与猪肉质性状相关的分子标记的克隆及应用的制作方法

专利名称：：与猪肉质性状相关的分子标记的克隆及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于猪的分子标记辅助选择
技术领域：
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与肉质性状相关的分子标记的克隆及应用，该分子标记与CMZ45基因有关，利用本发明克隆的分子标记与猪肉质相关的性状进行关联分析。
背景技术：
：随着人们生活水平的提高以及膳食结构与饮食观念的变化，消费者对肉质提出了更高的要求，色香味俱全的营养优质猪肉成为当前畜牧业发展的首要任务。猪肉品质是一个多因素综合指标。肉质性状包括肌肉颜色(肉色)评分(musclecolorscore)、肌肉pH值(musclepHvalue)、肌肉失水率(waterlosingpercentage)、滴水损失(driploss)、肌肉剪切力.(muscleshearforce)、肌肉大理石纹评分(marblingscore)、肌内脂肪含量(intramuscularfatcontent)、肌纤维直径(diameteroffibers)、嫩度(subjectivetendernessscore)、风味(subjectiveflavorscore)、多汁(subjectivejuicinessscore)等。猪肉质性状为屠宰后测定的性状，因而在选育实践中不能进行直接选择。因此标记辅助选择是肉质性状选择的唯一有效途径。随着分子生物学技术的飞速发展以及猪基因组计划的顺利进行，使得猪重要经济性状的QTL定位以及候选基因的鉴定工作取得了重要进展，目前己经鉴定出的影响猪肉质性状的主效基因包括1)氟垸基因(halothanegene，/fo/):又称氟烷敏感基因或猪应激综合征基因或兰尼定受体1基因，即iI7l基因，是影响猪肉质的主效基因，它能导致灰白水样肉(Pale,soft,exudativepork,PSE肉)。Fujii等(FujiiJ等，■Identificationofamutationinporcineryanodinereceptorassociatedwithmalignanthyperthermia.Science,1991,253:448-51)对氟烷基因的克隆分析和比较发现，正常猪和应激猪的C1843—T1843突变使受体蛋白第615位的精氨酸(Arg)变为半胱氨酸(Cys)，引起兰尼定受体蛋白结构和功能的改变，这种改变导致PSE肉的产生。2)酸肉基因(rendementnapole,iW):iW基因是一个显性遗传基因，是LeRoy等(LeRoyP等，Evidenceforanewmajorgene,influencingmeatqualityinpigs.GenetRes"1990,55:33-40)最先提出的，包括突变的显性基因/JAT和正常的隐性基因m+。其中iAT为不利等位基因，它可以使肌肉中肌糖原含量升高，终端pH值降低，造成酸肉。该基因被定位于15号染色体的p2."2.2(MilanD等'Accuratemappingofthe"acidmeat"JWgeneongeneticandphysicalmapsofpigchromosome15.MammGenome"1996,7:47-51)。3)心脏脂肪酸结合蛋白(if-M5尸)Urban等(UrbanT等，AstudyofassociationsoftheiZ-i^45尸genotypesw他fatandmeatproductionofpigs.JApplGenet.，2002，43:505-9)检测了在97头大白和长白猪中的多态性发现该多态位点与肌内脂肪含量存在相关趋势(P=0.06)。Arnyasi等(ArnyasiM等'InvestigationoftwocandidategenesformeatqualitytraitsinaquantitativetraitlocusregiononSSC6:theporcineshortheterodimerpartnerandheartfattyacidbindingproteingenes.JAnimBreedGenet.'2006，123:198-203)研究表明心脏脂肪酸结合蛋白(/f-FA5尸)与肌内脂肪存在显著关联。高研(高妍，猪/W54S尸基因遗传多态性及与肉质性状的相关分析.吉林大学硕士学位论文'2007)研究表明i^i^BP-Zft"/1(T1324C)多态性与肌内脂肪含量以及长白猪肉色显著关联;H-i^5P-M^I(T1489C)多态性与PIC猪肌内脂肪含量以及杜洛克失水率、大白滴水损失显著关联；W-,v45f-ifoelII(Cl811G)多态性与肌内脂肪含量、PIC猪大理石纹、大白剪切力显著关联。4)钙蛋白酶抑素(C4SD基因Ciobanu等(CiobanuDC等，Newallelesincalpastatingeneareassociatedwithmeatqualitytraitsinpigs.JAnimSci.，2004，82:2829-39)检测了钙蛋白酶抑素(CiST)基因编码区多个SNPs，发现该基因与剪切力性状存在显著关联，与多汁性状存在极显著关联。程丰等(程丰等，猪C4Sr基因PCR-RFLPs与肉质相关性的分析.河南农业科学，2006，2:103-104)在新荣昌I系猪(70头)中检测了G4Sr基因的多态性，结果显示C4Sr-AfrpI酶切位点中DD基因型与肌内脂肪含量存在显著正关联；C4Sr-iisal酶切位点中EF基因型与失水率存在显著负关联。Krzecio等(KrzecioE等，Associationofcalpastatin(CAST/MspI)polymorphismwithmeatqualityparametersoffattenersanditsinteractionwithRYR1genotypes.JAnimBreedGenet.，2005,122:251-8)在4个杂交群体共计201头个体中检测得出CAST-iWipI基因型与滴水损失存在显著关联。Xue等(XueHL等，GeneticpolymorphismsandgeneticeffectsofCASTgeneinpigs.FenZiXiBaoShengWuXueBao.,2007，40:403-9)利用PCR-RFLP方法研究了C45T基因A317G和G2042C位点在多态性，并与经济性状进行关联分析，结果显示这2个位点的单倍型与肌肉嫩度存在显著关联(P<0.05)。与本发明关联的目的基因的研究进展CMZ45基因(cardiomyopathyassociated5:原发性心肌症相关蛋白5)又名ot^c^;^7"、gewe^o"/"3、或Z77VB尸2(dystrobrevinbindingprotein2)基因。该基因在人上位于5q14.1，在小鼠上位于13C3。肌营养不良蛋白基因突变引起肌营养障碍缺陷，进而引起进行性假肥大性肌营养不良症(DMD)。为了探索肌营养不良症的分子机制，Tkatchenko等(TkatchenkoAV等，IdentificationofalteredgeneexpressioninskeletalmusclesfromDuchennemusculardystrophypatients.NeuromusculDisord.，2001，11:269-77)分析了DMD骨骼肌以及正常肌肉中差异表达基因，发现ge"e/tom'"3基因的表达量几乎降低了10倍。Benson等(BensonMA等,Myosprynisanovelbindingpartnerfordysbindininmuscle.JBiolChem.,2004，279:10450-8)通过酵母双杂交筛选dysbindin在肌肉组织中的互作蛋白得到myospryn。myo^po^基因编码3739个氨基酸，其分子量为413.1kDa,等电点为4.71。它只在骨骼肌和心肌中表达。myospryn氨基端含有19拷贝的12个氨基酸的重复序列，羧基端含有BBC,FN3以及SPRY结构域，说明该蛋白属于TRIM蛋白家族。通过免疫共沉淀实验得出dysbindin和myospryn共定位在一起，其作用位点是dysbindin的巻曲螺旋结构。通过以上结果，作者推断myospryn是dysbindin在肌肉组织的特异配体。Durham等(DurhamJT等，MyosprynisadirecttranscriptionaltargetforMEF2Athatencodesastriatedmuscle,alpha-actinin-interacting，costamere-localizedprotein.BiolChem.，2006,281:6841-9)利用DNA芯片技术检测野生型小鼠和MEF2A基因敲除小鼠中差异表达基因，其中一个表达量下降2倍的基因与人CME45基因同源。该基因片段大小为12kb，与心肌线粒体Z线蛋白a辅肌动蛋白互作，并且亚细胞定位结果显示该基因位于胞质。该基因直接位于M五FL4下游，因此作者推测其参与肌纤维的发生过程。myospryn转录本起始位点上游-220bp存在cAMP效应元件(cAMP-responseelement,CRE)结合蛋白(CREbindingprotein,CREB)结合位点，其序列是TAACGTTA。CREB是PKA信号通路的主要效应分子。并且Reynolds等(ReynoldsJG等，DeregulatedPKAsignalingandmyosprynexpressioninmusculardystrophy.JBiolChem"2008Feb5[Epubaheadofprint])通过转录活性实验以及CRE位点突变实验得出myospryn是PKA-CREB信号转导通路的F游靶基因。通过以上资料我们可以得出基因在构建细胞骨架、调节肌肉发育中发挥重要作用。但是其功能研究还不是很透彻，而且目前国内外对基因的研究进展主要集中在小鼠以及人上，未见任何有关猪的该基因的报道。寻找该基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段'也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了猪CAfZ45基因的克隆、定位和SNP检测及与性状关联分析。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术缺陷，克隆一种作为猪标记辅助选择的与猪肉质性状相关的分子标记，并将该分子标记作为猪的标记辅助选择的应用。本发明通过以下技术方案实现--4申请人从猪基因片段中克隆得到一种作为猪标记辅助选择的与生长速度相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。在SEQIDNO:1所示序列的第7189位碱基处有一个A7189<7189的碱基替换，该替换引起氨基酸由异亮氨酸变成亮氨酸，并导致5^TI-RFLP酶切多态性。其中用于检测SEQIDNO:1所示序列的第7189位碱基处有一个A7189~C7189的碱基替换的引物对的DNA序列如下所示.-正向引物5'-ACATAATACCAGAGCCCAAAC-3'，反向引物5'-CTTTTGTGGCACTTTATCTACT-3'。制备上述分子标记的方法，按照以下步骤从猪血液基因组中提取DNA，用人C」WZ45基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80%以上的表达序列标签(EST);然后拼接猪EST-重叠群，设计引物扩增中间未知片段，纯化克隆测序；通过序列分析获得如序列表SEQIDNO:l所述的核苷酸序列(序列全长为12056bp,其编码区(CDS)是从第1个碱基开始到12009位碱基处)。申请人将上述克隆的分子标记成功地应用于与猪肉质相关性状标记辅助选择的关联分析上，从而完成了本发明。序列表SEQIDNO:1是本发明克隆的作为猪肉质相关性状标记的CAfZ45基因片段，序列全长为12056bp,其编码区(CDS)是从第1个碱基幵始到12009位碱基处)；图1:是本发明基因制备的流程图2:是本发明中猪aWZ45基因用于定位的DNA片段。所用的引物序列用下划线标注(括号内为突变的碱基)；图3:是本发明中猪CMK45基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段。所用的引物序列用下划线标注；图4:是本发明中猪CMK45基因5^7T-RFLP的三种基因型(AA，AC,CC)电泳结果。图中M:DNA分子量标准(DL2000)。具体实施例方式实施例l、CME45基因的克隆1、引物设计用人基因cDNA(GenBank收录号NMj53610)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80%以上的ESTs(片段长度大于100bp),将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov八Veb/Search/index.html)査询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计5对引物CMK45P-1F和CA/E45P-1R,CMK45P-2F和CMK45P-2R,CMK45P-3F和CMK45P-3R,CMZ45P-4F和Okffi45P-4R，CMK45P-5F和CA/Z45P-5R，引物信息请参见表1。表l猪CA/K45基因分离的引物信息和PCR扩增条件<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>CMK45P-2R:TCAGTGTAACGGGGCTCAATExon2CA/Z45P-3F:TTTGCCTGTAGAAGAATCExon2121253CMK45P-3R:CCTTGGAAACCACCTCATExon2CMK45P-4F:TCCGTGCTGATGAGGTGGExon3221054CMK45P-4R:CAGGGTGTCCTTGGCAGTExon3CMK45P-5F:ATGGATACTGCCAAGGACAExon3134456CME45P-5R:CCCACCCCAATTTGAATGExon42、PCR产物的纯化、克隆和测序PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mlEpendorff管中，于70'C温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300nl融化的凝胶中加入1mlResin,混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minkolumn挤出。再在注射器中加入80%的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5mlEpendorff管中，lO,OOOg离心2min以干燥Resin,将Minicolumn装入另一个干净的1.5mlEpendorff管中，加入30-50^灭菌水，静置lmin,10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。连接反应:将纯化的PCR产物与pGEM-T载体连接，连接反应总体积是5nl，其中包括2.5nl2xbuffer，0.5(il的T载体(购自Promega公司)，0.5^的纯化PCR产物，0.5nl的T4连接酶，最后加入1nl灭齒水置4'C水浴过夜。感受态细胞的制备；从37'C培养了16~20h的新鲜平板上挑取一个DH5a单菌落接种于2mlLB中，于37'C振荡培养3h,转接1mt菌液于含有30mlLB的盐水瓶中，继续在37'C振荡培养约4h，待OD600达到0.3~0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10~15min,然后将菌液转入离心管中于4°C4，000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4'C4，000g离心10min—次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4'C保存备用。转化无菌状态下取100-120nl感受态细胞于1.5mlEpendorff管中，将5nl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min,42'C热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴34min，加入400nl无抗生素的LB液体培养基，37'C振荡培养45min。取100^tl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-P-D-galactoside,中文名称为异丙基硫代一P-D—半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37'C平放1h后倒置培养。质粒的小量制备挑取平板上的单菌落，接种于2—3mlLB中，37'C300r/min培养过夜。用1.5mlEP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100nl用冰预冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mMTris.Cl(pH8.0),lOmMEDTA(pH8.0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II200ji1，快速颠倒混匀，冰浴5min,然后加入预冷的溶液III[5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml,H2028.5ml]150nl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min,将上清转至另一EP管中，加入苯酚氯仿异戊醇500pl'涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，一2(TC沉淀30min'12000r/min离心5min，沉淀用70%乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE20nl。重组质粒的酶切鉴定取3nl质粒DNA与适量的双蒸水混匀'使其总体积为15fil'加入2—3U限制性内酶EcoRI及2pl相应的10X限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37'C水浴1一2小时，取2—3pl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者'即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序'序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成。用GeneTooll.O软件中的ASSEMBLY程序进行拼接,得到一条长度为12056bp的cDNA序列(见SEQIDNO:1所述)。cDNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)软件，将测序后获得的cDNA序列与GenBank数据库中公布的己知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该cDNA序列的功能信息。检索结果表明获得的该条序列与人CME45基因cDNA(GenBank收录号NM—153610)的序列同源性达81%。实施例2、CME45基因的定位1、用于基因定位的引物序列CMK45M-F:5'-GACTACACCACCCAGAGGCT-3，CAffi45M-R:5'-AAACAGACACCCCGAAGG-3'该弓l物扩增片殷长度为267bp。2、用于基因定位的实验材料用法国Minnesota大学构建的猪辐身于杂种板(INRA—Minnesotaporcineradiationhybridpanel,IMpRH)进行染色体精确定位，该杂种板由法国MartinYote博士Cta6orato^ecfeGe7ze力々weCe//w/az>e,INRA,Castanet-丁olosan，France)^i!曾。IMpRH使用的辐射剂量是7，000-rad。IMpRH包括118个猪x仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29.3%，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是70kb/cR(lRay=100cR)，理论分辨率是145kb。各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从WWW(http:〃www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc,html/)获得。3、PCR分型条j牛PCR反应总体积为10pl，其中模板DNA为20ng，含1Xbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150pmol/L,引物终浓度为0.4pmol/L,2UTaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是94°C5min，循环35次94°C30s,60'C30s,然后72。C20s，最后72'C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，IMpRH分型结果见表2。表2CMK45基因在IMpRH中的PCR分型结果基因分型结果(Typingresults"1101101000CMZ45000001000000100001100000000100010010100001101000000000010010000010000100000000010101010000000000010010000010a表中的分型结果中的"1"阳性克隆，扩增出目的带，"0"表示阴性克隆，未扩增出目的带，"？"表示不能确定。将以卜.的扮测结果提交网姑(http:〃www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.h加lA，统计分析结果，基因位于猪2q21-24，与微卫星SW1602紧密连锁，LOD值为6.74。实施例3、PCR-RFLP诊断方法的jt^1、引物序列SF:5，-ACATAATACCAGAGCCCAAAC-3'SR:5'-CTTTTGTGGCACTTTATCTACT-3'该引物扩增片段长度458bp。2、PCR扩增条件PCR反应总体积20nl,其中猪基因组DNA约100ng'含lxbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150jxmol/L，引物终浓度为0.4pmol/L'2UraDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是94°C5rain，循环35次94'C30s，60°C30s，然后72'C30s,最后72'C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。3、RFLP检测斜牛PCR产物酶切反应体积是10nl，其中10xbuffer1pl，PCR产物35nl，限制性内切酶^^71为0.3nl(lOU&l)，用H2O补足10nl，将样品混匀后离心，37'C水浴4h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第384bp位置是A时，则该5^n酶切位点不存在，5^71酶切后检测结果只有1个片段，长度是458bp(定为等位基因A);但存在A384—C384的碱基替换时，其结果导致第384bp处一个5^71酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为384bp和74bp(定为等位基因C)，三种基因型AA，AC，CC，见图4所示。4、PCR—RFLP—5印71多态性在各猪品种中的分布情况利用PCR-RFLP-5^n检测了6个不同中外猪品种其中具有国外猪血缘的猪种分别是杜洛克、长白和大白猪，具有中国地方猪血缘的猪种分别是通城、清平和小梅山猪。该突变位点在不同猪种中的基因型和基因频率如表3所示，结果显示结果显示在长白中A等位基因占优势,在其它品种中C等位基因占优势，在清平以及小梅山中C等位基因频率接近或等于1。对猪CAffi45基因多态性位点基因频率在不同品种中的分布差异进行检验，差异显著性结果见表4。分析结果表明该位点基因频率在所检测的这6个猪品种中，长白与检测的其它所有品种差异极显著(PO.01);杜洛克与除通城外的其它检测品种差异极显著(PO.01);大白与除通城外的其它检测品种差异极显著(PO.01);小梅山与除清平外的其它检测品种猪差异极显著(PO.Ol)。表36个猪品种基因的ifopn-RFLP的基因型以及基因频率分布情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注肩注承表示P0.05，肩注**表示PO.01;d，2,3c2005(df=2)=5.99,x2o.oi(dfH2)=9.215、本发明的分子标记在猪肉质性状关联分析中的应用试验共检测了193头猪个体中国地方猪通城纯种45头，外来猪大白纯种27头，长白纯种24头，中国地方猪与外来猪的杂交猪大长通(大白X(长白X通城))43头、长大通(长白X(大白X通城))54头的多态，确定其基因型，并进行基因型与经济性状(出生至上市平均日增重、胴体直长、胴体斜长、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、肌内脂肪含量、肉色、眼肌面积、臀部膘厚)的关联分析。利用SAS(视窗V8版)GLM程序对一些性状在不同基因型之间的差异进行最小二乘方差分析。线性模型Y,jklmn=n+Gi+B」+Sk+Q+Fm(C)+s,jklmn其中，Yijktan为性状观察值，n为重复数相等时的性状总平均数，Gi为基因型效应，Bj为屠宰批次效应，Sk为性别效应，d为组合效应，FJC)为组合内的家系效应，eijw皿为随机误差，假定服从N(0，(T2)分布。基因型检测结果表明在193头个体中AA基因型，有27头个体，AC基因型有69头个体，CC基因型有87头个体。基因型与性状关联分析的结果如表5所示。表5CME45基因B印21-RFLP多态不同基因型与部分生产性状的关联分析肉质性状_^屠宰后24小时pH值0.087剪切力0.076失水率0.013*肌内脂肪含量0.061注'表示P《0.05。由表5可知，基因SNP位点对失水率有显著影响(PO.05)，此位点对其它肉质性状如屠宰后24小时pH值、剪切力以及肌内脂肪含量存在相关趋势。对肉质性状有显著影响的CME45基因的不同基因型的最小二乘均数如表6所示。表6不同基因型(A7189C)与肉质性状的关联分析_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注"表示PO.Ol,'表示P0.05。表6表明，AC基因型个体屠宰后24小时pH值以及剪切力较低，CC基因型个体的失水率以及肌内脂肪含量较低。其中'AC基因型个体的失水率与CC型个体存在极显著差异(PO.Ol)，AC基因型个体的肌内脂肪含量与CC型个体存在显著差异(P<0.05)。序列表110〉华中农业大学〈120〉与猪肉质性状相关的分子标记的克隆及应用130>〈141〉2008-10-2460>1<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉12056<212>腿<213〉猪(Susscrofa)<220〉<221>gene<222>(l)..(12056)〈223〉〈220〉<221〉mutation<222>(7189)..(7189)〈223〉〈400〉1gttc犯cggga卿tagtggaat犯cctgggagacc犯ttc犯gcaggtcttccacccct60tgggcctccg犯gaaagtcagacttctggtgtgtgtagtctgg卿ggtcaactctgaat120tctcctccaggg犯tgtttccttteittgtg幼犯agttcggaa犯gaaag180cctaagtcaaaacatgg3tcaccattattacgtcgg犯aggcaacaaaaaaagaaattct240tttgaatcccaagatgttccagcaaacaga犯犯gtaaccccttaatttcsga犯gccag300gtactg肌tacccEig8aag8gaagtcatctactggcatttgLtgat犯gacaga^aa犯ag360caagtacacctcctattactggggC犯tELt3c犯3gaac3c犯gccgttg420gtgtt幼gaccagtctacataggaacagtgcaatataaaatcaagatgtttaattcagtt480taattcctctac肌tttta/tgg犯cattgcc肌agggttatgtaatta犯5403t恥g3gggggaaagatgcatccattagtct3g￡LgCC￡lg3tttaggcaat600cgtgattctactgtagtttccaaaacaggccccaaagcatfLg犯gaagat660agcttgcttcaccctggagsggtgC3CtCtccaaagggtcaaagtccccg720acctctctattcagtcatgaagstcg聊gaaga/tgtacattgattctcctctcagggct780gcatctgccaccaagcccacgccttcctcttat3cgaatgacgacatagcag幼c肌ggiSL840ccacaggtcagcactccaaagtcagtgccacggccacctgctgatgaagcaaaaccccgt900g犯atggagcctgcctctctt3Ctgtgg3tgtatctgcagctgcattcctggaaccagca960aaggaaaaattggaggccgatttacaagaaactataactgaagatcatgactcttcagtc1020tcaccaccttcagtggatgEigataaagaaggaagacgtgtcttctgctgaccattccatt1080tcactggaggcagag犯gggctctctgg肌3C3ggttcaccagcccccgcagcctctatc1140cagg犯gattttggccc卿g卿g卿agttggatctgactgcact卿3C3ggC卿g1200ccagtctctgccctcctcatcttagtgtcagg犯g犯犯t1260gtgcccgagctatccatttctctttctgagcctttagtgtt卿ggagcc1320catctctacgagtagctgctacccctgaacctgaagattcC犯ttt3gt31380tcatagaacttgatteicccagaasgtccatccgtttctgaggagcccttc1440ccacctcgtttggcccctgaagtggagcagagaccattct3CC3ttgCtg15003C肌CgCC犯cacctg犯catgttttgtctgagg犯g犯3tgagtctgtt1560tcgactgattctgcttttgt3tc3gagta/ttctgtcccacaggatcttegCt^Ltg犯Ct8L1620acattgagccagtttctctatctcatgtaaaagctgtatc1680gttttgtccg犯gagg卿3tgatg犯tttgagccttattccccagcttcagtctctacc1740tctgaacactctctctcaccgagcagattcctgagtgccagtccccactg1800ttttccacagttacattggaacacgtagtcctgtccggag犯gaggcctc鄉卿tggg1860cgctacacacceigattccacatctgcttctgaatattcacttccatcacaggcaacgaaa1920gagtcactga3ggaaac犯ctg3CC3to￡Lgtccccattaatgttcctgag1980cccatgatctcgtcagaagagacactgggccatgttcccctgaggtggcc2040tctgtccctgaaggctctctccceicc3g3cggacttctgaatggctggcc2100ccaccactttcagctgctacatctgaacacatggtcctatgaacctagggL2160aal:gagcctttcactccagattcaacactgacctcccaatatgcagttctaccaaacgta2220ccccaaagacagtagttgatgatgtctccctgttgg犯tcaaaaggagtt2280tctgagcacaagattctgtc卿卿agagaaggaagacactgggccatattcccctgag2340gtggcctctgcacctgaacacgctctcccaccggacacaaccgaggggacttctgaatgg2400ctggccccaccactttcagctgctacatctgaacac8tggtcctatcagagaatgagaac2460ctaggaaa^gagcctttcactccatattcaa^ctgscctcccaatatgcagttctacca2520犯cgtaacacagg犯tccccaaagacagtagtCg3tg3tgtctccctgttgga^tcaaaai2580ggagtttctgtctatcagaa犯gacfictgggctgtattcc2640cctg鄉tggcctccgtatctgaacaccctcttccacccgacacaattaaggggatttct2700gaatggc兆gtcccaccgctttcaaccattccatctgaacacgtggccctatcagaagaa2760gagacagtcg卿tggatcggtacacaccctcttctatctctacttctgaattttcagtg2820ccaccatttgElCC3C8lggELgtccatatatcCC3tCgg肌t2880cta犯aggggcctcctcacctgtgaatttctcagaagaagcattggacct2940ttttctccag3CtCtgC2Ltttgtgtcagaattctcatttccatcctatgc3gCCC8gg犯3000gag犯tttgagtgtgattctccaatatgtttaacatcaccgtctgaacac3060actcttttgtcagatgaagacactgagg犯gctgaacttttttctccagactcagcatca3120caagcttccatcccaccatat3ggattccaaaaaggaaattg￡lgCCtggt3180tcactgtt犯ctgcgatggctgcttcaggatattccagcttcgcagaagcacatgaggaa3240ga肌ttgc3tgacacctgtccctgagcatctaagttcatcacggcagcaa3300卿gctg犯cctc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技术领域：
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪肉质性状相关的分子标记的制备与应用。所述的分子标记由CMYA5基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO1的第7189bp处有1个A7189-C7189的碱基替换，导致BspTI-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增CMYA5基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。文档编号C12N15/11GK101386852SQ20081019735公开日2009年3月18日申请日期2008年10月24日优先权日2008年10月24日发明者榜刘,徐学文,斌樊,勤殷,许晓玲申请人:华中农业大学