专利名称：：与鸡胚胎死亡性状相关的igf2r基因片段克隆及作为分子标记的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于家禽基因工程
技术领域：
，具体涉及一种鸡胚胎死亡性状相关的/G尸2/基因片段的克隆，选择其突变位点作为鸡遗传标记及其在鸡标记辅助选择上的应用。
背景技术：
：我国是世界上的养鸡人国，鸡蛋产量连续多年居世界第一位，鸡肉产量仅次于美国。种蛋孵化效果、性别比例是重要的生产性状，直接影响养鸡生产效率和经济效益。种蛋孵化率的影响因素已有大量的研究。研究表明鸡品种、年龄、种蛋品质、孵化条件等对孵化效果都有影响，控制这些肉素可以提高孵化率。研究报道认为孵化期间胚胎死亡呈现一定规律。随着分子生物学和生物技术的发展，人们开展了家禽的性别鉴定和调控研究，并取得了一定的进展；同时也从分子水平开展了有关胚胎发育的研究。胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowthfactor,IGF)，因其与胰岛素氨基酸序列有同源性而得名，是一类参与调节碳水化合物、脂类、蛋白质的代谢。IGF通过自分泌或旁分泌途径，调节细胞分裂、分化、程序性死亡、化学趋向等活动，是下丘脑-垂体内分泌调节系统的重要组成部分。胰岛素样生长因子有两种形式IGF-I和IGF-II，二者在氨基酸水平的同源性为62%。1GFs及其受体和结合蛋白等共同组成了胰岛素样生长因子系统(Insulin-likegrowthfactorsystem,IGF系统)，其成员包括胰岛素样生长因子，IGF-I和IGF-II;膜表面受体，包括胰岛素样生长因子I型受体(TGFtypelrec邻tor，IGF-IR)、胰岛素样生长因子II型受体(IGFtypeIIreceptor,IGF-IHl);胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF-bindingprotein,IGFBPs)。到目前为止，己定义了六种IGFBP,分别命名为IGFBP1-IGFBP6。此夕卜，还将IGFBP相关蛋白IGFBP-relatedproteins,IGFBP-rPs)以及一组IGFBP蛋白酶一并归入IGF系统。IGF-I是一种重要的生长刺激因子，对于胚胎和成年期的机体发育均具有重要作用，IGF-I基因缺陷的个体表现为软骨发育不全症(侏儒症)。IGF-I对于大多数细胞而言，都是一种强有力的有丝分裂原，合成是不受生长激素影响的，可促进细胞的增殖，对抗凋亡，提高存活率。IGF-II也是一种非常强的有丝分裂原，可促进多种细胞的增殖，抑制细胞凋亡。正常情况下，其表达受到基因印迹(geneimprinting)的调控(WangZ等,Analysisoflossofheterozygosityonchromosome6inhumanprostatecarcinomaandprostaticintraepithelialneoplasia,Z/20"gfe35Z"g丄/AiweZaZW,2001，30:414-417;LiL等，Relationofseruminsulin-likegrowthfactor-I(IGF-I)andIGFbindingprotein-3toriskofprostatecancer(UnitedStates).Ctmce/"0MCofro/,2003，14:721-726)，来自父本的等位基因被转录，而母本来源的等位基因由于甲基化修饰而发生基因沉默，IGF-II维持适当的转录和表达水平。IGF的功能主要是由细胞膜上的特异性跨膜受体介导，包括1GF-I受体(IGF-IR)和IGF-11受体(IGF-IIR)和胰岛素受体(IR)(LeRoithD等，Molecularandcellularaspectsoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptor.EndocrRev,19%，16:143-163)。IGF-1R属于酪氨酸激酶受体家族，是介导IGF效应的主要受体IR也能结合IGF，介导IGF-I和IGF-II的部分生物学效应(LeRo池D等，Molecularandcellularaspectsoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptor.EndocrRev,1996,16:143-163);IGF-IIR结构与lGF-IR和IR不同'无酪氨酸激酶活性。与IGF-IR不同，IGF-IIR不与IGF-I结合，只结合IGF-II。IGF-IIR,又称为6-磷酸甘露糖受体(Mannose-6-phosphaterec印tor，M6PR)，IGF-IIR最初发现的功能是作为一种非阳离子依赖的6-磷酸甘露糖受体，可结合6-磷酸甘露糖(Mannose-6-phosphate，M6P)和溶酶体酶，主要在内吞和转运胞内带有6-磷酸甘露糖修饰的蛋白等过程中发挥作用(MacDonaldRG等,Asinglereceptorbindsbothinsulin-likegrowthfactorIIandmannose-6-phosphate.Science,1998,239:1134-1137;LeRoithD等,Molecularandcellularaspectsoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptor.EndocrRev,1996，16(2):143—163;ByrdJC等，Mechanismsforhighaffinitymannose6-phosphateligandbindingtotheinsulin-likegrowthfactorIl/mannose6-phosphatereceptor.JBiolChem,2000,275:18638-46)。它是单链I型跨膜分子，胞外结构域很大，由15个平均长度为147个氨基酸残基的重复单位组成，与IGF-II的结合位点位于第11个重复单位上。它是IGF-II清除受体(clearancereceptor),二者的结合可降低细胞外IGF-II的水平，影响IGF-IR的激活，从而抑制IGF-II的功能(LeRo池D等，Molecularandcellularaspectsoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptor.EndocrRev,1996,16(2):143—163)。大量文献手艮道，IGF-IIR是一种肿瘤抑制因子，肝癌、肾上腺皮质肿瘤、乳腺癌等多种肿瘤组织存在IGF-IIR的杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)。首先证明IGF-IIR在生长发育中起作用的证据来自过度生长的Tme(T-maternaleffect)小鼠，IGF-IIR基因敲除后，鼠胚胎个体偏大，循环中IGF-II浓度升高，并常因心脏功能异常导致围产期死亡，而同时敲除IGF-II或IGF-IR基因后这种现象即消除，因此，推测IGF-IIR缺失致死是由于过量IGF-II刺激IGF-IR的结果。研究基因突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因的部分的外显子进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它的功能。
发明内容本发明的目的在于扩增鸡/GF2及基因的DNA序列，以寻找该基因突变位点多态性，筛选与鸡胚胎死亡性状相关的基因作为标记辅助选择的分子标记。本发明通过以下技术方案实现申请人克隆得到一种鸡胚胎死亡性状性关的《尸_2及基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所述。PCR扩增的/(F2及基因组序列全长为305bp,其中包含如序列表SEQIDNO:1所述外显子序列和内含子的序列。测序结果表明在序列表SEQIDNO:l的第219bp处有一个A219-T219的碱基突变，导致乂/wW7-RFLP多态性。其中用于克隆KW2及基因片段所用的引物序列如SEQIDNO:l所示。一种筛选鸡胚胎死亡相关基因分子标记的方法'它按照以下步骤用GenBank报道的鸡胚胎发育相关基因KF2及(GeneID:LOC395817)的DNA序列设计引物；从鸡胚组织中提取基因组DNA，PCR扩增'应用PCR-RFLP的方法检测鸡JG/T2及基因如序列表SEQIDNO:l所示的A219-T219的碱基突变，导致J/WV/-RFLP多态性'并进行其基因型与鸡胚胎相对死亡率的关联分析。本发明为鸡的分子标记辅助育种提供了一个新的遗传标记。更详细技术细节如《具体实施方式》所述。本发明的效果是1、鸡/GF2ft基因部分DNA序列的扩增及其多态性检测PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后测序，测序结果显示PCR产物的长度为305bp。其中包括序列表SEQIDNO:1所示的外显子和内含子。测序结果表明在该片段在序列表SEQIDNO:1的第219bp处有一个A219-T219的碱基突变，测序峰图见图5。2、标记性状关联分析在竹丝鸡和星星黄鸡中，死亡鸡胚和正常发育鸡胚的/GK及基因exon34的力mW/-RFLP基因型和等位基因频率及其与胚胎死亡的关联分析见表1所示。在竹丝鸡中，/(7^2及基因^01134的^/^^/-1^1^多态性对鸡胚胎成活没有影响，差异不显著；在星星黄鸡中，AT基因型的相对死亡率是AA基因型的5.89倍，差异极显著(PO.Ol)。序列表SEQIDNO:1是本发明扩增出的鸡胚胎死亡相关基因/6F^ff的DNA序列；图l:是本发明的技术流程图图2:是本发明克隆的/6K2/基因的部分DNA片段，即如序列表SEQIDNO:1所示(斜体字母表示外显子、下划线字母表示为引物及测序起始序列)。图3:是用于PCR产物直接测序的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。琼脂糖胶浓度为1.2%。1一3泳道为PCR产物，长度为305bp;图中M为泳道DNA分子量标记(100bpDMladder)图4:是鸡/6KSV基因序列表SEQIDNO:1的第219bp处A219-T219的碱基多态性检测结果。图5:PCR产物测序的彩峰图，黑色背景处即为多态位点。具体实施例方式实施例1鸡/GF2/基因部分DNA序列的扩增及其多态性检测1、鸡/(W2fl基因部分DNA序列的扩增1.1引物设计用鸡/(F2及基因GenBank的DNA序列(登录号LOC395817)设计引物，序列信息如下正向引物5'-ggaaaggcagttgcgtaaga-3''反向引物5'-gccaaggaagtatgccaaga-3'。1.2鸡基因组DNA的提取与检测(1)将胚盘和组织样剪碎后用PBS磷酸缓冲液(购自上海二医新生基因科技有限公司.PH二7,2)冲洗，在8000r/min的转速下4'C离心10分钟，弃上清。(2)在离心沉淀中加入1XSET裂解液(SET裂解液配制10mL/L十二烷基硫酸钠(SDS),10醒ol/LEDTA,20mmol/LTrisHClpH8.0)500uL混匀，裂解细胞'在8000r/min的转速下4'C离心10min倒掉上清。(3)重复上一个步骤。(4)在沉淀中加入1XSET500uL和10%十二烷基硫酸钠(即SDS，购自上海生工生物工程技术有限公司，使终浓度为0.5°/。)，再加入蛋白酶K(终浓度为50-100ug/mL)，置于55。C水浴锅消化过夜。(5)上述消化液中加入等体积的平衡酚(pH=8.0)，缓慢颠倒离心管10min，4°C8000r/min离心10min。(6)小心吸取上层含有DNA的上清液移至另一离心管中，再次加入苯酚重复操作(5)。(7)吸取的上清液中加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)，缓慢颠倒离心管10min，4'C8000r/min离心10min。(8)吸取上清后加入氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，缓慢颠倒离心管10min，与以上相同的条件离心。(9)吸取上清液，加入l/10体积的3MNaAc及2倍体积的无水乙醇，转动离心管可见白色的絮状物，即DNA，于-2(TC放置30min。(10)取出冷冻后的样品，于12000r/min转速离心5-8min，去掉上层乙醇，加入70%的乙醇lmL洗涤沉淀，同样的速度离心5-8min。(11)弃去乙醇，在室温下挥发残留乙醇，加入适量的TE溶解DNA。(12)充分溶解后的DNA样可在含有溴化乙锭(EB)的0.8°/。琼脂糖胶上电泳检测，同时在通用的DNA浓度测定仪上测定浓度，于-20。C下存放备用。1.3PCR扩增进行PCR扩增反应体系(20pL)为10xBuffer2.0nL，25mMMg2+2.0jiL，4nM正向引物引物、反向引物各1.0^iL，10mMdNTP0.4(iL,2.5U尔LTaq酶O.化L，500ng/nLDNAl攀,ddH2012.2nL，离心混匀。PCR扩增程序为94。C预热10min—(94。C变性30sec—60。C退火30sec—72。C延伸30sec)x35—72。C延伸lOmin—15。C10min。PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。2pcr-sscp检测及其测序寻找snp位点2.1pcr-sscp检测扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，取4^L扩增产物中加入溴酚蓝变性剂混合物(0.25%溴酚蓝:变性剂=1:4)IOmL,95'C变性15min。变性结束后立即将PCR管置于冰水混合物上冰浴，防止DNA单链复性。然后在胶联度为39:1的10%的聚丙烯酰胺凝胶上点样进行电泳检测。(1)10%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制(总体积为35mL)40%丙烯酰胺溶液9mL双蒸水19mL5XTBE缓冲液(购自北京原平皓生物技术有限公司)3.5mL10。/。AP反应终止液(购自GENMEDSCIENTIFICS,INC.USA大中华区上海分公司)200(iL四甲基乙二胺(TEMED，购自北京拜尔迪生物公司)20fiL将以上溶液于小烧杯中混合摇匀。(2)上样、电泳凝胶聚合后拔出梳子，用注射器吸取1XTBE缓冲液冲洗梳孔，以除去未聚合的胶液'使样品容易沉降。组装好电泳设备，用1%的琼脂糖胶液封闭好玻璃板与电泳槽之间的缝隙，防止电泳缓冲液渗漏。在上下缓冲槽中倒入足量1XTBE电泳缓冲液，用50nL微量进样器将PCR变性产物缓缓注入梳孔。上样完毕后开启电泳仪电源，在110V-120V恒压下电泳6-8小时，直至二甲苯氰电泳指示条带迁移到凝胶底部。(3)凝胶染色电泳完毕，取下玻板，小心地将凝胶从玻板上剥离下来，放入双蒸水中漂洗一次，然后浸入10%乙醇溶液固定5-10min;用1%硝酸脱色3-8min，然后双蒸水迅速漂洗一次，0.2%硝酸银晃动闭光染胶15-25min;染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次10s)，洗去凝胶表面残留的硝酸银溶液。在染胶盒中倒入含3%Na2C03和微量甲醛的显色液，立即快速地晃动胶盒，避免析出的黑色银颗粒在凝胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。注意观察显色情况，目的条带显现清晰后立刻将凝胶转入3%的乙酸溶液，浸泡10min停显。(4)凝胶成像与电泳条带分析将目标条带清晰的凝胶在BIO-RAD凝胶成像系统中进行扫描并保存电泳图谱。根据电泳条带判断基因型。2.2PCR产物的纯化和测序在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mLEpendorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自日本TOYOBO公司)纯化PCR产物。纯化方法为在1.5ml离心管中加入400nL吸附液，在凝胶完全溶解之前将其放置在室温中，且不时进行搅拌，如果想要快速溶解琼脂糖凝胶或溶胶难以溶解时，放入55'C7jK浴锅温浴5min，加入30^L磁珠，经常用漩涡混合器搅拌，并放置2min(室温)，然后放入离心机(6000rpm，5sec)，加入600nL洗净液(用上述试剂盒自带的)，搅拌10sec,离心(6000rpm，5sec)，加入lmL75X无水乙醇，搅拌10sec，瞬时高速离心，彻底去除上清部分(打开微型试管的盖子，55。C下放置5min，干燥)，加入25^L-100nL蒸馏水，搅拌10sec，放置2min后离心(6000rpm，5sec)，回收上清液。上清液中含有回收的目的片段。从两个品种的样品中分别挑选几个DNA样品送到上海生工生物工程技术有限公司进行测序。2.3DNA序列比对及突变位点的鉴定用测序获得的基因序列进行序列同源性比较，用DNAstar5.01软件SeqMan和MegAlign工具对测序峰图进行分析，以鉴定和获得该DNA序列的突变信息。3、PCR-RFLP诊断方法建立3.1PCR产物的扩增PCR产物的扩增如前面所述。3.2PCR产物酶切PCR产物酶切反应体积是10nL，3~5nL的PCR产物中加入2UAlwNI'10xBuffer1,0jiL'用纯水补至10jiL,37。C消化4h。3.3PCR-RFLP检测酶切产物检测由于本试验扩增产物片断较小，所以都用聚丙烯酰胺凝胶进行酶切结果检测'所用的丙烯酰胺胶联度为29:1浓度为8%的凝胶每板胶35mL，配制方法如下(总体积为35mL):30%丙烯酰胺9.3mL双蒸水18.42mL5XTBE:14mL腦AP:0.23mLTEMED:20uL酶切产物中加入2uL溴酚蓝上样缓冲液(购自上海亚培生物科技有限公司)后点样电泳。凝胶的制备和染色方法同具体实施例中的2.1。实施例2:鸡/(7F2/基因变异对胚胎成活产生的遗传效应分析死亡鸡胚和正常发育鸡胚的/GF2及基因exon34的^/^^/-虹0>基因型和等位基因频率及其与胚胎死亡的关联分析如表l所示。在竹丝鸡中，死亡鸡胚中的A和T等位基因频率分别为0.826和0.174，正常发育鸡胚中相应两个位点的等位基因频率分别为0.831和0.169,两组的基因频率无显著差异。在星星黄鸡中，死亡鸡胚中的A和T等位基因频率分别为0.837和0.163，正常发育鸡胚中相应两个位点的等位基因频率分别为0.962和0.038，两组的基因频率显著差异(P0.05)。Logistic回归分析显示在竹丝鸡中，/G^2及基因6乂01134的^/^^/-1^0>多态性对鸡胚胎成活没有影响，差异不显著；在星星黄鸡中，只出现了两种基因型AT和AA，AT基因型的相对死亡率是AA基因型的5.89倍，差异极显著(P<0.01)，在两个品种中的试验结果有一些差别，可能是品种的差异。表1鸡IGF2R外显子34突变基因型频率和基因频率及其与胚胎死亡关联分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><110>华中农业大学<120>与鸡胚胎死亡性状相关的IGF2K基因片段克隆及作为分子标记的应用<130><141>2008-10-21〈160>1<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉306<212〉薩<213〉鸡(Gallusgallus)〈220〉〈221〉gene<222>(1)..(306)<223〉<220><221>mutation〈222>(219)..(219)<223>〈220〉<221>gene<222>(l)..咖〈223〉<220>〈221〉primer—bind〈222〉(290)..(306)〈223><220〉〈221〉exon<222>(56).(289)<223><400>1ggaaaggcagttgcgta卿cttgatctsttctgttcttttctteaaaactgtagctg58Leu1tctgcateactgatggtccaaaaacgttgaatgccgg犯aactaagta106SerAlaSerLeuMetValGinLysArgMetProGluAsnVal51015犯acttt犯cttacgaggateaagtgctgaagettgtttatgaagatg154LysLeuLeuThrArglieLysCysSerLeuPheMetLysMet2025gtgatecttgtcetacagacctea犯atgaageataaaagetatttta202VallieLeuValLeuGinThrSerLysSerlieLysAlalieLeu303540getttgtttgcaagtcatgatgetggagatgacagecagcctgttttt250AlaLeuPheAlaSerHisAspAlaGlyAspAspSerGinProValPhe45505560ctgtcttttgatgagcagacatgcactagttacttctcttggcatactt299LeuSerPheAspGluGinThrCysThrSerTyrPheSer6570ccttggc30权利要求1、一种与鸡胚胎死亡性状相关的IGF2R基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于序列表SEQIDNO:l的第2196bp处有一个A219-T219的碱基突变，导致J/>WV/-RFLP多态性。3、根据权利要求1所述的基因片段，其中克隆所述JGF2及，基因片段的引物对序列如SEQIDNO:l所示。4、权利要求1所述的与鸡胚胎死亡性状相关的/GF2/f基因片段在鸡分子标记辅助选择中的应用。5、一种筛选与鸡胚胎死亡性状相关的J(7F2及基因分子标记的方法，按照以下步骤-用GenBank报道的与鸡胚胎死亡性状相关的/GF2R，基因的DNA序列设计引物；从鸡胚胎基因组中提取DNA，PCR扩增，PCR-RFLP，进行基因型检测和分型。全文摘要本发明属于家禽分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一种与鸡胚胎死亡性状相关的IGF2R基因片段的克隆，以及作为鸡遗传标记的应用。本发明克隆得到一种与鸡胚胎死亡性状相关的IGF2R基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述，在序列表SEQIDNO1的第2196bp处有一个A219-T219的碱基突变，导致AlwNI-RFLP多态性。其制备方法是，用GenBank报道的与鸡胚胎死亡性状相关的IGF2R，基因的DNA序列设计引物；从鸡胚胎基因组中提取DNA，PCR扩增，PCR-RFLP，进行基因型检测和分型。文档编号C12N15/11GK101386851SQ200810197308公开日2009年3月18日申请日期2008年10月21日优先权日2008年10月21日发明者吴俊静,张淑君,翔李,李文明,杨利国,成王,勤童,赵瑞霞申请人:华中农业大学