专利名称：低成瘾性镇痛药物高通量筛选平台的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物高通量筛选的生物学模型，特别是一种用于筛选低成瘾性镇痛药物的生物学模型。
背景技术：
疼痛是一种复杂的生理心理活动，它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉和痛反应。疼痛可以作为机体受到伤害的一种警告，引起机体产生一系列防御性保护反应。然而，疼痛，特别是长期疼痛给患者带来痛苦和不安，剧痛还可以引起失眠或其它生物功能紊乱，甚至导致休克，造成严重的身心损害。疼痛不仅影响个人的生活质量，而且由于慢性痛是一种常见病和多发病，造成社会劳动力及经济的大量损失。
镇痛药能选择性地减轻或消除疼痛及伴随的焦虑不安情绪，并为其他治疗赢得良好的条件。目前，临床上使用的止痛药物基本上只有吗啡及其衍生物，它们都是阿片类受体，特别是μ-型阿片受体的激动剂，具有相似的分子结构和作用机制，具有快速强效的镇痛作用，同时也有较强的成瘾性。因此，这类药物都具有两重性，既是药，也是毒，用以治病是药，用以过瘾是毒。
为了克服吗啡的不良作用，药物学家们合成了数以万计的类似物，但还是没有找到理想的高镇痛活性与低成瘾性的镇痛药，这是与传统止痛药物的筛选和评价方法的局限性分不开的。以吗啡或者吗啡的类似物为基础进行改构，其作用机理依然与吗啡类似，其镇痛活性及其副反应必然与吗啡类似，无法打破“镇痛作用强，成瘾性必强”的传统观念。但是，如果不以吗啡为基础进行改构，而是进行随机设计和筛选，则必须采用强针对性高通量的筛选和传统评价模式相结合，否则工作量将浩如烟海，收效甚微。
分子生物学的发展特别是生物大分子结构与功能的研究使新药的筛选从随机发现到理性药物设计成为可能。理性药物设计是以药物作用靶位分子的空间结构为基础，通过多样性候选文库的构建与高通量筛选方法相结合，分子水平的筛选与整体水平的评价相结合，在较短的周期完成筛选和评价具有针对性的新药。
阿片受体的基因克隆及其结构与功能的研究，使筛选基于不同阿片受体的不同活性的镇痛药物成为可能。研究表明，成瘾性以及吗啡产生的其它副反应与μ-型阿片受体密切相关，而与其它型阿片受体无必然联系，k-型及δ-型阿片受体参与体内的镇痛反应且不介导成瘾性，其它型阿片受体则基本不介导镇痛反应。扬长避短，利用κ-型阿片受体正向筛选并采用μ-型阿片受体反向排除是筛选高效低成瘾性的镇痛药是一种新的途径。
K-型阿片受体的cDNA序列，从起始密码子到终止密码子共计1143个碱基(FredericS，Claire GR，Katia B，Kieffer B.κ-Opioid receptor in humanscDNA and genomic cloning，chromosomal assignment，functional expression，phamarcology and expression pattern in thecentral nervous system.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1995 Vol 927006-7010)。μ-型阿片受体的cDNA序列，从起始密码子到终止密码子共计1233个碱基(Wang JB，Johnson PS，PersicoAM，Hawkins AL，Griffin CA，Uhl GR.Human mu opine receptor.cDNA and genomic clones，pharmacologic characterization and chromosomal assignment.FEBS Lett.1994 Jan 31；338(2)217-22.)发明内容本发明的目的是提供一种低成瘾性镇痛药物高通量筛选平台，也就是提供一种定向筛选k-型阿片受体特异性配体的高通量筛选平台，同时采用μ-型阿片受体进行反向排除，即提供一种定向筛选k-型阿片受体特异性配体同时对μ-型阿片受体不具有特异结合的有效方法。
一种低成瘾性镇痛药物的高通量筛选方法，基本上包括以下步骤1)将规模培养的CHO衍生工程细胞株CHO-OPR8 CGMCC №0613及CHO衍生工程细胞株CHO-P CGMCC №0612分别装入层析柱中，得到CHO-OPR8层析柱及CHO-P层析柱；2)将待选择的肽库上样到CHO-OPR8层析柱，洗涤层析柱后采用洗脱液洗脱与CHO-OPR8特异结合的样品，将收集的洗脱液上样到CHO-P层析柱，收集穿过峰，得到第一轮筛选出的候选多肽；3)将第一轮筛选出的候选多肽再上样到CHO-OPR8层析柱，将收集的洗脱液上样到CHO-P层析柱，收集穿过峰，得到第二轮筛选出的候选多肽；4)将第二轮筛选出的候选多肽再上样到CHO-OPR8层析柱，将收集的洗脱液上样到CHO-P层析柱，收集穿过峰，得到第三轮筛选出的候选多肽；5)将最后一轮筛选的噬菌体全部转染K91Kan，挑选阳性菌株进行接种培养，提取质粒，进行序列分析；6)将复制型噬菌体质粒的序列分析结果与空载体进行比较，寻找插入片段的核苷酸序列，推导出氨基酸序列，得到目的多肽。
上述方法中，装入层析柱中的CHO衍生工程细胞株CHO-OPR8及CHO衍生工程细胞株CH0-P均为无血清微载体培养的细胞。
所述微载体培养是在培养基中加入了2-20mg/ml的大孔径明胶微载体，其中优选的是加入5mg/ml。
为了使筛选的效果更好，在上述方法中，所述第2)步，当肽库样品流入CHO-OPR8层析柱后，迅速加入培养基进行洗涤，洗涤3个柱体积，洗涤用试剂为无血清无微载体培养基(W)，再用加入K-型阿片受特异性配体的洗脱液进行洗涤，该洗脱液的配方为HYCLONE公司CHO无血清培养基中加入U69593至终浓度0.5nmol/L。所述第4)步，当肽库样品流入CHO-OPR8层析柱后，迅速加入培养基进行洗涤，洗涤3个柱体积，再用高盐洗脱液进行洗涤，该洗脱液的配方为HYCLONE公司CHO无血清培养基加入高浓度的盐如0.5mol/L NaCl。
所述第6)步中，推导出氨基酸序列后，将序列进行一级结构的比较和二级结构的分析，得到目的多肽。
本发明CHO衍生工程细胞株CHO-OPR8及CHO衍生工程细胞株CHO-P已于2001年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号分别为CGMCC №0613和CGMCC №0612。
本发明中CHO衍生工程细胞株CHO-OPR8 CGMCC №0613及CHO衍生工程细胞株CHO-P CGMCC №0612的获得过程为1、取人体正常分娩胎盘为组织供体，保存于-70℃低温冰箱中备用。
2、RNA的提取从-70℃低温冰箱中取出胎盘组织样品1克，置于已经降温处理的研钵中，加入少量液氮将组织块磨碎，然后加入10ml Trozol试剂，转入冰浴的匀浆器中进行匀浆破碎细胞，然后加入2毫升氯仿，混匀后离心取上清，进行异丙醇沉淀，离心沉淀后用70％乙醇洗涤，室温干燥后溶解于100μl水中，取2μl进行紫外检测，5μl用来进行逆转录，其余样品置于-70℃备用。脑组织的总RNA购自CLONTECH公司，用于逆转录PCR扩增μ-型阿片受体。
3、逆转录取5μlmRNA样品加入2μlSMARTIII/3’PCR引物，混均后72℃保温2分钟，迅速置于冰上冷却2分钟，依次加入4.0μl5×buffer，2.0μlDTT，2.0μldNTPMix，1.0μlRNase Inhibitor和2.0μlSuperscriptII逆转录酶，混均后至于42℃温箱中保温1小时，-20℃保存备用。
4、PCR扩增根据K-型及μ-型阿片受体的cDNA的序列和序列内限制性内切酶识别位点的情况以及将要克隆载体上酶切位点的有关情况，设计下列引物5’-CATGCCATGGACTCCCCGATCCAGATC-3’(a)5’-CCGCTCGAGTCATACTGGTTTATTCATC-3’(b)
5’-CCGGGTACCATGGACTCCCCGATCCAGATC-3’(c)5’-TCCACGACTGGTTTATTCATC-3’(d)采用Oligo(dT)18(PROMEGA公司产品)作为逆转录引物合成cDNA的一条链之后，采用外侧引物(c)和(d)进行第一轮PCR扩增，再采用内侧引物(a)和(b)进行PCR扩增，PCR扩增的反应循环参数为95℃5分钟，1个循环；95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，30个循环；72℃10分钟，1个循环。
克隆K-型及μ-型阿片受体基因时采用高保真的Taq DNA聚合酶，并采用二轮PCR扩增，反应体系为100ul，检测用普通Taq DNA聚合酶PCR体系，反应体系为25ul。
5、克隆到T载体中并进行酶切鉴定和序列分析将采用高保真PCR扩增的片段进行末端补A，然后进行初步纯化，将纯化的PCR产物与T载体进行连接，连接后的产物进行电激，转化JM109，然后涂LB氨苄青霉素平板。平板上含有IPTG和X-Gal，首先进行蓝白斑筛选，挑取白斑进行接种培养，提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定含有目的的片段大小的克隆进行序列分析进行进一步的鉴定。测序结果显示所获得片段的序列与文献报道的K-型及μ-型阿片受体的cDNA序列完全一致。
6、将K-型及μ-型阿片受体cDNA克隆至真核表达载体中将经过序列分析的K-型及μ-型阿片受体cDNA进行PCR扩增，更换两端的酶切位点，将PCR产物进行初步纯化后进行酶切，将酶切的片段与已经完全双酶切的载体质粒pcDNA3.1(+)进行连接，连接后进行电激转化JM109，然后涂LB氨苄青霉素平板，挑取12个单菌落进行接种培养，提取质粒进行酶切鉴定。一共挑选了11个单克隆的质粒进行酶切鉴定，获得了10个重组质粒，分别命名为pOPR5-10和pMOR1-5。
7、CHO细胞的复苏及培养冻存的CHO细胞(来自ATCC)从液氮中取出后迅速置于37℃恒温水浴锅进行融化，一旦融化，迅速转入装有已经预热的培养基的试管中，混匀后离心收集细胞，然后再用培养基洗涤一次，最后悬浮于8ml培养基中，装入细胞瓶中进行培养。
8、质粒转化CHO细胞取3个细胞培养皿(φ35mm)，各接种1-2×105细胞约1ml，37℃，5％CO2培养过夜，制备转染液A(1-10ugDNA，用无血清的培养基稀释到100ul)和B(10ul脂质体，用无血清的培养基稀释到100ul)；轻轻混匀A和B，室温静置15分钟；用2ml无血清培养基洗涤培养皿中的细胞2次，再加入1ml无血清培养基；然后缓慢加入A和B的混合液；混匀后37℃，5％CO2培养24小时，吸除无血清培养基，约一个星期后对照出现细胞大量死亡，而质粒转化的CHO细胞则出现大量的细胞集落，用维持培养基(含有200ug/mlG418)进行继续培养。
9、单克隆细胞株的筛选及PCR鉴定将分隔良好的细胞集落用胰酶进行消化，用弯曲的平口注射器针头吸取消化的细胞集落，转入96孔板中，进行10倍稀释直至107稀释度，共吸取2板24个细胞集落，37℃，5％CO2培养直到长出单菌落，然后分别转入细胞培养瓶中进行大规模培养，提取DNA进行PCR鉴定。
转化pOPR1-5的CHO细胞株命名为CHO-OPR5-10，并选定CHO-OPR8为供筛选用细胞株，转化空载体的CHO细胞株命名为CHO-P。
CHO衍生工程细胞株CHO-OPR8 CGMCC №0613及CHO衍生工程细胞株CHO-PCGMCC №0612均为贴壁细胞，能稳定的贴附在玻璃器皿或微载体的表面，为固相筛选提供了可能。
本发明采用K-型正向筛选和μ-型反向排除相结合的方法，利用能够与K-型阿片受体作用而不能与μ-型阿片受体作用的化合物或多肽，如果是激动剂，应具有镇痛活性但不具有成瘾性的原理，达到筛选低成瘾性药物的目的。利用本发明的方法，特别是由于无血清及微载体培养，使之可以从肽库的大量不同氨基酸残基序列组合中高效地筛选出目的序列，可达到对文库进行106以上的筛选，极大地缩短了筛选周期，提高了筛选效率。
该筛选体系不仅适用于对各种多肽文库和组合化学库进行高通量筛选，获得高效低成瘾性的镇痛药物，而且还可以对已有的镇痛药物包括一些中药进行分析和评价。
图1为吗啡与CHO-OPR的竞争性结合曲线。
图2为CHO-OPR8与U69593，吗啡以及纳洛酮间的相互作用直方图。
图3为无血清微载体培养前后CHO-OPR8K-阿片受体活性比较。
具体实施例方式
实施例1、CHO-OPR8表达的k-型阿片受体对吗啡解离常数的测定采用竞争性结合的方法来测定CHO-OPR8表达的K-型阿片受体对吗啡的解离常数，实际上是表观解离常数(Ki)。通过比较吗啡对CHO-OPR8表达的K-型阿片受体的表观解离常数和U69593对CHO-OPR8表达的K-型阿片受体的解离常数，即可以判断CHO-OPR8对吗啡和U69593的相对特异性。固定3H-U69593的浓度为0.5nmol/L，加入不同浓度的未标记的吗啡和一定量的膜蛋白，以CHO的膜蛋白作为非特异性吸附，处理后进行液闪计数结果如表1所示，计算不同吗啡浓度时，3H-U69593结合的百分数，以吗啡浓度的负对数为横坐标，以3H-U69593结合的百分数为纵坐标作图，如图1所示。
表1液闪计数结果
从图1可以看出，IC50为4.91×10-7mol/L，根据公式Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)，可以算出Ki＝301.7nmol/L；而Kd＝1.49nmol/L；因此Ki/Kd＝301.7/1.49＝202.5＞200倍。该实验表明，CHO-OPR8表达的K-型阿片受体对吗啡的亲和力远远小于对U69593的亲和力，从而说明表达的K-型阿片受体对U69593具有很高的特异性(相对于吗啡)。
实施例2、CHO-OPR8对其他激动剂和拮抗剂的信号转导作用CHO-OPR8是通过对U69593与表达的K-型阿片受体结合后介导的信号强弱筛选出来的，而且通过受体饱和结合实验以及竞争性结合实验证明表达的K-型阿片受体不仅能介导细胞内的信号转导，而对U69593的结合具有很强亲和力和很好的特异性。下一步需要进一步证实CHO-OPR8表达的K-型阿片受体是否具有天然K-型阿片受体的其它活性。发明人通过其它的激动剂和拮抗剂对CHO-OPR8信号介导的性质及其强弱来观察表达的K-型阿片受体的其他相关性质。以U69593为阳性对照，以CHO-P为阴性对照，分别比较吗啡，纳洛酮对CHO-OPR8的信号介导作用以及它们三者中两两之间的相互作用。结果如表2所示。表2不同处理下OD450值
以OD450为纵坐标，以不同的样品为横坐标作图，结果如图2所示，从图2可以看出，CHO-P对U69593并不敏感，对吗啡及纳洛酮非常敏感；CHO-OPR8在单独给药的情况下，U69593能明显降低细胞内的cAMP浓度(OD450上升)，纳洛酮则能明显升高细胞内的cAMP浓度，吗啡对细胞内的cAMP浓度影响并不明显；在混合给药的情况下，U69593与纳洛酮同时给约，效果基本互相抵消，吗啡与纳洛酮同时给药，依然明显升高细胞内的cAMP浓度，而吗啡与U69593同时给药，没有看到明显的协同作用。该实验表明，CHO-OPR8不仅能与激动剂相互作用，介导细胞内的信号转导，而且能与相应的拮抗剂相互作用，产生对抗激动剂效果的作用。激动剂和拮抗剂是通过与同一个受体相互作用后产生的不同功效来区分。吗啡作为K-型阿片受体的非特异性激动剂，它介导的CHO-OPR8细胞内信号并不明显，这与吗啡和K-型阿片受体之间的亲和力较低是有明显关系的。
实施例3、用本发明的方法对多肽文库进行高通量筛选用本发明的方法对多肽文库进行高通量筛选包括以下步骤1、CHO-OPR8及CHO-P的无血清及微载体培养将培养的CHO-OPR8及CHO-P细胞每传代一次，降低一次血清，血清的浓度从10％依次降低到5.5％，5％，2.5％，最后降到0。每降低一次血清观察细胞生长的形态和生长的速度。将在无血清培养基中生长良好的细胞株在进行传代的时候加入大孔径明胶微载体至终浓度分别为0，2.5，5，10，20mg/mL，培养过程中观察细胞生长的形态，生长速度以及细胞的密度。
CHO-OPR8及CHO-P细胞经历4次传代和4次血清浓度逐步降低培养，细胞生长速率有所降低，但是细胞生长稳定，细胞的生长形态依然良好。在无血清培养基再培养传代两次后再加入不同浓度的微载体进行培养，经显微镜观察和计数，细胞的生长速率稳定，细胞的形态正常，细胞的密度与微载体浓度的不同有所弯化，结果如表3所示。
表3不同浓度微载体下的细胞密度
从表3可以看出，随着微载体浓度的升高，细胞密度也有所升高；但是当微载体的浓度超过5mg/mL时，细胞密度的增长率明显降低。
以正常培养基进行培养的CHO-OPR8作为对照，检测经过无血清微载体培养后的筛选平台细胞株表达K-型阿片受体活性的变化，经过细胞内cAMP浓度分析，以OD450为纵坐标，不同的样本为横坐标作图，结果如图3所示，从图3可以看出，在有血清无微载体培养条件下和无血清有微载体的条件下，CHO-OPR8都表现出了对K-型阿片受体配体反应的灵敏性，对激动剂(A)OD450升高，细胞内cAMP浓度下降，而对拮抗剂(AN)则相反，OD450下降，细胞内cAMP浓度升高，对配体反应的效果基本一致。CHO-P在无血清微载体的培养条件下，对K-型阿片受体配体依然没有明显的信号介导作用。
2、CHO-OPR8及CHO-P的规模培养及装入层析柱中将在无血清微截体培养基中生长良好的细胞株进行传代培养，温和离心收集细胞及微载体(300g，5min，室温)，收集的细胞用培养基进行悬浮后装入5ml玻璃层析柱中，置于37℃备用。
3、筛选平台对肽库的筛选将保存的5肽和15肽库进行室温融化，保温至37℃后首先上样到CHO-OPR8柱，自然流速使肽库样品流入层析柱后迅速加入培养基进行洗涤，洗涤3个柱体积(约10ml)，加入带有K-型阿片受体特异性配体的洗脱液A(洗脱液A的配方为HYCLONE公司CHO无血清培养基加入U69593至终浓度0.5nmol/L)进行洗脱，收集洗脱下来的噬菌体上样到CHO-P柱中，收集穿过液即是第一轮筛选的候选多肽；将第一轮筛选到的候选多肽重新上样到CHO-OPR8柱中，进行第二轮筛选；共进行三轮筛选，在第三轮筛选过程中，对CHO-OPR8柱使用非特异性的高盐洗脱液B(洗脱液B的配方为HYCLONE公司CHO无血清培养基加入0.5mol/L NaCl)进行洗涤，而对CHO-P柱则依然用普通培养基进行洗涤，将每轮筛选的产物取样转染受体菌，进行单克隆计数，估计筛选的候选多肽的数量以及筛选效率。结果如表4所示。
表4候选多肽的数量
从表4可以看出，筛选平台经过三轮筛选，从1014文库中筛选到了76个噬菌体单克隆，筛选效率达到1012以上，达到了高通量筛选的条件。其中第一轮的筛选效率最高，达到了约108，第二轮和第三轮的效率相对较低，只有100倍左右。
4、候选噬菌体的转染及计数将筛选的噬菌体取样转染K91Kan(supE hsdR galmetB NK1105 from Dr.Zhao)，转入LB四环素平板中进行培养计数。
5、目的克隆质粒的提取及序列分析将最后一轮筛选的目的噬菌体全部转染K91Kan，从筛选到的76个噬菌体单克隆中，随机挑取20个进行接种培养，提取质粒进行序列分析，通过序列分析我们发现在20个测序样品中，一共只有13种不同的序列，根据序列分析的结果对比空载体的序列，推导出13种多肽的氨基酸序列，并统计不同序列的相应的频率，结果如表5所示。
表513种多肽的氨基酸序列
6、筛选多肽的序列推断及其比较将复制型噬菌体质粒的序列分析结果与空载体进行比较，寻找插入片段的核苷酸序列，然后推导氨基酸序列，将序列进行一级结构的比较和二级结构分析，确定具体的候选多肽进行合成分析。从表5可以明显看出，YAGFM出现频率最高，为5/20＝25％，进一步分析发现，其他5肽如B，G，H，J，K和M也具有和A类似的结构。共计有11/20＝55％之多。因此可以推断，YGGFL及其类似结构的化合物必然与CHO-OPR8有着较强的相互作用，而与CHO-P没有特异性的相互作用，由于CHO-OPR8和CHO-P之间理论上只有表达K-型阿片受体的差异，因此可以进一步推断该类化合物与K-型阿片受体有着较强的相互作用。在选择候选合成多肽时，该类化合物应该是首选。
选择15肽文库进行筛选，其中有一个很重要的考虑就是看能否筛选到K-型阿片受体的内源性配体，即强啡肽，强啡肽也正好是15肽。我们筛选到了与强啡肽非常类似的15肽，包括B，H和M。如果比较其N末端的序列，我们发现与之相似的结构就更多，包括A，G，J和K。从这个角度上考虑，虽然没有筛选到与强啡肽完全一致的多肽序列，但是我们筛选的大部分多肽都与强啡肽有着类似的结构，因此该筛选平台不但有着极高的的筛选效率而且有着很好的筛选效果。
实施例4、热辐射法(甩尾法)测定本发明筛选出的5肽的镇痛作用热辐射法测定小鼠对疼痛的敏感程度的方法是，将光辐射热测痛仪热板置于桌面上，将小鼠置于小鼠固定桶中，尾部暴露于桶外，实验前先用75％的乙醇擦净鼠尾，用记号笔在鼠尾的下1/3处作出标记，作为光辐射刺激点，测定各小鼠的正常痛反应(甩尾)时间，共测两次，每次间隔5分钟。
挑选8只具有正常痛反应的小鼠，分成4组，每组2只。第一组腹腔注射生理盐水约0.3ml(15ul/g)；第二组注射吗啡约0.3mg(15ug/g)；第三组注射U69593约0.3mg(15ug/g)；第四组注射0.3mg(15ug/g)的本发明上述实施例中筛选出的5肽。给药后15，30，45，60分钟后分别测定痛反应时间，从测试结果可以得出，生理盐水没有镇痛活性，吗啡、U69593以及化学合成的短肽具有明显的镇痛活性。其中，吗啡的镇痛活性最强，在给药后30分钟后就达到很好的镇痛效果，随着时间的延长，镇痛活性虽然有所上升，但上升的速度明显放慢；U69593与5肽随着时间的延长，镇痛活性稳步升高。从实验结果还可以得出吗啡产生明显效果的时间很短，为30分钟左右，而U69593以及5肽达到同样的效果则需要一个小时甚至一个小时以上的时间。实验证明，化学合成的5肽化合物具有明显的镇痛活性，其镇痛效果的时间反应特性与U69593有着很好的相似性，与吗啡则有着较大的区别。5肽镇痛活性的时间反应特性可能与在体内的作用机理有关，可以推测，其与吗啡在体内的作用机理应有很大的差别，虽然5肽的镇痛效果不及吗啡，但是由于其低成瘾性，因此具有广泛的应用前景。
权利要求
1.一种低成瘾性镇痛药物的高通量筛选方法，基本上包括以下步骤1)将规模培养的CHO衍生工程细胞株CHO-OPR8 CGMCC №0613及CHO衍生工程细胞株CHO-P CGMCC №0612分别装入层析柱中，得到CHO-OPR8层析柱及CHO-P层析柱；2)将待选择的肽库上样到CHO-OPR8层析柱，洗涤层析柱后采用洗脱液洗脱与CHO-OPR8特异结合的样品，将收集的洗脱液上样到CHO-P层析柱，收集穿过峰，得到第一轮筛选出的候选多肽；3)将第一轮筛选出的候选多肽再上样到CHO-OPR8层析柱，将收集的洗脱液上样到CHO-P层析柱，收集穿过峰，得到第二轮筛选出的候选多肽；4)将第二轮筛选出的候选多肽再上样到CHO-OPR8层析柱，将收集的洗脱液上样到CHO-P层析柱，收集穿过峰，得到第三轮筛选出的候选多肽；5)将最后一轮筛选的噬菌体全部转染K91Kan，挑选阳性菌株进行接种培养，提取质粒，进行序列分析；6)将复制型噬菌体质粒的序列分析结果与空载体进行比较，寻找插入片段的核苷酸序列，推导出氨基酸序列，得到目的多肽。
2.根据权利要求1所述的一种低成瘾性镇痛药物的高通量筛选方法，其特征在于装入层析柱中的CHO衍生工程细胞株CHO-OPR8及CHO衍生工程细胞株CHO-P均为无血清微载体培养的细胞。
3.根据权利要求2所述的一种低成瘾性镇痛药物的高通量筛选方法，其特征在于所述微载体培养是在培养基中加入了2-20mg/ml的大孔径明胶微载体，其中优选的是加入5mg/ml。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种低成瘾性镇痛药物的高通量筛选方法，其特征在于所述第2)步中，当肽库样品流入CHO-OPR8层析柱后，迅速加入培养基进行洗涤，洗涤3个柱体积，再用加入K-型阿片受特异性配体的洗脱液进行洗涤，该洗脱液的配方为HYCLONE公司CHO无血清培养基加入U69593至终浓度0.5nmol/L。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种低成瘾性镇痛药物的高通量筛选方法，其特征在于所述第4)步中，当肽库样品流入CHO-OPR8层析柱后，迅速加入培养基进行洗涤，洗涤3个柱体积，再用高盐洗脱液进行洗涤，该洗脱液的配方为HYCLONE公司CHO无血清培养基加入高浓度的盐，其中优选加入0.5mol/L NaCl。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种低成瘾性镇痛药物的高通量筛选方法，其特征在于所述第6)步中，推导出氨基酸序列后，将序列进行一级结构的比较和二级结构的分析，得到目的多肽。
7.CHO衍生工程细胞株CHO-OPR8 CGMCC №0613。
8.CHO衍生工程细胞株CHO-P CGMCC №0612。
全文摘要
本发明的名称为低成瘾性镇痛药物高通量筛选平台，涉及生物学筛选模型。本发明一种低成瘾性镇痛药物的高通量筛选方法，基本上包括以下步骤1)将规模培养的CHO－OPR8及CHO－P分别装入层析柱中，得到CHO－OPR8层析柱及CHO－P层析柱；2)将待选择的肽库上样到CHO－OPR8层析柱，洗涤层析柱，将收集的洗脱液上样到CHO－P层析柱，收集穿过峰，得到第一轮筛选出的候选多肽；3)第二轮洗涤4)第三轮洗涤5)将最后一轮筛选的噬菌体全部转染K91Kan，挑选阳性菌株进行接种培养，提取质粒，进行序列分析；6)将复制型噬菌体质粒的序列分析结果与空载体进行比较，寻找插入片段的核苷酸序列，推导出氨基酸序列，得到目的多肽。
文档编号C12Q1/04GK1407112SQ01120369
公开日2003年4月2日 申请日期2001年8月23日 优先权日2001年8月23日
发明者段海清, 张兆山 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所