抗冠状病毒药物高通量筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗冠状病毒药物高通量筛选方法，该方法的建立是基于酵母遗传系统的构建。即冠状病毒的N7甲基转移酶能互补酵母菌株N7甲基转移酶的功能，使得其能在含有5-FOA的筛选培养基上生长。利用该系统可以筛选特异性抑制冠状病毒N7甲基转移酶活性的药物库，它具有快速、直接的特点，在筛选过程中可以排除对宿主N7甲基转移酶的影响，克服了传统抗病毒药物筛选系统筛选出的抑制剂对宿主本身的副作用；并且该系统应用96或者384微孔板作为筛选工具，使抗病毒药物筛选实现了高通量型；最重要的是利用该系统筛选出的药物分子对于抗冠状病毒具有专一性，具有十分重要的应用价值。
【专利说明】抗冠状病毒药物高通量筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学、病毒学、生物化学和生物医药技术研究领域。特别是涉及以冠状病毒N7甲基转移酶能互补酵母遗传系统细胞生长为基础，而建立的一种抗冠状病毒药物高通量筛选平台。 【背景技术】
[0002]冠状病毒感染可以造成包括人在内的多种动物的致病，造成急性和慢性呼吸道、肠道及中枢神经系统疾病。引起的人类疾病主要是以发热、干咳、胸闷为主要症状的呼吸系统感染(包括严重急性呼吸综合征，Severe Acute Respiratory Syndromes,简称SARS)(Rota et al., 2003);还可引起婴儿和新生儿急性肠胃炎；另外，冠状病毒也是成人普通感冒的主要病原之一。目前，中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory SyndromeCoronavirus (MERS-CoV))于2012年夏天爆发，截至2013年5月14日，被新型冠状病毒感染的患者中有53%已经死亡，高致死率造成了严重的社会恐慌和经济损失(Cauchemez etal., 2013;de Groot et al., 2013;de Wilde et al.，2013)。截止目前，针对冠状病毒仍无有效的疫苗或者特异性治疗方法，且冠状病毒的广泛存在和高重组率易发生新发野生型病毒，因而是全世界面临的主要健康威胁之一，使得人们不得不通过各种病毒抑制剂筛选方法找寻适当的药物分子(Stockman et al.，2006)。
[0003]控制SARS冠状病毒及新发冠状病毒爆发以及传播的最有力手段，就是开发一种有效的抗病毒方法。目前主要的手段包括:开发失活的SARS冠状病毒疫苗、重组亚单位疫苗、以DNA为基础的重组疫苗和以病毒为载体的重组疫苗(Roberts et al.，2008);开发抑制SARS-CoV与宿主受体结合(Sainz et al.，2006)、进而抑制SARS-CoV进入宿主细胞(Lang et al.,2011)的药物；开发抑制SARS-CoV的复制及转录的药物(如靶向病毒蛋白酶或其他复制转录酶的药物)(Ghosh et al., 2009)和抑制SARS-CoV的组装、出芽及释放的药物。但目前均未有进入临床应用的成果。
[0004]高等真核生物细胞信使RNA (mRNA) (Shatkin, 1976; Shimotohno etal., 1977; Shuman, 2001)及大部分病毒RNA的5’ -端均具有N7甲基化修饰的帽子结构。同时，5’端的帽子修饰具有很多重要的生物学功能:保护信使RNA避免被5’外切酶降解(Schwer et al.，1998);指导前体信使RNA的剪切及核输出(Lewis andIzaurralde, 1997);保证信使 RNA 的稳定性及有效的翻译(Baner jee, 1980; Furuichi andShatkin, 2000;Muthukrishnan et al.，1975)。除此以外，病毒RNA的帽子结构已被证明可以帮助冠状病毒逃避宿主细胞内免疫因子MDA5 (melanoma differentiation-associatedgene5)的识别(Zust et al., 2011)及干扰素诱导蛋白 IFITCIFN-1nduced proteins withtetratricopeptide repeats)介导的免疫抑制(Daffis et al.，2010)。由于病毒本身的加帽机制与宿主细胞内信使RNA的加帽存在差别，使病毒加帽酶作为抗病毒药物靶标成为可能(Bouvet et al., 2010; Dong et al., 2008; Ke et al.，2012)。目前一些抑制病毒加帽系统的广谱药物，如AdoHcy、Sinfungin, ATA等可以抑制冠状病毒的甲基转移酶的活性(Bouvet et al.，2010)。但是这些非特异性的抑制冠状病毒甲基转移酶的药物对宿主本身造成较大的副作用。因此，开发一种能够快速、有效，且在筛选过程中能准确评估药物对宿主本身加帽系统影响的冠状病毒药物抑制筛选平台极为重要。具有较大的应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种基于酵母遗传系统的抗冠状病毒药物高通量筛选方法。
[0006]为实现上述目的，本发明首先提供一种用于抗冠状病毒药物高通量筛选的细胞株，其包括表达人N7甲基转移酶但自身N7甲基转移酶缺失的酵母，以及表达冠状病毒的非结构蛋白14但自身N7甲基转移酶缺失的酵母。
[0007]上述用于抗冠状病毒药物高通量筛选的细胞株，其中冠状病毒为SARS(SevereAcute Respiratory Syndrome) ；MERS-CoV(Middle East Respiratory SyndromeCoronavirus);MHV(murine hepatitis virus) ；TGEV(Transmissible gastroenteritisvirus of swine)或IBV(infectious bronchitis virus)。
[0008]上述用于抗冠状病毒药物高通量筛选的细胞株，其中所述酵母含有质粒:pMceK294A-SARS-CoV-nspl4、pMceK294A-MERS-CoV_nspl4、pMceK294A-MHV-CoV_nspl4、pMceK29 4A-TGEV-CoV-nspl4 或 pMceK294A-1 BV-CoV_nspI 4。 质粒pMceK294A-SARS-CoV-nspl4是指克隆有SARS病毒非结构蛋白nspl4的pMceK294A质粒，其他类似。
[0009]本发明抗冠状病毒药物高通量筛选的方法，是将上述的细胞株在Trp-营养缺陷的培养基上培养，加入待选药物，通过考察药`物对不同转基因的酵母抑制率，筛选药物。所述的Trp-营养缺陷的培养基为Trp-营养缺陷的SD液体培养基。
[0010]具体地，本发明方法是将经5-F0A筛选平板上生长的上述的细胞株接种于Trp-营养缺陷的SD液体培养基中，然后加入各种不同浓度的测试药物，通过反应酵母细胞生长数目的吸光值法来确定药物对表达不同种属N7甲基转移酶蛋白的酵母菌株生长的抑制情况，于30°C条件下摇菌培养，药物作用20小时以后测定酵母菌株的生长情况，从而用于筛选能够抑制酵母菌生长的药物及其浓度。
[0011]本发明以利用酵母菌功能互补遗传体系(冠状病毒的非结构蛋白14(nspl4)转化到N7甲基转移酶缺失的酿酒酵母菌YBS40 (S.cerevisiae strain YBS40)，若它们能够互补酵母菌RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶的功能则能在含有5-F0A培养基上生长)为设计的理论基础。转化不同组的冠状病毒nspl4，发现所有的冠状病毒nspl4都能互补酵母菌YBS40的生长，说明它们均具有N7甲基转移酶的功能(图LA)，因此该筛选系统对于冠状病毒有较广泛的适用性。将分别表达酵母菌本身、人类和SARS-CoV (或其他冠状病毒)的N7甲基转移酶的YBS40酵母菌接种到液体培养基中，分别用细胞直接计数法和分光光度计法测定酵母细胞的数目，最终发现分光光度计法在酵母菌的生长对数期可以如实反映酵母的细胞数目，为高通量、快速筛选抑制冠状病毒甲基转移酶的抑制剂提供了保证(图1.B)。将上述表达不同种属N7甲基转移酶的YBS40酵母菌分别接种于96 (图3、图4)或384微孔板(图6)，加入已经证实对所有N7甲基转移酶具有广谱抑制作用的药物，发现我们建立的筛选平台十分有效。目前已经成功应用于大规模筛选天然化合物提取物药物库和小分子化合物库，以期望筛选得到对人类N7甲基转移酶没有影响，但对冠状病毒N7甲基转移酶具有特异性抑制效果的药物(表1)。
[0012]1.验证冠状病毒非结构蛋白14具有N7甲基转移酶的功能
[0013]在这个筛选系统中，YBS40菌株染色体上ABDl基因被敲除后成为致死表型，稳定表达一个带有URA3筛选标记的质粒，其上含有ABDl基因，以此互补YBS40的生长。同时，URA3能编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，这种酶在嘧啶合成的一些步骤中起催化作用。当5-F0A加入培养基平板上以后，酵母细胞吸收此种药物，在URA3编码的脱羧酶作用下转化成有毒的化合物5-氟尿嘧啶。因此，只有不携带URA3基因的突变株能在含有5-F0A的培养基上生长。所以说当用5-F0A筛选时，YBS40中带URA3的互补质粒丢失，伴随着的ABDl互补基因也就丢失，那么酵母又变为致死表型。只有当被转化的质粒上带有能互补酵母甲基转移酶的基因时，才能使YBS40在含5-F0A的培养基上生长。结果显示，冠状病毒不同组的nspl4蛋白都能够互补酵母菌YBS40的生长，说明它们均具有N7甲基转移酶的功能(图LA)。因此该系统可以用来筛选针对不同冠状病毒的N7甲基转移酶抑制剂。
[0014]2.以酵母遗传学为基础的冠状病毒N7甲基转移酶抑制剂筛选平台的建立
[0015]将表达不同种属N7甲基转移酶(S.cerevisiae (MT-Yeast)、人(MT-Human)和SAR-CoV (MT-SARS))的YBS40酵母菌分别接种于液体培养基中培养，用分光光度计法(图1.B)与细胞直接计数法(图1.C)两种方法分别测定酵母细胞的生长情况，发现在酵母的生长对数期分光光度计法能如实地反应酵母细胞的数目(图1.D)，为直接用吸光值法测定药物抑制酵母菌生长的筛选系统提供了理论依据，使得我们建立的酵母遗传学为基础的冠状病毒N7甲基转移酶抑制剂筛选平台实现大规模性成为可能。
[0016]3.对酵母遗传学为基础的冠状病毒N7甲基转移酶抑制剂筛选平台进行验证和优化`
[0017]在体外原核表达、纯化不同组冠状病毒的N7甲基转移酶(N7_MTase)蛋白(nspl4),然后经生化检测不同药物作用下对其N7_MTase活性的影响，发现AdoHcy、ATA和Sinefungin对所有测试的冠状病毒N7_MTase均具有抑制作用(图2.A)。将这些经体外实验验证有效的药物应用于我们建立的酵母遗传学为基础的冠状病毒N7_MTase抑制剂筛选平台中(96微孔板作为筛选工具)，发现仅仅Sinefungin (100 μ Μ)具有抑制效果，且Sinefungin是一种广谱的N7_MTase抑制剂，对酵母、人类及冠状病毒的N7_MTase活性都有广谱的抑制作用(图3)。为了进一步验证建立的冠状病毒抑制剂筛选系统的有效性，在Sinefungin (0.1 μ M)低浓度作用下观察药物对冠状病毒N7_MTase活性的影响,发现低浓度条件下Sinefungin对酵母N7_MTase具有明显抑制作用，对人类其次，而对冠状病毒抑制作用最弱(图4)。说明该筛选平台能够有效的验证各种抑制的在体内的真是抑制效果，并对潜在药物的抑制效果作出评价。
[0018]针对酵母遗传学为基础的冠状病毒N7甲基转移酶抑制剂筛选平台可以应用于药物库的大规模筛选，以期找到特异性的抗冠状病毒药物。因此，我们将在96微孔板中运行正常的筛选系统应用到384微孔板中，经测试发现在384微孔板中，表达不同种属N7甲基转移酶的YBS40酵母细胞生长更为稳定，且在酵母细胞的生长对数期分光光度计法更能精确地反应细胞数目(图5.Α,Β, C)。利用Sinefungin作为测试药物,经验证发现384微孔板作为筛选工具的抗冠状病毒药物高通量筛选平台运行正常(图5.D，E)。[0019]本发明在酵母菌功能互补遗传系统之上构建了抑制酵母细胞生长的冠状病毒加帽抑制剂筛选平台。该平台以96、384微孔板作为筛选工具，通过吸光值法直接测定表达冠状病毒非结构蛋白14 (Coronavirus nspl4) N7甲基转移酶(N7-methyltransferase, N7_MTase)酵母的生长状况,具备了高通量药物筛选的能力。总之，本研究为大规模筛选冠状病毒加帽酶抑制剂提供了良好的平台:384微孔板作为筛选工具，使得药物耗费量大大减少，节省了成本；仅仅利用分光光度法测定药物对酵母细胞生长的抑制效果，实现了筛选的方便、快捷及直接性。
【专利附图】
【附图说明】[0020]图1以酵母遗传学为基础的冠状病毒N7甲基转移酶抑制剂筛选系统的建立。
[0021](A)将 pMceK294A 空载体、人类 N7 甲基转移酶(N7-MTase)、SARS-CoVN7-MTase(SARS-CoV nsp 14)、MHV-CoV N7-MTase (MHV-CoV nsp 14)、IBV-CoVN7-MTase (IBV-CoV nsp 14)及 TGEV-CoV N7_MTase (TGEV-CoV nsp 14)转化到酿酒酵母
S.cerevisiae N7_MTase缺失的酿酒酵母菌YBS40中，涂布于5-F0A上进行筛选；(B)转化pMceK294A空载体的酵母菌株在96孔板中培养，用分光光度计法测定的生长曲线。每个时间点样品都设有三个重复。(C)用细胞直接计数法测定的酵母生长曲线。每个时间点样品都设有三个重复。(D) (E) (F)分别为分光光度计及细胞直接计数两种方法测得的MT-Yeast、MT-Human和MT-SARS酵母细胞生长数据，绘制XY散点图，以0D595值为横坐标，直接计数法测定的细胞数量为纵坐标，利用最小二乘法绘出两者的回归曲线。
[0022]图2.体外生化检测药物对冠状病毒N7甲基转移酶的影响。
[0023](A) 200nM原核表达纯化的冠状病毒Nsp 14与底物分子GpppA作用，经filter-binding assay,检测冠状病毒nspl4蛋白是否均具有N7甲基转移酶活性。同时在反应体系中加入终浓度为100 μ M的药物，测定不同药物对冠状病毒nspl4表达的N7甲基转移酶活性的影响。图中1:阴性对照:1%DMS0 ；2:AdoHcy ；3:ATA ；4: sinefungin ；5:ribavirin。从左到右柱子分别代表SARS、MHV、IBV和TGEV nspl4蛋白.(B)剂量依赖曲线及SIN对SARS-CoV甲基转移酶活性抑制的IC50值(每个实验组都设置有三个重复)。
[0024]图3.以酵母细胞为基础的N7甲基转移酶抑制剂筛选平台有效性的验证。
[0025](A)测试终浓度为 100 μ M 的 AdoHcy, ATA, Ribavirin, and Sinefungin,对表达酵母本身N7甲基转移酶的YBS40菌(MT-Yeast)生长的影响。蓝色MOCK阴性对照；红色AdoHcy;黄色ATA;紫色Ribavirin;绿色Sinefungin.⑶测试上述四种药物对表达人N7甲基转移酶的YBS40菌株(MT-Human)的影响。(C)测试上诉四种药物对表达SARS-CoV的N7甲基转移酶的酵母菌(MT-SARS)生长的影响。
[0026]图4.Sinefungin对酵母体内表达的、所有冠状病毒属N7甲基转移酶活性的影响。
[0027](A)测试终浓度为0.1 μ M的Sinefungin对表达酿酒酵母S.cerevisiae YBS40(MT-Yeast)、人(MT-Huamn)和 SAR-CoV MTaseCMT-SARS)N7 甲基转移酶的 YBS40酵母菌株生长的抑制。(B)终浓度为0.1 μ M的Sinefungin作为甲基转移酶药物，对属于其他组成员的冠状病毒，在酵母体内表达的N7甲基转移酶活性的抑制情况(C)Sinefungin对MT-Yeast、MT-Human 和 MT-SARS 生长的抑制。IC50 (inhibitor concentration at50%activity)的值如图所示。(D) Sienfungin对属于冠状病毒属其他组成员病毒在酵母体内表达的N7甲基转移酶活性的抑制情况及其IC50值。
[0028]图5.酵母遗传学为基础的冠状病毒N7甲基转移酶抑制剂筛选平台的优化。
[0029](A)、(B)、(C)采用384孔板作为筛药工具，用吸光值及细胞直接计数两种方式测定转化有pMceK294A空载体的YBS40酵母菌株的生长曲线，两种方法测得的数据之间具有较强的相关性，回归方程y=8.4032x+0.0483(R2=0.9917).(D)、(E)在384微孔板中，测定SIN对转化有不同种属甲基转移酶酵母菌株的生长抑制情况，剂量反应曲线及IC50如图所示(每个实验组设置六个重复)。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
[0031]实施例1用于抗冠状病毒药物高通量筛选系统的构建
[0032]酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YBS40(MATa Ieu2ade2trplhis3ura3canlabdl::hisGp360-ABDl)是 Mao 及其同事构建的(Mao, X.，1995.Mol CellBiol 15，4167-74.)。pMceK294A酵母载体是在Saha及其同事构建的YX232MA质粒(Saha, N.,.J Biol Chem274, 16553-62.)的基础上，由本实验室陈宇及其同事构建的，包括pMceK294A-HcmI 质粒(Chen, Y.,Proc Natl Acad Sci U S A106, 3484-9.)。
[0033]将SARS-CoV、MHV、TGEV, IBV的非结构蛋白14 (nsp 14)的编码序列以各自的 cDNA (SARS-CoV WHU strain (GenBank accession n0.AY394850), MHV-A59(GenBankaccession n0.AY700211.1), TGEV(GenBank accession n0.FJ755618.2), and IBV(GenBankaccession n0.AJ311317.1))为模板，经PCR扩增得到其基因序列，然后插入到酵母载体 pMceK294A(2ym，TRPl)的 `BamHI 和 XhoI 位点中。MERS-CoV (GenBank accessionn0.KF192507.1)的nspl4序列(SEQ ID N0.1)经生物化学合成所得，并同样克隆到酵母载# pMceK294A(2 μ m, TRP1)上。
[0034]相关引物如下:
[0035]F YX232MA-MERS-CoV nspl4BamH1:
[0036]5， -CGC ggatcc at TCTCAGATTGTAACTGGCCTTTTTA-3’
[0037]R YX232MA-MERS-CoV nspl4Xho1:
[0038]5’ -CCG ctcgag TTGAACTTTTGTAAAAGTAGACCAGAGA-3’
[0039]F YX232MA-TGEV nspl4BamH1:
[0040]5’ -CGC ggatcc ac GCGAAACCTGAAACTTGTGGTTTAT-3，
[0041]R YX232MA-TGEV nspl4Xho1:
[0042]5’ -CCG ctcgag CTGAAGTGCTTTGCTATTAACAAAA-3’
[0043]F YX232MA-FCoV nspl4BamH1:
[0044]5’ -CGC ggatcc ac GCAAAACCTGAAATTTGTGGTTTGT-3，
[0045]R YX232MA-FCoV nspl4Xho1:
[0046]5’ -CCG ctcgag CTGGAGTGCTTTGATATTAACAAAA-3’
[0047]F YX232MA-1BV nspl4BamH1:
[0048]5’ -CGC ggatcc ac GGTACAGGTTTGTTTAAAATTTGCAA-3’[0049]R YX232MA-1BV nspl4Xho1:
[0050]5’ -CCG ctcgag CTGGAGAGCTGAAAAACTTTTCCAT-3，
[0051]酵母表达质粒的转化
[0052]一步法:
[0053]转化过程中每个待转化酵母表达质粒对应的转化缓冲液:
[0054]105 μ L转化混合液:
【权利要求】
1.用于抗冠状病毒药物高通量筛选的酵母细胞株，其包括表达各种冠状病毒的非结构蛋白nspl4但自身N7甲基转移酶缺失的酵母。
2.根据权利要求1所述的用于抗冠状病毒药物高通量筛选的酵母细胞株，其特征在于，所述冠状病毒为SARS、MERS-CoV, MHV、TGEV或IBV。
3.根据权利要求1或2所述的用于抗冠状病毒药物高通量筛选的酵母细胞株，其特征在于，所述酵母含有质粒:pMceK294A-SARS-CoV-nspl4、pMceK294A-MERS-CoV_nspl4、pMceK294A-MHV-CoV-nspl4、pMceK294A-TGEV-CoV-nspl4 或 pMceK294A-1BV-CoV_nspl4。
4.权利要求1~3任一项所述的细胞株在抗冠状病毒药物高通量筛选中的应用。
5.一种抗冠状病毒药物高通量筛选的方法，该方法是将权利要求1~3任一项所述的细胞株在Trp-营养缺陷的培养基上培养，加入待选药物，通过考察药物对不同转基因的酵母抑制率，筛选药物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该方法使用96微孔板及384微孔板作为筛选工具。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于，所述的Trp-营养缺陷的培养基为Trp-营养缺陷的SD液体培养基。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，将经5-F0A筛选平板上生长的权利要求1~4任一项所述的细胞株接种于Trp-营养缺陷的SD液体培养基中，然后加入测试药物，通过反应酵母细胞生长数目的吸光值法来确定药物对表达不同种属N7甲基转移酶蛋白的酵母菌株生长的抑制情况。
【文档编号】C12Q1/04GK103555599SQ201310542910
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】郭德银, 陈宇, 孙颖, 陶佳莉, 王一 申请人:武汉大学