专利名称：蛋白激酶和/或磷酸酶活性的基于sers的单步实时检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断和筛选器件领域。具体地说，在一些实施方式中，本发明提供激酶 和/或磷酸酶检测系统，其包括与包含增强拉曼光谱信号的纳米级特征的表面连接的一种 或多种激酶和/或磷酸酶底物。
背景技术：
将磷酸根基团(磷酸基团，phosphate group)添加到蛋白或从蛋白除去对于真核 细胞内信号的传输来说是重要的，因此，蛋白磷酸化和脱磷酸化(去磷酸化)调节许多不同 的细胞过程。正常细胞生长以由协调的细胞内信号的复合组构成的紧密调节的信号转导通 路为特征，所述信号调整或改变细胞活性(例如生长、增殖、凋亡等)。相反，瘤(neoplasms) 以去调节的(deregulated)细胞生长为特征。此外，恶性瘤具有侵入正常的组织以及转移 到远离原始瘤的身体部位并且在所述身体部位处生长的能力。认为在许多癌细胞中观察到 的去调节的细胞生长的病因学涉及在控制细胞生长、分裂、分化和凋亡的信号通路中的异 常变化。在瘤形成的许多方面蛋白激酶和/或磷酸酶已经作为重要的细胞调节蛋白出现。 在导致正常细胞信号通路中断的初始事件中经常发生在蛋白激酶和/或磷酸酶介导的信 号过程中的遗传突变。蛋白激酶是将磷酸根基团共价地连接到在蛋白中发现的典型地酪氨 酸、丝氨酸或苏氨酸残基的侧链的酶，而磷酸酶是除去这种磷酸根基团的酶。磷酸化改变重 要的信号蛋白的活性。通过控制这些蛋白的活性，激酶和/或磷酸酶控制大部分细胞过程， 包括但不限于代谢、转录、细胞周期进展、细胞骨架重组、细胞运动、凋亡和分化。随着人类基因组序列的完成，估计有在基因组中编码的大约500种蛋白激酶 (Manning φ (2002)Science 298:19 12-1934 ；Daucey and Sausville(2003)Nature Rev. Drug Discov. 2 :296_313)。这占所有人类基因的约 1. 7% (Manning等(2002) Science 298 19 12-1934)。30种已知肿瘤抑制基因中的大部分和超过100种显性癌基因是蛋白激酶 (Futreal等(2001)Nature 409 :850_852)。这种类型基因中的体细胞突变在大量的人类癌 症中起作用。因此，蛋白激酶提供了干预癌症的潜在药物目标的丰富来源。虽然激酶/磷酸酶蛋白家族代表新型药物目标的丰富来源，但是用于确定化合物 亲和性的发展中的分析是非常有问题的。目前用于蛋白激酶和/或磷酸酶调节剂(例如， 抑制剂或激动剂)的高通量筛选分析测量蛋白或肽底物的磷酸酯(磷酸根)的引入或者损失。大部分建立的用于分析蛋白激酶/磷酸酶调节剂的方法是放射分析，其中用32P或33P 标记ATP的Y磷酸酯(磷酸根)。当在磷转移酶反应期间激酶将Y磷酸酯(磷酸根)转 移到蛋白底物的羟基时，该蛋白变成用同位素共价地标记。相反地，当磷酸酶除去标记的磷 酸酯(磷酸根)时，该蛋白失去同位素标记。从标记的ATP除去该蛋白并且确定放射性蛋 白的量。由于劳动密集的分离步骤和使用的大量放射性，这种分析在高通量形式中的适应 是有问题的。能够较高通量的供选择的放射分析是SPA或闪烁迫近分析。在这种分析中，当标 记的底物与浸渍有闪烁剂的珠子结合时该珠子发光。这种分析受到放射性水平和肽底物效 率的限制。大部分非放射性分析使用识别激酶反应产物即磷酸肽的抗体。结合分析使用用酶 催化发光读出器检测的抗体。这些方法受到试剂可用性、孔涂布以及多个清洗和培育步骤 的限制。
发明内容
在一些实施方式中，本发明涉及用于检测和/或定量样品中一种或多种激酶和/ 或磷酸酶的存在和/或活性的筛选系统。在一些实施方式中，所述系统包括对连接到增强 拉曼光谱学中的信号的底物的目标激酶和/或磷酸酶具有高特异性的激酶和/或磷酸酶底 物。在一些实施方式中，所述底物是包括增强SERS测量中的信号的纳米级特征的底物。因此，在一些实施方式中，提供用于检测激酶和/或磷酸酶活性的器件。该器件典 型地包括拉曼活性表面，该拉曼活性表面包括增强拉曼散射的特征，其中所述表面连接有 至少一种激酶和/或磷酸酶底物分子。在一些实施方式中，所述表面连接有多种激酶底物 (例如，小分子、脂质、肽等)和/或磷酸酶底物分子(例如，磷酸化的小分子、磷酸化的脂 质、磷酸化的肽等)。在一些实施方式中，所述激酶底物分子包括，但不限于，核苷酸、糖、多 糖、聚合物和脂质，而所述磷酸酶底物分子包括，但不限于，磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、 磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。在一些实施方式中，所述激酶底物包括用 于丝氨酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶、和/或酪氨酸激酶的肽底物。在一些实施方式中， 所述底物是用于Src酪氨酸激酶的肽底物。在各种实施方式中，所述多种肽包括至少3种， 优选至少约5种，更优选至少约10、100、500、1000、2000或5000种不同的肽。在一些实施 方式中，所述肽的长度为约5 约50个氨基酸。在一些实施方式中，所述肽可定位使得来 自每种肽的信号能够与来自其它种类肽的信号区别。在各种实施方式中，增强拉曼散射的 特征包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结 (弓形交叉，bowtie)、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼(nanoburger)的多种(多重)纳 米级特征。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征包括选自金属、基于碳的材料、聚合物、 石英材料、液晶材料、金属氧化物材料、盐晶和半导体材料的材料。在一些实施方式中，增强 拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、贵金属复合物的材料。在一些实施方式中， 增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、 CdS 半导体、覆盖有 ZnS 的 CdSe、磁性胶体材料、ZnS、Zn0、Ti02、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、 ZnTe,CdTe> In2S3> In2Se3>Cd3P2>Cd3As2, InAs 和 GaAs 的材料。在一些实施方式中，所述特征 的中心距为约25nm、50nm或50nm到约0. 5 μ m、300nm、200nm或150nm。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征具有约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm或50nm到约200nm、150nm、 IOOnm或75nm的尺寸。在各种实施方式中，所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分 子(例如，至少2种，优选至少5或10种，更优选至少20、50或100种不同的种类)。在一 些实施方式中，所述器件包括包含金纳米锥体的拉曼活性表面；所述激酶底物分子包括多 种蛋白激酶和/或磷酸酶底物；和所述拉曼活性表面构成(包括，comprises)微流体室或 者设置在微流体室中。还提供检测和/或定量样品中激酶或磷酸酶活性的方法。所述方法典型地包括 使所述样品与包括激酶和/或磷酸酶底物序列的分子接触；和通过检测所述肽的拉曼散 射光谱的变化检测所述分子的磷酸化。在一些实施方式中，所述表面连接有多种激酶底物 (例如，小分子、脂质、肽等)和/或磷酸酶底物分子(例如，磷酸化的小分子、磷酸化的脂 质、磷酸化的肽等)。在一些实施方式中，所述激酶底物分子包括，但不限于，核苷酸、糖、多 糖、聚合物和脂质，而磷酸酶底物分子包括，但不限于，磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷酸 化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。在一些实施方式中，所述激酶底物包括用于丝 氨酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶和/或酪氨酸激酶的肽底物。在一些实施方式中，所述 底物是用于Src酪氨酸激酶的肽底物。在各种实施方式中，所述多种肽包括至少3种，优选 至少约5种，更优选至少约10、100、500、1000、2000或5000种不同的肽。在一些实施方式 中，所述肽的长度为约5 约50个氨基酸。在一些实施方式中，所述肽可定位使得来自每 种肽的信号能够与来自其它种类肽的信号区别。在各种实施方式中，增强拉曼散射的特征 包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米 碗、纳米月牙状物和纳米夹饼的多种纳米级特征。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征 包括选自金属、基于碳的材料、聚合物、石英材料、液晶材料、金属氧化物材料、盐晶和半导 体材料的材料。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、贵 金属复合物的材料。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合 金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、 ZnS> ZnO> Ti02> AgI> AgBr> Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe> CdTe> In2S3、In2Se3、Cd3P2> Cd3As2、InAs 禾口 GaAs的材料。在一些实施方式中，所述特征的中心距为约25nm、50nm或50nm到约0. 5 μ m、 300nm、200nm或150nm。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征具有约10nm、15nm、20nm、 25nm、30nm、40nm或50nm到约200nm、150nm、IOOnm或75nm的尺寸。在各种实施方式中，所 述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子(例如，至少2种，优选至少5或10种，更优 选至少20、50或100种不同的种类)。在一些实施方式中，所述器件包括包含金纳米锥体的 拉曼活性表面；所述激酶底物分子包括多种蛋白激酶和/或磷酸酶底物；和所述拉曼活性 表面构成微流体室或者设置在微流体室中。还提供用于检测在一个或多个样品中激酶和/或磷酸酶活性的系统。在各种实施 方式中，所述系统包括如本文所述的用于检测激酶和/或磷酸酶活性的器件(例如，包括 增强拉曼散射的特征的拉曼活性表面，其中所述表面连接有至少一种激酶和/或磷酸酶底 物分子)；和设置以测量该器件的一个或多个区域的表面增强拉曼光谱的拉曼检测探针。 在一些实施方式中，所述器件和/或拉曼检测探针设置在定位器(位置控制器)中。在一 些实施方式中，所述器件设置在χ-y扫描样品台上。在一些实施方式中，所述拉曼检测探针 包括激光传送纤维、物镜、长通滤光器和拉曼散射光收集纤维。在各种实施方式中，所述系统可进一步包括控制数据采集位置的控制计算机。在一些实施方式中，提供筛选用于激酶和/或磷酸酶活性的调节剂的样品的方 法。所述方法典型地包括接触本文所述的用于检测激酶和/或磷酸酶活性的器件(例如， 包括增强拉曼散射的特征的拉曼活性表面，其中所述表面连接有至少一种激酶和/或磷酸 酶底物分子)；当所述激酶和/或磷酸酶底物进行磷酸化或脱磷酸化时进行SERS测量以检 测拉曼散射光谱的变化，其中拉曼光谱变化的抑制表明测试试剂是激酶和/或磷酸酶活性 的抑制剂。在一些实施方式中，所述测试样品包括测试试剂库。在一些实施方式中，所述测 试样品包括包含至少10种或至少20种，优选至少50种或至少100种，更优选至少200种、 300种、400种或500种，且最优选至少1000种或至少5000种不同的测试试剂的测试试剂 库。在各种实施方式中，提供制备用于检测激酶和/或磷酸酶活性的表面的方法，所 述方法包括将激酶和/或磷酸酶底物分子阵列沉积在第一表面上；使所述激酶和/或磷 酸酶底物分子阵列与包括多个增强拉曼散射的特征的SERS表面接触，其中所述接触是在 将所述激酶和/或磷酸酶底物分子从所述第一表面转移到所述SERS表面以形成用于检测 激酶和/或磷酸酶活性的表面的条件下。在一些实施方式中，所述激酶和/或磷酸酶底物 分子带有官能团或者具有官能团的连接物，其与SERS表面反应以形成共价连接。在一些实 施方式中，在软平版印刷基底(例如，PDMS芯片)上形成SERS表面。在一些实施方式中， 所述方法还包括将所述SERS表面设置在微流体结构中或者将所述SERS表面附着到微流 体结构上以形成邻近该SERS表面的孔。在一些实施方式中，所述孔具有1 μ L或更低，或者 0. 5 μ L或更低，或者0. 25 μ L或更低的容积。在一些实施方式中，所述激酶和/或磷酸酶底 物分子阵列包括约20 约500nm的点之间的间隔。在一些实施方式中，形成所述激酶和/ 或磷酸酶底物分子阵列的点具有约20 约500nm的特征尺寸。在一些实施方式中，所述阵 列包括至少3种，优选至少约5种，更优选至少约10、20、30、40或50种，和最优选至少100、 500、1，000、2，000或5，000种不同的底物。在一些实施方式中，所述激酶底物分子选自小分 子、脂质和肽。在一些实施方式中，所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的小分子、磷酸化的脂 质和磷酸化的肽。在一些实施方式中，所述激酶底物分子选自核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂 质。在一些实施方式中，所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷酸化的 多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。在一些实施方式中，所述激酶和/或磷酸酶底物分 子为肽。在一些实施方式中，所述激酶底物包括用于丝氨酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶 和/或酪氨酸激酶的肽底物。在一些实施方式中，所述底物是用于Src酪氨酸激酶的肽底 物。在一些实施方式中，所述肽的长度为约5 约50个氨基酸。在一些实施方式中，所述 肽可定位使得来自每种肽的信号能够与来自其它种类肽的信号区别。在各种实施方式中， 增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空 穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼的多种纳米级特征。在一些实施方式中， 增强拉曼散射的特征包括选自金属、基于碳的材料、聚合物、石英材料、液晶材料、金属氧化 物材料、盐晶和半导体材料的材料。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征包括选自贵金 属、贵金属合金和贵金属复合物的材料。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征包括选 自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的 CdSe、磁性胶体材料、ZnS、ZnO、TiO2, Agl、AgBr、HgI2, PbS、PbSe、ZnTe, CdTe, In2S3, In2Se3,Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs的材料。在一些实施方式中，所述特征的中心距为约25nm、50nm 或50nm到约0. 5ym、300nm、200nm或150nm。在一些实施方式中，增强拉曼散射的特征具有 约 10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm 或 50nm 到约 200nm、150nm、IOOnm 或 75nm 的尺寸。还提供用于制造纳米锥体表面的方法。所述方法典型地包括提供能照相平版印 刷(能光刻)的表面；使所述表面与第一等离子体接触以产生纳米级氧化物岛阵列；蚀刻 所述表面以形成纳米柱阵列；除去在构成所述纳米柱阵列的纳米柱上的氧化物层；和蚀刻 所述纳米柱阵列以形成纳米锥体阵列。在一些实施方式中，所述方法还包括使所述纳米锥 体阵列金属化。在一些实施方式中，所述能照相平版印刷的表面包括硅或锗表面。在一些实 施方式中，所述能照相平版印刷的表面包括选自ZnS、Zn0、Ti02、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、 ZnTe,CdTe> In2S3> In2Se3>Cd3P2>Cd3As2, InAs 和 GaAs 的材料。在一些实施方式中，所述第一 等离子体包括HBr和O2的混合物。在一些实施方式中，蚀刻所述表面以形成纳米柱阵列包 括通过HBr等离子体进行蚀刻。在一些实施方式中，所述氧化物岛层通过SF6等离子体蚀刻 除去。在一些实施方式中，蚀刻所述纳米柱阵列以形成纳米锥体阵列包括通过HBr等离子 体进行蚀刻。在一些实施方式中，所述金属化包括将金属层沉积在所述纳米锥体阵列上，其 中所述金属包括选自贵金属、贵金属合金和贵金属复合物的金属。在一些实施方式中，所述 金属化包括将金属层沉积在所述纳米锥体阵列上，其中所述金属包括选自金、金合金、银、 银合金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材 料、ZnS> ZnO> Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe> CdTe> In2S3、In2Se3、Cd3P2> Cd3As2、InAs 和GaAs的材料。还提供纳米锥体阵列。所述纳米锥体阵列可用于产生拉曼活性表面。在各种实施 方式中，所述阵列包括其上具有多个纳米锥体的表面，其中所述纳米锥体具有平均小于约 IOOnm的特征尺寸和小于约500nm的平均特征间间隔。在各种实施方式中，所述纳米锥体具 有平均小于约50nm的特征尺寸和小于约IOOnm的平均特征间间隔。在一些实施方式中，所 述表面包括选自贵金属、贵金属合金和贵金属复合物的金属。在一些实施方式中，所述表面 包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有 ZnS 的 0(^6、磁性胶体材料、2115、2110、1102、六81、六881~、取12、卩卜5、？卜56、21^6、0( ^、In2S3、 In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs 和 GaAs 的材料。^X“激酶”是催化磷酸根基团(例如，从ATP或其它分子)转移到目标分子如肽或其 它激酶底物的分子。“激酶底物”是指可通过激酶进行磷酸化或者在一些情况下进行脱磷酸化的分子。“磷酸酶”是催化磷酸根基团从目标分子如肽或其它磷酸酶底物转移从而导致该 底物的部分或完全脱磷酸化的分子。“磷酸酶底物”是指可以通过磷酸酶进行部分或完全脱磷酸化的分子。“阵列”是指在固体载体(例如，表面)上不同种类分子的集合。在一些实施方式 中，不同种类的分子位于载体的不同区域，即它们是空间定址的。术语“阵列特征”是指主要包括单种分子的阵列的基本上邻接的域(例如，阵列上 的点)。“拉曼活性底物”是指适合用于表面增强拉曼光谱学(SERs)的底物。在一些实施方式中，所述拉曼活性底物包括增强拉曼散射信号的纳米级特征。关于激酶底物阵列使用的术语“多种激酶底物”表示所述阵列含有在不同位置的 至少两种不同的激酶底物(例如，不同的肽)。类似的“多种磷酸酶底物”表示所述阵列含 有在不同位置的至少两种不同的磷酸酶底物(例如，不同的肽)。在一些实施方式中，底物 可为激酶和磷酸酶底物两者。
图1A-1D说明通过激酶(例如SRC)的蛋白磷酸化(例如，酪氨酸磷酸化)的检测 图解。图IA 说明用于Src激酶(SEQ ID NO=D的底物肽。其具有10个氨基酸，包括在N 末端的半胱氨酸残基和邻近C末端的酪氨酸残基。图IB 底物肽的磷酸化。在肽通过Src 激酶磷酸化之后在酪氨酸残基上的羟基被带负电的磷酸根基团取代。图IC 在增强散射Au 表面上的磷-肽(phosphor-p印tide)折叠。磷-酪氨酸残基的负电荷被吸引更接近亲电 子的Au表面，其中拉曼散射增强是更强的。图ID 计算的相对SERS增强因子相对于酪氨 酸残基到Au表面的距离。酪氨酸残基越接近Au表面，则可获得越强的SERS信号，反之亦 然。图2A-2D显示通过Src激酶的酪氨酸的酪氨酸磷酸化的SERs光谱。图2A显示磷 酸化和未磷酸化的底物的SERs光谱。图2B显示通过纯化Src激酶的实时酪氨酸磷酸化。 1004cm—1归因于酪氨酸残基的苯环呼吸模式。随着越来越多的肽磷酸化，酪氨酸拉曼峰变得 越来越强，表明由于磷酸根基团的负电荷引起的肽折叠。图2C显示时间分辨的磷酸化水平 或者1004cm—1峰增强。检测极限为10 μ L容积中IOpM Src激酶，这给出亚-飞(毫微微) 摩尔激酶检测灵敏度。图2C显示实时抑制实验。该图显示对于单位点阻断(single site blocking)和双位点阻断抑制剂酶的磷酸化水平相对于抑制剂浓度。这两种抑制剂的IC50 浓度分别为44nM和20nM。图3A-3D显示抑制药物筛选数据。图3A显示在与IOnM Src激酶和不同浓度的 Src抑制剂I反应20分钟之后的最终光谱。图3B显示在与IOnM Src激酶和Src抑制剂I 反应中的随时间推移的磷酸化水平。图3C显示在对于各种抑制剂浓度反应20分钟之后的 最终磷酸化水平。在数据的S形拟合之后，Src抑制剂I的IC50浓度为约50nM。图3D显 示在与IOnM Src激酶和AMP-PNP但没有ATP的反应中随时间推移的磷酸化水平。图4A-4D显示在粗细胞溶解产物(裂解物)中实时的酪氨酸磷酸化检测。图4A 显示在引入野生型3T9小鼠成纤维细胞的粗溶解产物之后肽的实时SERS光谱。图4B显示 在引入转染有病毒Src蛋白的3T9小鼠成纤维细胞的粗溶解产物之后肽的实时SERS光谱。 图4C显示时间分辨的磷酸化水平。酪氨酸磷酸化水平在Src+细胞中惊人地提高。图4D 显示不同类型的3T9细胞的磷酸化水平。图5，板块A-E显示抑制药物筛选数据。图6说明纳米锥体阵列。图7说明制造纳米锥体阵列的方案。图8示意性地说明制造包括多个纳米级特征的表面的方案。图9示意性地说明制造SERs激酶检测基底的方法。图10示意性地说明用于在纳米锥体基底上检测激酶活性的SERS检测系统。
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图11示意性地说明自动SERs检测系统的一种设置。
具体实施例方式本发明提供用于研究/表征蛋白/肽底物与激酶(使蛋白磷酸化的酶)和/或磷 酸酶(使蛋白部分或完全脱磷酸化的酶)的相互作用的新型组合物和方法。令人惊讶的发 现是，在合适的条件下，拉曼光谱学可用于有效地检测和/或定量目标分子例如激酶和/或 磷酸酶底物的磷酸化(或脱磷酸化)(参见，例如图IA和1B)。磷酸化反应之前和之后肽的 说明性拉曼光谱如图2A所示。如该图所示，激酶底物(在这种情况下为肽)的磷酸化导致 若干拉曼峰的强度改变，一些峰移位并且新的峰出现。明显地，可使用拉曼光谱学检测激酶 底物的磷酸化。类似地，也可使用拉曼光谱学检测磷酸化的底物的脱磷酸化。因此，在一些 实施方式中，本发明提供包括一种或多种激酶和/或磷酸酶底物分子的检测组合物和/或 检测系统，所述底物分子例如为可通过激酶磷酸化和/或通过磷酸酶脱磷酸化的分子，所 述激酶和/或磷酸酶底物分子连接(例如化学结合)到在表面上的一种或多种纳米颗粒， 或者更优选到一种或多种纳米级特征，其中所述纳米颗粒或者一种或多种纳米级特征起到 增强拉曼光谱学中产生的信号的作用。 在各种实施方式中，特别在所述激酶和/或磷酸酶底物连接到表面(例如，拉曼活 性表面)上的一种或多种纳米级特征时，不同的激酶和/或磷酸酶底物分子可定位在所述 底物上的不同位置，从而形成用于检测一种或多种激酶和/或磷酸酶和/或定量一种或多 种激酶和/或磷酸酶的活性的阵列。图IC说明激酶底物(例如，肽)在拉曼活性表面例如增强散射金表面上的磷酸 化。磷酸化残基(这种情况下为酪氨酸)的负电荷被吸引更接近亲电子的金表面，其中拉 曼散射增强更强，从而改善拉曼信号。如图ID所示，磷酸化残基离金表面越近，则可获得越 强的SERS信号，反之亦然(例如对于脱磷酸化的检测)。因此，包括连接的激酶和/或磷酸酶底物阵列的表面特别是拉曼活性表面提供用 于实时筛选一种或多种激酶和/或磷酸酶的存在和/或活性、和/或一种或多种激酶和/ 或磷酸酶的动力学的定量的有效工具。所述激酶和/或磷酸酶底物阵列也可容易地用于筛 选一种或多种测试试剂(例如，化学药品库)的激酶和/或磷酸酶抑制剂(或激动剂)活 性。因此，在各种实施方式中，本文所述的激酶/磷酸酶筛选系统可用于快速和有效 地筛选上调(upregulate)激酶和/或磷酸酶活性的激酶和/或磷酸酶抑制剂药物(超过 50%的癌症药物是激酶抑制剂药物)或试剂。在一些实施方式中，所述激酶/磷酸酶分析 也可用于例如医生和医院职员的对于癌症的个人化的分子诊断。拉曼活性表面，例如包括增强拉曼光谱学信号的纳米级特征的表面，特别适合用 作本文所述SERs激酶底物阵列的阵列表面。虽然许多纳米级特征(例如，纳米棒、纳米柱、 纳米线、纳米管、纳米盘、纳米月牙状物、纳米级点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、 纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼以及其它纳米等离子体激元增强的纳米结 构)非常适合用于增强拉曼信号，但是在一些实施方式中，纳米锥体的阵列用作阵列表面。 在一些实施方式中，本发明还提供制备纳米级锥体阵列的成批制造方法(参见，例如图7)。 所述方法过程与常规的集成电路制造方法相容，所以可以立刻以非常高的产率并且大量地制造纳米锥体阵列。此外，可使用光刻法将阵列图案化。所述纳米级金锥体阵列含有大量 的相邻的锥体之间的IOnm以下(低于lOnm)的间隙，和跨越所述小间隙的电磁相互耦合产 生非常高的局部场增强，并且拉曼散射信号可增强几十个数量级。其它设计的SERS纳米结 构例如纳米点也可图案化为SERS微阵列。还认识到，虽然对于检测底物的磷酸化描述了各种方法和组合物，但是它们也可 用于检测底物的脱磷酸化和/或底物的磷酸化程度。I.用于SERS激酶/磷酸酶分析的激酶/磷酸酶底物基本上任何可通过激酶磷酸化和/或通过磷酸酶脱磷酸化的分子可用作本文所 述方法和组合物中的激酶/磷酸酶底物。虽然蛋白/肽构成了用于激酶和磷酸酶的最大底 物类型，但是许多其它激酶和/或磷酸酶底物也是已知的。这种底物包括，但不限于，各种 糖(例如，己糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等)、核苷酸/核酸、乙酸酯、丁酸酯、脂肪酸、二氢鞘氨 醇、二酰基甘油、神经酰胺等。作为说明，许多激酶和它们的酶委员会编号(EC编号)，和作 为暗示，激酶底物，显示在表1中。认识到，对于即使不是全部激酶底物也是大部分激酶底 物来说，存在相应的磷酸酶。表1.说明性的激酶和相应的酶委员会编号(EC编号)
权利要求
检测激酶和/或磷酸酶活性的器件，所述器件包括拉曼活性表面，其包括增强拉曼散射的特征；所述表面连接有至少一种激酶和/或磷酸酶底物分子。
2.权利要求1的器件，其中所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子。
3.权利要求2的器件，其中所述激酶底物分子选自小分子、脂质和肽。
4.权利要求2的器件，其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的小分子、磷酸化的脂质 和磷酸化的肽。
5.权利要求3的器件，其中所述激酶底物分子选自核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质。
6.权利要求3的器件，其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、磷 酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。
7.权利要求2的器件，其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子为肽。
8.权利要求7的器件，其中所述肽为用于选自如下的激酶的底物丝氨酸激酶、苏氨酸 激酶、组氨酸激酶和酪氨酸激酶。
9.权利要求7的器件，其中所述肽为用于Src酪氨酸激酶的底物。
10.权利要求2的器件，其中所述多种肽包括至少5种不同的肽。
11.权利要求2的器件，其中所述多种肽包括至少10种不同的肽。
12.权利要求2的器件，其中所述多种肽包括至少100种不同的肽。
13.权利要求2的器件，其中所述肽的长度为约5 约50个氨基酸。
14.权利要求10的器件，其中所述肽定位使得来自每种肽的信号能够与来自其它种类 肽的信号区别。
15.权利要求2的器件，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级 点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼 的多重纳米级特征。
16.权利要求2的器件，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自金属、基于碳的材料、 聚合物、石英材料、液晶材料、金属氧化物材料、盐晶和半导体材料的材料。
17.权利要求2的器件，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、 贵金属复合物的材料。
18.权利要求2的器件，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合 金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、 ZnS> ZnO> Ti02> AgI> AgBr> Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe> CdTe> In2S3、In2Se3、Cd3P2> Cd3As2、InAs 禾口 GaAs的材料。
19.权利要求2的器件，其中所述增强拉曼散射的特征包括金和/或银。
20.权利要求2的器件，其中所述特征的中心距为约25nm 约0.5μ m。
21.权利要求2的器件，其中所述特征的中心距为约75 约150nm。
22.权利要求2的器件，其中所述增强拉曼散射的特征具有约IOnm 约200nm的尺寸。
23.权利要求2的器件，其中所述增强拉曼散射的特征具有约25nm 约150nm的尺寸。
24.权利要求1的器件，其中所述拉曼活性表面构成微流体室或者设置在微流体室中。
25.权利要求1的器件，其中所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子。
26.权利要求25的器件，其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少5个种类。
27.权利要求25的器件，其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少10个种类。
28.权利要求24的器件，其中所述室的容积小于约1μ L0
29.权利要求1的器件，其中 所述拉曼活性表面包括金纳米锥体；所述激酶底物分子包括多种蛋白激酶和/或磷酸酶底物；和 所述拉曼活性表面构成微流体室或者设置在微流体室中。
30.检测和/或定量样品中激酶和/或磷酸酶活性的方法，所述方法包括 使所述样品与包括激酶和/或磷酸酶底物序列的分子接触；和通过检测所述肽的拉曼散射光谱的变化检测所述分子的磷酸化或脱磷酸化。
31.权利要求30的方法，其中所述激酶底物分子选自小分子、脂质和肽。
32.权利要求30的方法，其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的小分子、磷酸化的脂 质和磷酸化的肽。
33.权利要求30的方法，其中所述激酶底物分子选自核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质。
34.权利要求30的方法，其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、 磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。
35.权利要求30的方法，其中所述激酶底物分子为肽。
36.权利要求30的方法，其中所述激酶底物分子为用于选自如下的激酶的底物丝氨 酸激酶、苏氨酸激酶、组氨酸激酶和酪氨酸激酶。
37.权利要求35的方法，其中所述激酶底物为用于SRC酪氨酸激酶的肽底物。
38.权利要求30的方法，其中所述激酶底物分子连接到包括增强拉曼散射的特征的拉 曼活性表面。
39.权利要求38的方法，其中所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子。
40.权利要求39的方法，其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少5个种类。
41.权利要求39的方法，其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少10个种类。
42.权利要求39的方法，其中所述多种激酶和/或磷酸酶底物分子包括至少100个种类。
43.权利要求39的方法，其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子定位使得来自每种激酶 和/或磷酸酶底物的信号能够与来自其它激酶底物的信号区别。
44.权利要求2的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级 点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼 的多重纳米级特征。
45.权利要求38的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括金属或半导体材料。
46.权利要求38的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、 贵金属复合物的材料。
47.权利要求38的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合 金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、 ZnS> ZnO> Ti02> AgI> AgBr> Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe> CdTe> In2S3、In2Se3、Cd3P2> Cd3As2、InAs 禾口GaAs的材料。
48.权利要求38的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括金和/或银。
49.权利要求38的方法，其中所述特征的中心距为约25 约500nm。
50.权利要求38的方法，其中所述特征的中心距为约25nm 约150nm。
51.权利要求38的方法，其中所述增强拉曼散射的特征具有约20nm 约200nm的尺寸。
52.权利要求38的方法，其中所述增强拉曼散射的特征具有约75nm 约150nm的尺寸。
53.权利要求38的方法，其中所述拉曼活性表面构成微流体室或设置在微流体室中。
54.权利要求38的方法，其中所述室的容积小于约1μ L0
55.权利要求38的方法，其中 所述拉曼活性表面包括金纳米锥体；所述激酶底物分子包括多种酪氨酸激酶底物；和 所述拉曼活性表面构成微流体室或设置在微流体室中。
56.在一个或多个样品中检测激酶和/或磷酸酶活性的系统，所述系统包括 权利要求1 29中任一项的器件；和设置为测量所述器件的一个或多个区域的表面增强拉曼光谱的拉曼检测探针。
57.权利要求56的系统，其中器件和/或所述拉曼检测探针设置在定位器中。
58.权利要求61的系统，其中所述器件设置在χ-y扫描样品台上。
59.权利要求61的系统，其中所述拉曼检测探针包括激光传送纤维、物镜、长通滤光器 和拉曼散射光收集纤维。
60.权利要求56的系统，其中所述系统还包括控制数据采集位置的控制计算机。
61.筛选用于激酶和/或磷酸酶活性调节剂的样品的方法，所述方法包括使权利要求1 29中任一项的器件与含有一种或多种测试试剂的测试样品接触； 当所述激酶和/或磷酸酶底物磷酸化或脱磷酸化时进行SERS测量以检测拉曼散射光 谱的变化，其中拉曼光谱变化的抑制表明测试试剂是激酶或磷酸酶活性的抑制剂。
62.权利要求57的方法，其中所述测试样品包括测试试剂库。
63.权利要求62的方法，其中所述测试样品包括含有至少50种不同测试试剂的测试试 剂库。
64.制备用于检测激酶和/或磷酸酶活性的表面的方法，所述方法包括 将激酶和/或磷酸酶底物分子的阵列沉积在第一表面上；使所述激酶和/或磷酸酶底物分子的阵列与包括多个增强拉曼散射的特征的SERS表 面接触，其中所述接触是在将所述激酶和/或磷酸酶底物分子从所述第一表面转移到所述 SERS表面以形成用于检测激酶和/或磷酸酶活性的表面的条件下。
65.权利要求64的方法，其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子带有官能团或者具有官 能团的连接物，其与SERS表面反应以形成共价连接。
66.权利要求64的方法，其中所述SERS表面在软平版印刷基底上形成。
67.权利要求66的方法，其中所述软平版印刷基底包括PDMS芯片。
68.权利要求64的方法，还包括将所述SERs表面设置在微流体结构中或者将所述SERs表面附着到微流体结构上以形成邻近该SERS表面的孔。
69.权利要求72的方法，其中所述孔具有1μ L或更低的容积。
70.权利要求64的方法，其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子的阵列包括约20 约 500nm的在点之间的间隔。
71.权利要求64的方法，其中形成所述激酶和/或磷酸酶底物分子的阵列的点具有约 20 约500nm的特征尺寸。
72.权利要求64的方法，其中所述阵列包括至少5种不同的激酶底物分子。
73.权利要求64的方法，其中所述激酶底物分子选自小分子、脂质和肽。
74.权利要求64的方法，其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的小分子、磷酸化的脂 质和磷酸化的肽。
75.权利要求64的方法，其中所述激酶底物分子选自核苷酸、糖、多糖、聚合物和脂质。
76.权利要求64的方法，其中所述磷酸酶底物分子选自磷酸化的核苷酸、磷酸化的糖、 磷酸化的多糖、磷酸化的聚合物和磷酸化的脂质。
77.权利要求64的方法，其中所述激酶和/或磷酸酶底物分子为肽。
78.权利要求64的方法，其中激酶底物为用于选自如下的激酶的肽底物丝氨酸激酶、 苏氨酸激酶、组氨酸激酶和酪氨酸激酶。
79.权利要求77的方法，其中所述肽为用于Src酪氨酸激酶的底物。
80.权利要求77的方法，其中所述肽的长度为约5 约50个氨基酸。
81.权利要求77的方法，其中所述肽定位使得来自每种肽的信号能够与来自其它种类 肽的信号区别。
82.权利要求64的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自纳米级锥体、纳米级 点、纳米级纤维、纳米管、纳米角、纳米空穴、纳米蝶形结、纳米碗、纳米月牙状物和纳米夹饼 的多重纳米级特征。
83.权利要求64的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括金属或半导体材料。
84.权利要求64的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自贵金属、贵金属合金、 贵金属复合物的材料。
85.权利要求64的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括选自金、金合金、银、银合 金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、 ZnS> ZnO> Ti02> AgI> AgBr> Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe> CdTe> In2S3、In2Se3、Cd3P2> Cd3As2、InAs 禾口 GaAs的材料。
86.权利要求64的方法，其中所述增强拉曼散射的特征包括金和/或银。
87.权利要求642的方法，其中所述特征的中心距为约25nm 约400nm。
88.权利要求64的方法，其中所述特征的中心距为约75nm 约150nm。
89.权利要求64的方法，其中所述增强拉曼散射的特征具有约20nm 约200nm的尺寸。
90.权利要求64的方法，其中所述增强拉曼散射的特征具有约75nm 约150nm的尺寸。
91.制造纳米锥体表面的方法，所述方法包括 提供能照相平版印刷的表面；使所述表面与第一等离子体接触以产生纳米级氧化物岛阵列；蚀刻所述表面以形成纳米柱阵列；除去在构成所述纳米柱阵列的所述纳米柱上的氧化物层；蚀刻所述纳米柱阵列以形成纳米锥体阵列。
92.权利要求91的方法，其中所述方法还包括使所述纳米锥体阵列金属化。
93.权利要求91的方法，其中所述能照相平版印刷的表面包括硅或锗表面。
94.权利要求91的方法，其中所述能照相平版印刷的表面包括选自ZnS、ZnO,TiO2, AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs 和 GaAs 的材料。
95.权利要求91的方法，其中所述第一等离子体包括HBr和O2的混合物。
96.权利要求91的方法，其中所述蚀刻所述表面以形成纳米柱阵列包括通过HBr等离 子体进行蚀刻。
97.权利要求91的方法，其中所述氧化物岛层通过SF6等离子体蚀刻除去。
98.权利要求91的方法，其中所述蚀刻所述纳米柱阵列以形成纳米锥体阵列包括通过 HBr等离子体进行蚀刻。
99.权利要求93的方法，其中所述金属化包括将金属层沉积在所述纳米锥体阵列上， 其中所述金属包括选自贵金属、贵金属合金和贵金属复合物的金属。
100.权利要求93的方法，其中所述金属化包括将金属层沉积在所述纳米锥体阵列上， 其中所述金属包括选自金、金合金、银、银合金、铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半 导体、覆盖有 ZnS 的 CdSe、磁性胶体材料、ZnS、Zn0、Ti02、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、 CdTe> In2S3、In2Se3、Cd3P2> Cd3As2、InAs 禾口 GaAs 的材料。
101.纳米锥体阵列，所述阵列包括其上具有多个纳米锥体的表面，其中所述纳米锥体 具有平均小于约IOOnm的特征尺寸和小于约500nm的平均特征间间隔。
102.权利要求101的纳米锥体阵列，其中所述纳米锥体具有平均小于约50nm的特征尺 寸和小于约IOOnm的平均特征间间隔。
103.权利要求101的纳米锥体阵列，其中所述表面包括选自贵金属、贵金属合金和贵 金属复合物的金属。
104.权利要求101的纳米锥体阵列，其中所述表面包括选自金、金合金、银、银合金、 铜、铜合金、钼、钼合金、CdSe半导体、CdS半导体、覆盖有ZnS的CdSe、磁性胶体材料、ZnS、 Zn0、Ti02、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs 禾口 GaAs 的材料。
全文摘要
本发明提供用于检测和/或定量一种或多种激酶和/或磷酸酶的存在和/或活性的新型组合物和方法。在一些实施方式中，本发明提供用于检测激酶和/或磷酸酶活性的器件，其中所述器件包括包含增强拉曼散射的特征的拉曼活性表面，所述表面连接有多种激酶和/或磷酸酶底物分子。
文档编号C12Q1/42GK101970996SQ200880127723
公开日2011年2月9日 申请日期2008年12月23日 优先权日2007年12月31日
发明者乔纳森·A·埃尔曼, 刘刚, 陈帆青 申请人:加利福尼亚大学董事会