccggtg3gtga肌gattgag3gatttgtt幼t犯ggstattgattgactttatcccatccgttaaaaacttgtcatttctaccctccaaattaacggcaattta犯ttacccatttgaaattgattttaacattggtga犯cttcaaactttcttcc3t犯t3tacawtcaat3t3cat8犯cc33g组agctattgccatggtaca犯tcgtttacaccattacattatttggtgctgttttctatcccaatggtgacaaacacaactgaagaaacgatgacgatcaaaaagcaagaggacgaatctgcaccatattttcttcgatattccctattgaaccaatagccccc犯tatttcaatttgtagaagac3gcatcgttcaaatcgatttggt犯g犯tgg犯Cgt3CC3gttCgtCgg38tgaacgaagagagttatcctt犯ttgagatgt犯cctttga/tggeiga^taag^gtcsttgctttgttgttatttgtttactataatgggatatggcaattttatttgaaattgggatgag犯gggtac3tatgacaagtttttttcaaggteagggtaaBgtta^ccagte肌tc犯3犯犯taa3taEtttga^aeitgcata^teitttataa/tagattttgatgttcactctccaaagacattcagggaggtaattatttcagttttaaagtttaattgtgtagttgaaaatccaaaaaaatattaaaaatttaaagatccataaggggcttttactaagtaaattgtccaagagttgccacttattaataatttttatataattgattttgttattttaaattatttttcatgagateataattccttcatttcatctaataattcctaataatattcaatatttttttt犯s朋aataaecccttaagttttggggtctaagacacataaaattgtctcgccttacgcgcgtgttcgaagg卿tgttatttgtagttttgatgatgaggttctc犯catgagttttgatgatgtgattcccaacatgaatagcctgttgactgccatacc肌tggcgtgagEtaaagtcagacctttacttgtctatacaatgtcactttcctaaacgtactctcacgaacatttgcaaaggctatacaactgaa犯ttcag肌gcatatcgtgtagttcaaataggctacgatatt1380tttgtagatat幼ttgattgattgagattt1440tggttggtcc犯tcggagtcaaagtaaaac1500gtatcctgag15606ttcaagagttttatotgagttcgaaaattt1620ggc^c犯gactt卿ggtg1680犯gggcc犯aaataccctctaactttaatt1740tg幼gttatttataccctcgcctttaacaa1800ttgccctaaattgaccccaaettcccaatt;t1860cctcttttaaaccggacccaataaacttaa1920caattttgtc1980aatgcaccat2040g3tsccaaata犯tgagag82100tgtactccgacccttgagcg2160cttcttgcagatgcacattatctccgggca2220acccttctgcctcaatgtttcacctcttct2280ctttcaatcttttaatttttcgccattgat2340tttgatcttgttggtaattg2400tgtcgattcgttggaatcagaggaaaagta2460ccgg鄉aatattaataaaa2520gattctggtaacttttttgtgacgattctg2580tgttcaagttattg卿geig2640gtcaggttggattgagtttg2700atttttattgatttgaggctttccctctaa2760cggta^ggstataaataacttttttttaat2820gttgatg卿ac犯ataaga2880ttgaaag3gsaaagttttag2940gagtg犯atacactaactatgCC3gCt犯g3000gggt犯teggactcccgtga3060tacattgaggtgacattcaatcattttcta3120cttacaccctactcatggcttacgtcttgc3180tc肌gcatattagtggcctaaagcaaaaat3240tcttctagatttcaattgataataatacca3300taatattccaaatatgtcaaatttctttta3360tcatttcatgtttttataca3420actccttataacctettattatta犯tatg3480tgtctttttttagcactgtcgagtcacctc354011aaaacactgcgcagaatgattattataa3600tgacaaactcagagaiccttgtaaaggtacc3660tatactcaggaaccttgt犯3720gccgg卿agggtgcacatt3780tca^caaatggc犯gagttta鄉a犯ggg3840atcattccttagtttttgcaacttgaaa^3900gaB犯tcc犯gtgaeig冊ttattcaaataa3960ttgtttg柳atatattcttgtggtcttac4020attgtaaactgttccta犯teitcagtgtggtggtgttgaaattctaagtt4080gtcttg卿gg3tagcttogtgggt卿3taacttctacttatgcttatc犯gc犯犯ga4140gttattgcttgstcgtg卿tt犯犯actttctctcacatttgtgtaactggttttactt4200ttacttgcgaeittttagtga犯C3gttgtgaaaMcctgtg卿c鄉tcgtggttttac4260tctcttaagc犯ggaggtttcc8tgtaaaattattgtgttgtcaagctgcatttactttc4320tgtttatactttgtgtgtcaagggacctggtccattgactcgC8taaatt4380ct犯cagtaagatacttctcctttttctttatgtaatttatctctaagaa4440ga卿ggc犯C￡L8L6LCtt￡lCC4500tcttcaattttaaacaatgsttggtata犯sagatgctgccccacgttgtctctctcttt4560cttttttatcgttcacattttt3gg幼3Cttgggctacagagtcattact4620atactcatttttttgtagctac11aaaaaa3犯tggCtg3aattcttctt46803C3tc3gtaatcaatgaatctgtaaaaatagctgg肌stctactgattca4740cgtttattttggttg^卿ggacatcgeittggctccagag卿eiatg3gax;eLC3ttcggi4800tcatatgttt3ggCCt3gg3兆ttggaggtgattc卿ggtc3gaaeictt4860tggc鄉tg3tgtggaggacctcttagaacgt3t3g犯Ct4920ttaattacgttgttgtttgattttatagattatatataat4980tatttatcgttc^icaaeiga61g6lCgattgtgta^tcgggttgttcatgaatttcaacttt5040tactatt"tcattttgaattttttggttagtcatttctatcggacacctgt5100gcgg组tgttatactactccctttatttcatattacttgaatttgtgaggcaatgccta5160tatatattaacaaggacataattt幼atcatgattctattattttccttt5220gtggaatcataaatataactttgtaagtagtttaatttatctcctaaagcgtacagaact52808肌ggaca犯atttcaaacatccttcttaaactttgaaca5340gcaaa犯cttcaaaaattcactttaatataaaataaaggt5400tttttttaaaatatttgttacatatcactg5460ttgggactcgtcctagggcsaaactctggcaaaacgcctcgagactg犯ctttgggtctt5520agttCggt^gaatcacgccctaaactgcagattgtacgtcctaagtacgcccsacaccc5580咖gttcggggctcgactaacatatcttattatgtgttaa肌tctgtsta5640gttaacatttttgaccctcatagttcttgagatacttaat5700tctgt卿gat皿tagtaactcaaataattagttgteigt3tcacatttttactattttat5760acatttctttcaaaacatatagca幼tttt5820tactttttcttgattttcttggttttgtcatttgtgtcaa幼ctatxcta5880ttttatttaactatttg犯ei3t犯tttt3ttttgattcatgatatagtgatatttttatt5940tattgattattttcttttagggggtaa幼3ttttaacatcgatagggcgc6000tcaaagcttacgccttgtactt犯agacgcccccttgaca卿ctgcagcg3gtg8ttgt6060cctttttcattaatgtgcagctgccccacgttgtcactcc6120ccttcttctttatcatttccttcttgacattaitt3gg3g3cttggccgtggactccatct6180agct犯agccatcagtatactcattttttggtagctactg6240ggctgaaattcttcttacattaaeitctgtagaaatagctg6300gaaatttactg3ttc犯gaagg^i犯gcgtttatattggttg犯聊ggatatcgattggc6360attcgatctt3tgttgac犯cgca犯ggccaagg犯gctg6420g娜tgsttc犯gggtC3犯sacttattga3g33ttggC3ggtg8tgtgg6480aiggatctcttagatgacttccttccfiaa犯ttcaacaatccaataagttcaattattgcc6540tta卿ggagttcttttgcagatg敏ttgctstggagata3g3gsaggg6600Ugttgacattgaccg犯taacaacatcataeicaat犯tg6660atgattgtgttctgctggatcgg卿卿ttattcctacatgctgaitgaaac3g3gatc36720tcggtttggatgatgacttcaagccaaattgatttgcatt6780atggagttgtttccatagttggcatgcccggtctgggg犯aacaactcttgccaagaaac6840tttataggctcattcgtgatC犯tttg3gtgttctggactggtctacgtttC3C犯C3gC6900c卿agcgsgtga犯tctt6tCttg3C3ttgccaaacaaattggactgacg6960tttggaggacaacctgcgatcactcttga^tatgttatcc7020tcctagatgacatttgggatgtgg^atttgggatgatctgaaacttgtccttcctgaat7080gtgattc肌aagtcggcagtagaatgat犯tcacgtctcggtaggc卿t7140ggaatcctccctccatgcattgcaacccct卿atccgagaaaagctttg7200犯ctctttacca^g犯aatctttaattttgtagttgggccaatgcttcac7260ctgacttggtgaatattggtagaaatatagttggg卿tgccgctagcca7320tagtggtgactgc鄉catgtt肌gggc犯卿acatgcg7380tacttgagagtatgggccat犯agttc^g3tggatgtgct幼ggt3ttggctctcagtt7440ac犯tgatttacctattgcctcaaggccatgtttcttgtactttggcctttaccccgagg75003ccatga犯ttcgtgcttttg3tttg3taaatatgtggattgctg柳agtttatagtag7560taatsggcgeigaggctgaggatttggcggaggacgtcctaaatgatttgg7620tttctagaaacttgattcaacttgccaa33tgga3g犯tttcaagttgtc7680gcatacatgacttgttacatagtttgtgtgtggacttggctaagg3犯gtaacttctttc7740acaccgcgcatgatgcatttggtgatcccggcaatgttgctaggctccga7800tctactctgacaatgtcatgattgagttcttccgttc犯atcctaagcttgagaagcttc7860gtgtacttttctgtttcgca犯agacccttccatattttctcatatggcttattttgact7920ixaaattgttgC￡LC￡LC￡Lttggttgtagtcatgtctcaaagttttc肌gcatatgtceictEL7980tcccaagcaaatttgggaacatgacttgcttacgctatct眺attggag8040gcca犯tagtattgtcaagctcacacgtctg3C3ttg3tC8100gacgtagcctcattcaacctccttctggtgtttgggagtcta犯catttgagacatcttt8160gC3tgt86lC3gttgcttttctataagctcattttacccaa8220atatttactcattgcatcctaacaatctacaa^ccttga/tgtggatacctgataaatttt8280ttgaaccgaggttgttgcaccgattgatc3actggg城actgggagtgt8340ccaattctaccgttaagatgttatcaatatttagccctgtgctt卿gcgctggaggttc8400tg犯gctcagtttttccagtgacccgagtggttgtcatcgtatcc3cata8460ttgct犯gttgcatttg犯tgttaacag犯caatggccttg犯ctctcaatcatttcctc8520c肌gcttactcteigcctacttt￡Lgtgt￡LgeL8580tt犯g^C3tttcccaaattaagaaaacttactgcaagtat8640agatggatctctcgggcgaggcaaatggttatagctttccgc冊cttgaagttttgcata8700ttcatagcccg组gggttgtctg犯gtascgtgcacggatgatgtcagtatgccca犯t8760tga犯aagctgtt^LCtt3C3ggattccattgccgaatcagttt3tCgg犯cggctt幼幼8820agctgagtaaatg犯catctcaacaggtcagtttgctagtacgtacaggg8880gtgcatcacagc犯cgtgagtgtagtagtgttgtttcttgttgtggttgtttgttggttg8940ttcagatctgaaagtgtg犯gctcattagaacacgtctcatagtgatattaaatttactt9000ttaaacaata犯ggCgtgt3ctgatttttc90603Cgagag肌aatttatgtcattttcctttgtaaagat肌agtagtcattggttccaattg9120cataatatcaggetttttgELELCSLCgELt肌tC■tt￡LC￡Lt8Lg￡L￡L9180atcatt鄉ggaacatacctgatg郷犯gacatcttcacacacaaaaacgaaagtgtta9240gtcgtaaattgatttctacctccttttcctaacttteitgttaccac犯tcgtc鄉gata9300gaattattctagagsatatgtggttaactctagtgggtgg鄉gaggacc9360ggttgtgatttaatctgatacgtccatc幼ttaaccaa/tgt3cggacgagatctattact942012tatttatgatattacttgg3ttacgact犯acttgggtcat幼gtaag犯9480cagtctcccacttggccc幼tcattaatat9540ttagttgcgcatac犯tagatctcttctat犯tgtcaatcatgcatacca9600c组atgacagcgagttttgacggttgcac9660ttccttccatatactactacattagcaacttatcatactaggttcataaggtat朋aaac9720atataacattacggtccacaataatgcctcatcttgt犯tttctcaaaac9780aataatgtgtacaccattacgagaaac犯g3tgttcag犯tgsgctc9837〈210〉2<211>3801〈212〉DNA<213>番茄(Lycopersiconesculentum)〈220〉〈221〉mutation<222>(3477).(3477)<223><220><221〉gene〈222〉(1)..(3801)〈223>〈220><221>mutation<222〉(3693)..(3713)<223><220><221〉mutation<222>(3692)..(3692)<223〉<220〉<221>mutation<222>(3606)..(3606)<223>〈220〉<221>mutation<222>(3517)..(3517)〈223〉<220〉<221>mutation〈222〉(3516)..(3516)<223><400>2atggattggcttagcagttggtggtgcatttctctcctcagctttgaatgttctgttt60gatacttgctcctaacggtgatctgctcaacatgtttcggacataaggatcatgtt120aagctctteisagasgctgaaatgactttgcgtggtattcattgtgctaagtgatgca180gaataagcagcatcatccatctgtgagactggcttaatgagcttcgatgct240gtcgactctgctgsaaattt3ag3a3gtcatagagctttgaggcttaggtg30013g卿gtcagc3tCgLg幼tttttcagaaacaagcaaccagc犯gt肌gtgfitgattttttc360cttaacataa3ggELC犯gCtggaagacactattgaaacattaaaggatttgc犯gagc犯420attggtctccttggctta肌ggagtattttgattccacgata^agacct480tcaacttctgtgg3tg3tg3atctgatatctttggt郷c3gagcgaaat卿ggstttg540attgaccgtctattgtctga3ggtgC鄉tggg犯犯柳tgacsgtagttcctatcgtt600gg城gggcggccagggc犯gac犯cacttgcta犯gccgtatacaatgatgagagggtg660aagaatcattttgatttgaa8gcgtggtattgcgtttctg犯ggstttgatgctttgaga720犯ttactcceiagaaaittggcaaatttgactCg犯gg3tgtccacaacaat780cttaaccagcttc犯gtcaa8gtttg鄉gga犯g犯gttccttattgtt840ttggatgatgtgtgg犯tgsaaattacaacg解tgg组gtatttttgca900gatC6lttgtgacgacacgC3^gacagtgttgccttgatg9603tggga^tgcatgggcaatttgtctaccgaagcctcttggtctttattt1020ca犯g3catgC3tttg肌犯catggatcct8tgggacatccggaacttga卿ggtcgga1080ag3ca犯ttgcagcc犯gtgcaaaggactgcccttagctctg犯g3CgCtcgctggcatg1140ttacgctccaaaacgtattttg卿3gtgs犯tatgggag1200ctgccacacaaccagcgttgatgttgagctac犯tgatcttcccgcacat1260gcttttcttttttcct3幼gattatccatt1320caagttattcatctatggattgccaatggtctcgtaccagaataaatcaa1380gattt兆gcaaccaatactttctagagttgcattatttgaaaaggtccca1440aatccttctattccttatgceitgaccttgtc肌tga/tttei1500gcccaacttgcatcttcaaeLactttgtatc,gccaagg3tctcatatg1560ttgg朋C33tgtcggcacttatcttattca3t3gg6Lttt3atggtgagttt38g333ttg1620acacccctctaca犯ttggagC3gttg鄉acattgcttccgeitacgtattgaattcaga1680ttgcacaatcggtgttgC3tctacactaagatccttg鄉1740gccctatcattctctcaatac犯g3ttaaggagttgccaaatgacttgtttaccaaatta翻犯gctcctcagatttttggatatttctcggacatggattac犯agttgccggattccatt1860tgtggattatateacttggagacacttctcctgtcatcttgtgctgatcttgagg鄉te1920ccgctgcagatggag卿ngatt犯cttgcgtcatcttgacgt犯gc肌cactcggcgc1980ttgaagatgccactacatctgagcaggttgaaaagcctcc卿tgttggtgggaccc肪g2040ttttttgtag3tggttggag犯tgg犯gatttgggtgaagcacaaaac11acatggatct2100ctatcagttgtg卿ttgga肌3tgtggtt犯gctgtg犯ggca犯gatg2160鄉g卿卿atcatgttgagC犯tt3tC8ttggagtggagtg犯服tagtattgccgac2220aattcacaaaC3ga犯gtgacatacttgatgagctatgcc2280gtcgaaatcagtggat3tagtttcccaattgggt鄉tgatcctttgttt2340cttaagctggtg犯tttgtctctaaga犯ctgc犯ggactgttactccttgccagcacta2400ggac犯ctcccttgtttgaaattcctttccgtta犯gggatgcstgg朋ta卿gtggtg2柳tctatggcagattgtcctcc犯aaagccttttaactctctagagaagctt2520g組ttgaeLggtgg犯gc犯tggcacgcactaggaattggagagttccct2580ac3cttgagaacctttcaattaaaaattgccctgagctcagtttgg鄉t3CCC8tCC8a2640ttttcaagttag犯gtt^Lgtgattgtccagttgtttttgatgatgcccaa2700ctgtttagatcccaacttgaggc組g犯gC6Lga/ttg鄉atgtgattgt2760aactctgttacctcctttccttttagcatactgccaactaccttgaagagaatacagata2820tctcgttgcc3ttgg郷Cgccagttggtgagatgtttgtggagtatttg2880attgtggttgtgtagatgatatatcacctgeigtttctcccaacagcacgt2940C犯ttg3gt3ttgaa犯ttgccagaacgttactaggtttttgattcctactgccactgaa3000actctccgtatttcgaattgtgagaatgttg肌犯3Ct3tCggtggC3tgtggsggagcg3060gcccagatgacgtcactgaatalttggggstgtaagaagctc犯gtgtcttccagaactc3120cttccatctctc犯ggaactgcgtctgtctgattgtccagaaatagaaggagaattgccc3180ttcaatttag犯atactccgtatcstatattgcaags犯ctggtg犯tggccgaaaggag3240tggcatttacaigsgactcac聊gttatggatcgatcatgatgggagtgacgaagatatt3300gaacattgggagttgccttgttctattcagagacttaccataaagaatcttaaaacatta33603gC3gCC33Catctca犯agcctcacctctcttcaatatctatgtattgagggttattta3420tctcagattc3gtC8C犯ggccagctttcctccttttctcacctcacttcgcttcaaact3480ctacaaatctggaatttccttaatctcc犯tcacttgctgaatcagcactgccctcctcc3540ctctctcacctgg,t卿tgattgccctaatctccaatcactcttcgaatcagcactg3600ccctcctccctctctcagctgttcatccaggattgccctaatctccaatcccttccattt3660aaagggatgccctcttccctctcta犯ctatctattttcaattgcccattgctcacacca3720ctactagaatttgax;aBggggg肌tsctggccacaaattgctcatattcccatcataaat37808tcgattgg33801<210>3<211〉2592〈212〉謹<213>番茄(Lycopersiconesculent咖)<220><221>g6朋〈222>(1)..(2592)〈223><220〉<221>mutation<222>(1075)..(1081)<223><220〉<221>mutation<222>(1543)..(1543)〈223><220>〈221>mutation<222〉(1381).,(1381)<223>〈220〉<221>mutation<222>(1171)..(1171)<223>〈220〉<221〉mutation〈222〉(1145)..(1145)<223〉<220><221>mutation〈222>(997).,(997)<223><220><221>mutation<222>(847)…(847)<223〉<220><221〉mutation<222>(806).(806)<223><220〉<221>mutation〈222〉(725)..(725)<223〉<220〉<221>mutation<222>(715)..(715)〈223〉<220><221>mutation<222〉(672)..(672)<223〉<220〉〈221>mutation<222〉(610)..(610)〈223〉<220>〈221>mutation<222>(530)..(530)<223〉〈220〉<221〉mutation〈222>(517)..(517)〈223〉<220〉<221>mutation<222〉(516)..(516)<223>〈220〉<221〉mutation〈222>(485)..(485)〈223〉<220><221>mutation<222>(405)..(405)<223>200810197310.1说明书第15/15页<400>3atggattgtgattccttatgctatataccttixtctgtcaacttgcttta60tcctcatccttgcctcatttgtgccccg犯gatcaagctctttctcttct120aacatgtttaccattaatcctaatgcttctgattattgttaacatacgta180gacattcagtaactctttcttggaacaaaagracaagttgctgctcatgg240树ggcgtx;c3ttgtg3Cg3gacgacaggacaagtgattgcgcttgacctccgttgcagc300caacttcaaggc犯gtttcattccaatagtagcctctttc皿ctctccaBtctcaaaagg360cttgatttgttttC3Ctgg3tcactcattttggtgagttt420tcaaatttgacgcatctcgatttgtcgcattctagttttacaggtctaattccttctgaa480atctgtcacctttctaaactacacgttcttcgtatatgtggcttagtctt540attttgaactgctccttaagaacttgacccgctcaacctt600gaatctgt犯acatctcttccactattccttcaaatttctcttctcatttaacaactcta660caactttcaggcacsgagttttgcccga犯gagtttttcacctttccaac720ttacaatcccttcatttatcagtc犯tccccagctcacggttaggtttcccacaaccaaa780gtgcatcactcatgacgttatacgtcgatagtgtg犯tsttgctgatagg840catttagccatctaacttcacttcatgagttgtacatgggtcgttgtaat900ctgtc鄉gcctattcctaaacctctatgg犯tctcacca3C8t8gtgtttttgcacctt恥0ggtgataaccatcttg犯ggaccaatttcccatttcacgeitatttgaaaagctca卿gg1020ttatcacttgctttgatggcggacttgagttcttatcctt1080cttgaacggcatcc犯ttccctaactggtccaattccatcc^C3taagc1140ggacttcaaa3CCt3g犯tgtctctacttgtcatcaaaccacttgaatgggagtatacct1200tcctggatattctcccttccttcactggttgagttagactcactttcagt1260犯gagttcaagtccaaaacattaagtgccgttactctaaaacaaaataag1320ctg犯aggtcgt8ttccgaattcactccta￡LCctecaattacttctcctt1380tcacacaataatatcagtggacatatttcttcagctatctgC肌tCtggL31440ttgtt卿cttggg卿她taatttggaggg^caatcccacaatgcgtggttg卿gg1500犯cg幼tacctttcgcatttggaUtgagca犯aac3gacttagtgggacaatcaataca1560acttttagtgttt犯gggtcattagcttgcscgggaat犯gct認gggg1620aaagtcccacgatctatgatcaMtgcaagtatttgacactacttgatctaggtaacaat1680atgttgaatgacacatttccaaactggttgggatacctatttc犯ttg^gattttaagc1740ttgagatc犯at犯gttgcatggtcccatcaaatcttcagcttgtttatg1800ggtcttca犯ttcttgatctatcatctaatggattt3gtggg冊tttacccgsaag肌tt1860ttggggasttg幼gg犯3ttgatg,gtecaggattccc3gagtatatt1920tctgatccatatgatatttattac犯ttatttg3Cg3C犯tttctaca犯ggg3C3卿t1980tatgattctgttcgaattttggattct犯catgattatcaatctctcaaag肌C3g3ttt2040ttccaagcattaittggagatCttgttgg6LCttcgtacgttgaacttgtct2100cacaatgtcttgg3鄉tC3t3t3CCggC8tcatttca犯atttatcagtactcg犯tct2160ttggertc1xtcatctaataaaatcagcggag犯attccgcagcagcttgcatccctcaca2220ttccttg犯gtcttaaatctctctcacaatcatcttgttggatgcatccc2280caatttgattcgttcggg犯cacttcgtacc犯ggg犯tgatgggttecgcggatttcca2340ctctcaaaactttgtggtgggtgacaactccagctg兆ctagatcaagaa2400aagattcaccaatg3tcagttgg卿ggggttctcgtgggttacggttgt2460ggacttgttattggactgtccgtaeitatacataatgtggtcaactcaatatccagcatgg2520ttttcgaggatggattt3肌gttggaacacataattacta2580ag259权利要求1、一种与番茄抗病性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、一种与番茄抗病性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所述3、一种与番茄抗病性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所述。4、根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，在序列表SEQIDNO:l的312bp处有1个A312-G312的碱基突变，在2298bp处有1个G2298-C2298的碱基突变，在2299bp处有1个T2299-G2299的碱基突变，导致序列标签位点多态性(STS)。5、根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，在序列表SEQIDNO:2的3477bp处有A3477-G3477的碱基突变，在3516bp处有T3516-A3516的碱基突变，在3517bp处有G3517-C3517的碱基突变，在3606bp处有T3606-C3606的碱基突变，在3692bp处有C3692-G3692的碱基突变，在3693bp-3713bp之间有10bp的碱基插入，导致STS多态性。6、根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，在序列表SEQIDNO:3的的405bp处有A405-T405的碱基突变，在485bp处有G485-C485的碱基突变，516bp处有A516-C516的碱基突变，在517bp处有T517-G517的碱基突变，在530bp处有G530-A530的碱基突变，在610bp处有A610-C610的碱基突变，在672bp处有G672-A672的碱基突变，在715bp处有T715-C715的碱基突变，在725bp处有C725-G725的碱基突变，在806bp处有C806-A806的碱基突变，在847bp处有A847-G847的碱基突变，在997bp处有A997-C997的碱基突变，在1145bp处有A1145-G1145的碱基突变，在1171bp处有T1171-A1171的碱基突变，在1381bp处有A1381-T1381的碱基突变，在1543bp处有A1543-C1543的碱基突变，在1075bp-1081bp之间有6bp的碱基缺失，导致STS多态性。7、检测权利要求4所述的分子标记的引物对，所述的引物对的正向引物为5'-GCCTCATTCAACTTCCTTCTGG-3',反向引物为5'-GCCAGTATATAACGGTCTAAAC陽3'。8、检测权利要求5所述的分子标记的引物对，所述的引物对的正向引物为5'-CCATCTCTCAAGGMCTGCGTC-3'，反向引物为5'-GTAGTGGTGTGAGCAATGGGCA-3'。9、检测权利要求6所述的分子标记的引物对，所述的引物对的正向引物为C1:5'-GTTCTTATCCTTTMCACCCA-3'，反向引物为C2:5'-TCCCTCCMATTATTACTTCC-3'。10、权利要求4-6任1项所述的分子标记在番茄分子标记辅助育种中的应用。全文摘要本发明属于番茄分子标记制备
技术领域：
。制备得到三段与番茄抗病性状相关的分子标记，它们的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO1，SEQIDNO2和SEQIDNO3所述。定义了这些分子标记的相关碱基的突变位点，检测分析表明，这些碱基突变引起序列标签位点(STS)多态性。本发明已将Tm-2<sup>a</sup>，I-2，Cf-9和Mi等四种抗病基因进行聚合，根据分子标记辅助选择，选育成多抗番茄自交系和F<sub>1</sub>抗病番茄杂交组合。本发明为番茄分子标记辅助育种有提供了一些有用的分子标记。文档编号C12N15/11GK101386857SQ200810197310公开日2009年3月18日申请日期2008年10月21日优先权日2008年10月21日发明者刘忠祥,叶志彪,孙亚林,张余洋,张俊红,李汉霞申请人:华中农业大学