专利名称：一种三维高通量药物筛选芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的能实现细胞水平高通量药物生物活性筛选的三维聚 二甲基硅氧垸-玻璃芯片及其制备方法，属于微流控芯片技术领域。
技术背景随着微流控技术的发展，药物筛选已成为当前微流控芯片技术中最具潜力的 应用领域之一。单个细胞及胞内微量物质的分析与检测已在微流控芯片中得到初 步实现，但细胞水平的高通量药物筛选仍然是微流控技术发展的难点和热点。而 传统的药物筛选，主要在玻璃培养皿和九十六孔板中操作，工作量繁重，试剂和 药物消耗量大，筛药周期漫长，开发成本高昂。当前，迫切需要开发出一种新型 的药物筛选平台，来加快药物筛选的进度和中药现代化的进程。 发明内容为克服上述现有技术的不足，本发明中利用微机电加工和微塑膜技术创新性 地设计并制作出一种三维微沟道结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)-玻璃芯片，它 在细胞水平的药物筛选中，具有芯片微型化、高通量、低成本、试剂消耗小、试 验数据准确可靠和操作流程简便等优点。实现本发明目的采用的技术方案是 一种三维高通量药物筛选芯片，至少包 括聚二甲基硅氧烷和玻璃载片，其特征是第一层聚二甲基硅氧垸芯片上设有细 胞注入和废液输出沟道；另一层聚二甲基硅氧烷芯片上设有药物浓度梯度沟道和定量细胞培养腔室以及细胞进样打孔处和废液出口打孔处，定量细胞培养腔室与 药物浓度梯度沟道的出口沟道连接，且定量细胞培养腔室通过沟道分别与细胞进 样打孔处和废液出口打孔处连接，，第一层聚二甲基硅氧垸芯片的细胞注入和废 液输出沟道通过细胞进样打孔处和废液出口打孔处与另一层聚二甲基硅氧烷芯 片键合在一起，键合在一起的两层聚二甲基硅氧垸芯片再与玻璃载片键合在一 起。细胞注入和废液输出沟道和药物浓度梯度沟道为单向阻尼结构或沟道内设 有微阔门。所述三维高通量药物筛选芯片的制备方法包括以下步骤(1) 设计细胞注入和废液输出沟道和药物浓度梯度沟道的图形，然后打印出 胶片掩膜，沟道深度为50 100um，沟道宽度为100 3000um，定量细胞培养腔 室尺寸在1000 3000um之间；(2) 在洁净硅片上均匀涂甩上AZ50正型光刻胶；(3) 将涂胶硅片先于70 IOO'C下烘烤固化；(4) 将烘烤后的涂胶硅片与胶片掩膜平行对准贴紧后,紫外充分曝光；(5) 曝光充分后浸入显影溶液，待显影完全后，用去离子水冲洗干净,再吹干， 在涂胶硅片上制作出阳模图形；(6) 重复步骤(1) (5)，分别制备两片出带细胞注入和废液输出沟道和药 物浓度梯度沟道布局的硅片-光刻胶阳模。(7) 将聚二甲基硅氧烷预聚物灌注到制得的两片硅片-光刻阳模上，待气泡排 尽后，烘焙2 3h，直至固化完全；(8) 切割并剥离两片含沟道的聚二甲基硅氧烷，打孔，等离子体处理后，第 一层聚二甲基硅氧烷芯片的细胞注入和废液输出沟道通过细胞进样打孔处和废 液出口打孔处与另一层聚二甲基硅氧烷芯片对准键合得双层聚二甲基硅氧垸芯 片；(9) 将上述双层聚二甲基硅氧烷芯片和玻璃载片等离子体处理后再键合在一起；(10) 70 9(TC烘焙1 2h后，即制作出含两层微沟道结构的三维高通量药物 筛选聚二甲基硅氧烷-玻璃芯片。为尽量减少沟道内阻和稳定流场分布，上述细胞注入和废液输出沟道为分叉 结构；药物浓度梯度的沟道药物浓度梯度沟道为逐级分叉结构，在药物和培养基 的不同的注入流速下，形成一系列药物浓度梯度分布。第一层聚二甲基硅氧烷芯 片的细胞注入和废液输出沟道通过细胞进样打孔处和废液出口打孔处与另一层 聚二甲基硅氧烷芯片对准键合.得双层聚二甲基硅氧烷芯片，双层聚二甲基硅氧垸 芯片的两层沟道通过数个微孔贯通，沟道呈现出三维分布；为了准确控制流体在 沟道内的流向，在沟道的局部位置设计为单向阻尼结构或沟道内设有微气阀，以 阻止细胞悬浮液进入浓度梯度沟道。上述的细胞注入和废液输出沟道为分叉结构，且细胞注入和废液输出沟道深度为50 100um，宽度为300 3000um。药物浓度梯度沟道为逐级分叉结构，且 沟道深度为50 100um，宽度为100 1000um。为了保证试验数据的精确性，细胞定量培养微腔室实现细胞的定量培养，向 各个腔室中注满均匀分布细胞悬浮液，由于等体积和等浓度条件，使得每个培养 腔室中的细胞数目近似相等。为了使试验数据能在统计学上有意义，定量细胞培 养腔室构成三行平行试验组微腔室、两行空白对照组微腔室和一行阳性对照组微 腔室。本发明的具有如下优点(1) 本发明实现了药物筛选芯片微型化，高通量筛选，细胞定量化和操作简便 的技术功能，并且很大程度地节约了药物筛选的成本和縮短了新药开发的周期。(2) 在细胞注入和废液出口沟道处的平滑分叉结构，达到了减少沟道内阻和稳 定流场分布的目的；并且在微腔室的药物注入旁路沟道上设计了单向阻尼结构或 沟道内设有微阀门，能够精确地控制细胞悬浮液不进入浓度梯度沟道,增加了药 物筛选芯片内两个流场的稳定性和通畅性；定量细胞培养腔室构成三行平行试验 组、两行空白对照组和一行阳性对照组的微腔室，使得试验数据的准确性和可对 比性以及统计学意义，对药物筛选具有良好的指导性。细胞培养微腔室通过等体 积法来实现细胞定量，可用MTT法或荧光检验法来检测细胞在药物作用下的成活 情况，还可用于指导细胞水平上的药物筛选，并且具有操作简便、高通量筛选等 优点。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明。图1是上层聚二甲基硅氧烷芯片中的沟道结构示意图。图2是下层聚二甲基硅氧垸芯片中的沟道结构示意图。图3是浓度梯度沟道结构示意图。图4是细胞培养腔室结构示意图。图5是本发明聚二甲基硅氧垸-玻璃芯片结构示意图。图中，1.细胞注入口， 2.细胞注入支流沟道，3.废液支路沟道,4.废液出口， 5.浓度梯度沟道，6.细胞培养腔室，7.细胞进样打孔处，8.三组细胞培养平行腔 室，9.废液出口打孔处，IO.两组空白对照腔室，11.阳性药物对照细胞培养腔室，12.细胞培养基入口， 13.药物入口，14.折线状浓度梯度沟道，15.单向阻尼沟道， 16.细胞进样打孔处，17.药物注入沟道，18.药物入口， 19.细胞培养腔室，20. 废液出口打孔处，21.细胞培养基入口， 22.待测药物入口， 23.细胞培养基入口， 24.阳性药物入口。
具体实施方式
本发明中高通量药物筛选芯片的制作步骤为(1) 利用Coredraw绘图软件设计如图1和图2所示的沟道图形，图1所示 细胞注入和废液输出沟道为平滑分叉结构，细胞注入口 1引出两条细胞注入支流 沟道2，每条细胞注入支流沟道又分别引出两条细胞注入支流沟道，废液出口4 引出3条废液支路沟道3。图2所示沟道包括浓度梯度沟道5，定量细胞培养腔 室6，细胞进样打孔处7，废液出口打孔处9，细胞培养腔室构成的三组细胞培 养平行腔室8、两组空白对照腔室10和阳性药物对照细胞培养腔室11。如图3 所示药物浓度梯度沟道14呈六边形构成的蜂窝状，且六边形的每条边为折线， Cl、 C2、 C3、 C4、 C5分别为呈不同浓度的药物出口沟道。细胞培养腔室结构如 图4所示，定量细胞培养腔室19通过沟道与设在下层聚二甲基硅氧烷芯片上的 细胞进样打孔处16和废液出口打孔处20连接，药物入口 18通过单向阻尼沟道 15与药物注入沟道17连接，药物注入沟道17即为药物浓度梯度沟道14的药物 出口沟道。细胞注入和废液输出沟道为分叉结构，且细胞注入和废液输出沟道深度为 50 100um，宽度为300 3000um。药物浓度梯度沟道5为逐级分叉结构，且沟 道深度为50 100ura，宽度为100 1000um。细胞培养腔室6、细胞培养平行腔室8、空白对照腔室10和阳性药物对照细 胞培养腔室11尺寸为1000 3000um，然后用菲林打印机打印胶片掩膜；(2) 在4英寸洁净硅片上均匀涂甩上50um厚的AZ50正型光刻胶；(3) 将涂胶硅片先于7(TC下烘烤6min,再于IO(TC下烘烤固化；(4) 将烘烤后的涂胶硅片与胶片掩膜平行对准贴紧后,紫外充分曝光35s;(5) 曝光完成后，浸入显影溶液，待显影完全后，用去离子水冲洗干净，再吹 干，便在硅片上制作出阳模图形；(6) 利用上述制作工艺，制备出两片具有如图1和图2所示沟道布局的硅片-光刻胶阳模。(7) 将聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物灌注到上述两片阳模上，待气泡排尽 后，烘焙2-3h加速聚二甲基硅氧烷(TOMS)的固化；(8) 固化完全后，切割并剥离两含沟道的聚二甲基硅氧垸(PDMS)，打孔，3min 的等离子体(PLASMA)处理后，细胞注入支流沟道2与细胞进样打孔处16对准键 合，细胞废液支流沟道3和废液出口打孔20处对准键合，上下两层PDMS芯片键 和在一起；(9) 将上述双层PDMS芯片和玻璃载片3min的等离子体(PLASMA)处理后再键 合起来；(10) 70-90'C烘焙l-2h后，即制作出含两层微沟道结构的三维高通量药物筛 选聚二甲基硅氧垸(PDMS)-玻璃芯片。用上述方法制得的三维高通量药物筛选芯片由双层聚二甲基硅氧烷芯片与 玻璃载片键合而成，如图5所示。其中第一层聚二甲基硅氧烷-玻璃芯片上设有 细胞注入和废液输出沟道，另一层聚二甲基硅氧垸芯片上设有药物浓度梯度沟道 和定量细胞培养腔室以及细胞进样打孔处和废液出口打孔处，定量细胞培养腔室 与药物浓度梯度沟道的出口沟道连接，且定量细胞培养腔室通过沟道分别与细胞 进样打孔处和废液出口打孔处连接，，第一层聚二甲基硅氧垸芯片的细胞注入和 废液输出沟道通过细胞进样打孔处和废液出口打孔处与另一层聚二甲基硅氧烷 芯片键合在一起，键和在一起的两层聚二甲基硅氧烷芯片再与玻璃载片键合在一 起。细胞培养腔室构成三行平行试验微腔室、两行空白对照微腔室和一行阳性对 照微腔室。本发明中三维芯片高通量药物筛选的操作步骤为1) 排气，往整个芯片沟道内注满PBS缓冲液，使芯片沟道内部气体排尽。2) 灌注细胞，将细胞悬浮液从细胞进样口 1注入图4所示微腔室中，使各个 培养腔室中灌注等量细胞悬浮液。3) 将芯片放入5%0)2培养箱中，静置4 8h后，细胞逐渐实现贴壁。4) 贴壁完成后，将呈药物浓度梯度的培养基通入培养微腔室，5。/。C02培养箱 中36. 5"恒温培养24-48h ，再用PBS缓冲液将多余药物冲洗干净。5) 从细胞培养基入口 21禾C(细胞培养基入口 23注入含四甲基偶氮唑盐(MTT试剂)的培养基，使其注入各个微腔室，然后5%0)2培养箱中36.5。C恒温培养 10h,再用PBS缓冲液将微腔室内多余四甲基偶氮唑盐(MTT试剂)冲洗干净。6) 从细胞培养基入口注入二甲基亚砜(DMS0)，使其流入各个微腔室，摇晃 10-15min，用光纤光谱仪测量各个微腔室中残留物的吸收光谱，数据处理后，绘 制出不同药物浓度下的细胞生长曲线。7) 分析试验所得的统计数据，找出药物对细胞作用的量效关系，从而检验评 价药物的疗效作用。本发明的药物筛选芯片，通过实验验证，完全达到药物筛选的使用要求。
权利要求
1.一种三维高通量药物筛选芯片，至少包括聚二甲基硅氧烷和玻璃载片，其特征是第一层聚二甲基硅氧烷芯片上设有细胞注入和废液输出沟道；另一层聚二甲基硅氧烷芯片上设有药物浓度梯度沟道和定量细胞培养腔室以及细胞进样打孔处和废液出口打孔处，定量细胞培养腔室与药物浓度梯度沟道的出口沟道连接，且定量细胞培养腔室通过沟道分别与细胞进样打孔处和废液出口打孔处连接，第一层聚二甲基硅氧烷芯片的细胞注入和废液输出沟道通过细胞进样打孔处和废液出口打孔处与另一层聚二甲基硅氧烷芯片键合在一起，键合在一起的两层聚二甲基硅氧烷芯片再与玻璃载片键合在一起。
2. 根据权利要求1所述的三维高通量药物筛选芯片，其特征是定量细胞培养 腔室构成平行试验组微腔室、空白对照组微腔室和阳性药物对照组微腔室。
3. 根据权利要求l所述的三维高通量药物筛选芯片，其特征是细胞注入和废液输出沟道为分叉结构，且细胞注入和废液输出沟道深度为50 100um，宽度为 300 3000um。
4. 根据权利要求l所述的三维高通量药物筛选芯片，其特征是药物浓度梯度 沟道为逐级分叉结构，且沟道深度为50 100um，宽度为100 1000um。
5. 根据权利要求1所述的三维高通量药物筛选芯片，其特征是定量细胞培养 腔室尺寸在1000 3000um之间。
6. 根据权利要求1或2或3所述的三维高通量药物筛选芯片，其特征是细胞 注入和废液输出沟道和药物浓度梯度沟道为单向阻尼结构或沟道内设有微阀门。
7. —种权利要求1所述三维高通量药物筛选芯片的制备方法，其特征是包括以下 步骤(1) 设计细胞注入和废液输出沟道和药物浓度梯度沟道的图形，然后打印出 胶片掩膜，沟道深度为50 100um，沟道宽度为100 3000um，定量细胞培养腔 室尺寸在1000 3000咖之间；(2) 在洁净硅片上均匀涂甩上AZ50正型光刻胶；(3) 将涂胶硅片先于70 IO(TC下烘烤固化；(4) 将烘烤后的涂胶硅片与胶片掩膜平行对准贴紧后，紫外充分曝光；(5) 曝光充分后浸入显影溶液，待显影完全后，用去离子水冲洗干净,再吹干，在涂胶硅片上制作出阳模图形；(6) 重复步骤(1) (5)，分别制备两片出带细胞注入和废液输出沟道和药 物浓度梯度沟道布局的硅片-光刻胶阳模。(7) 将聚二甲基硅氧烷预聚物灌注到制得的两片硅片-光刻阳模上，待气泡排 尽后，烘焙2 3h，直至固化完全；(8) 切割并剥离两片含沟道的聚二甲基硅氧烷，打孔，等离子体处理后，第一层聚二甲基硅氧垸芯片的细胞注入和废液输出沟道通过细胞进样打孔处和废 液出口打孔处与另一层聚二甲基硅氧垸芯片对准键合得双层聚二甲基硅氧烷芯片；(9) 将上述双层聚二甲基硅氧垸芯片和玻璃载片等离子体处理后再键合在一起；(10) 70 9(TC烘焙1 2h后，即制作出含两层微沟道结构的三维高通量药物 筛选聚二甲基硅氧垸-玻璃芯片。
8. 根据权利要求7所述三维高通量药物筛选芯片的制备方法，其特征是步骤(1) 中设计的细胞注入和废液输出沟道中的细胞注入口为分叉结构。
9. 根据权利要求7所述三维高通量药物筛选芯片的制备方法，其特征是步骤(l) 中设计的药物浓度梯度沟道药物浓度梯度沟道为逐级分叉结构。
全文摘要
本发明公开了一种三维高通量药物筛选PDMS-玻璃芯片及其制备方法，利用微机电加工和微塑膜技术，制作出一种两层微沟道结构的三维PDMS-玻璃芯片。第一层PDMS芯片的细胞注入和废液输出沟道与另一层聚二甲基硅氧烷芯片键合在一起，另一层PDMS芯片上设有药物浓度梯度沟道和定量细胞培养腔室，定量细胞培养腔室与药物浓度梯度沟道的出口沟道连接，且定量细胞培养腔室通过沟道分别与细胞进样打孔处和废液出口打孔处连接，本发明可以克服传统药物筛选技术中工作量繁重，试剂和药物消耗大，筛选周期长和开发成本高的缺点。在细胞水平的药物筛选应用中，实现芯片微型化、高通量、低成本、试剂消耗小、试验数据准确可靠和操作流程简便的设计要求。
文档编号C12M1/00GK101245311SQ200810046929
公开日2008年8月20日 申请日期2008年2月26日 优先权日2008年2月26日
发明者张南刚, 王晓明, 赵兴中 申请人:武汉大学;湖北中医学院