专利名称：修正的人α抗胰蛋白酶基因在羊乳腺中表达的方法
技术领域：
本发明涉及修正的人α抗胰蛋白酶基因在羊乳腺中表达的方法。
利用微注射方法将外源基因导入小鼠基因组并生产转基因小鼠的技术非常成熟。早在1982年，Palmiter等人就把大鼠生长激素基因(rGH)导入了小鼠基因组并获得了世界上第一只转基因“超级鼠”。1985年以后，转基因兔、转基因猪、转基因羊、转基因鱼和转基因鸡等相继问世。1987年，Simons等人在转基因小鼠乳房中首先成功地表达了羊乳球蛋白基因，小鼠奶中羊乳球蛋白的含量达23克/升，为动物细胞培养技术表达水平的400倍以上。此后，牛乳白蛋白基因(Vilotte等，1989)、人组织血纤维蛋白溶酶原激活因子基因(Gordon等，1987)、人生长激素基因(Brem等，1991；Reddy等，1991)、人体抗胰蛋白酶基因(Archibald，1990)、人尿激酶基因(Meade等，1990)和人干扰素基因(Stinnake等，1991)等，都已在转基因小鼠乳房中得到表达，表达的蛋白具有正常的生物活性。转有人抗胰蛋白酶基因、人凝血因子IX基因和人组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)基因的转基因羊(Clark等，1989；Wright等，1991；Elbert等，991；Carver等，1994)，整合有人红细胞刺激生成因子(EP0)基因的转基因牛(Hyttnen等，1994)也相继产生。
人抗胰蛋白酶可以防止肺细胞纤维化，及时清除障碍肺细胞行使氧交换的物质，是一种治疗肺泡纤维化病(肺气肿)的高效药用蛋白，对呼吸窘迫综合症(即呼吸困难引起的一系列病变)和遗传性肺纤维囊肿有特效，被称为肺脏的清道夫。在我国，吸烟人数及比例均居国际首位，世界上80％的老年性呼吸窘迫症患者在我国，对蛋白酶抑制因子的需求十分巨大。1991年，Wright等人首先在羊的乳房中成功地表达了人抗胰蛋白酶基因(ATT)。
修正的人α抗胰蛋白酶基因(mAAT)是在人抗胰蛋白酶基因的基础上，实施了一些部位的点突变，其核苷酸序列见SEQ ID NO1(其中包含内含子2、3和4)。修正的人α抗胰蛋白酶基因更有利于表达。
本发明的实施方案如下1、生产人抗胰蛋白酶因子的方法，包括以下步骤1)选择具有正常繁殖机能的母羊作为供体，对其进行处理，使之超数排卵；2)获取原核期胚胎；3)向原核期胚胎显微注射修正的人α抗胰蛋白酶基因，鲜胚移植；4)获得转基因羊；5)自上述转基因羊的奶液中提取人抗胰蛋白酶因子。
所述母羊供体可以是山羊，也可以是绵羊。
用促卵泡素加促黄体素的方法使所述供体羊超数排卵。
所述超数排卵选择在一年中的3月或5月份进行比较适宜。
超数排卵后，用自然或人工的方法使卵受精，进而获取原核期胚胎。
向原核期胚胎显微注射的修正的人α抗胰蛋白酶基因，需要与载体结合，其转基因载体的构建步骤为将羊β酪蛋白基因的5’调控区连接于mAAT结构基因的5’端，然后接入β酪蛋白的3’调控区，再连接到T载体上，用Not I内切酶酶切重组质粒，回收14kb的外源片段，得到转基因载体。
所述注射了修正的人α抗胰蛋白酶基因的鲜胚移植给所述供体或自然发情的受体。
判定已经成功地转入了修正的人α抗胰蛋白酶基因的所述转基因羊的方法是，提取所生羔羊的总DNA，用PCR-Southern方法检测转入外源基因编码区N-末端和3’调控区部分序列是否为阳性。
本发明利用显微注射法向羊的原核期胚胎中导入修正的人α抗胰蛋白酶基因，制备转基因羊，利用羊的乳腺大规模、低成本地生产人α抗胰蛋白酶因子，羊奶中人α抗胰蛋白酶因子的含量高达30克/升。为大规模生产以α抗胰蛋白酶因子为活性成分的治疗肺部疾病的药物提供了可靠的保障，进而丰富我国的医药用品市场。
超数排卵及移植胚胎的数量均是能否成功地得到转基因羊的关键。本发明的研究结果表明，超数排卵及移植胚胎的数量与操作进行的时间有密切的关系。表1所示的结果表明，每年3月和5月两个月份，超排卵处理的效果明显好于12月份，且以5月份时超排效果最好，可用胚胎数最多。3、5、12月份分别可获得平均排卵19.50、21.70和16.06枚，受精卵数分别为4.31、6.48和3.57枚。方差分析表明，3月与5月份采用FSH+LH结合法对山羊进行超排，超排效果间没有明显的差异(P＜0.05)，12月份最低，差异极其显著(P＜0.01)。分析其原因，主要是由于此时天气较凉，造成了回收率低、可用胚胎数量较少。
表1 山羊的超数排卵效果月份只数排卵点数回收卵数 未受精卵 回收率 移植胚胎数(平均) 数 (％)12月 17273(16.06) 177 65 64.84 3.57(75/21)3月 26507(19.50) 399 22478.70 4.31(125/29)5月 13282(21.70) 212 61 75.00 6.48(136/21)显微注射后胚胎移植给供体或自然发情的受体，移植受胎率分别为18.18％和25.00％。表明以自然发情的母羊为胚胎的受体，受胎率较高。
下面结合附图对本发明的实施例做进一步说明。
2、试验药品促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)由宁波水产所生产；前列腺素(PG)由南京水产所生产；羊用阴道栓(CIDR)是新西兰Pharmacia& Upjohn的产品；Taq酶、Not I和BamH I内切酶是美国Biolab公司的产品；T载体是中国华美公司的产品。
3、动物超数排卵的处理供体母羊埋植阴道栓8-14天，然后每天早、晚8点分别肌肉注射FSH 50IU，连续注射3天。在FSH注射第3针时肌肉注射PG 1ml，第6次注射FSH时取出阴道栓，次日发情鉴定和配种，并肌注LH 300IU。每只超数排卵发情的母羊至少用2只公羊配种3-4次。用解扎公羊试情寻找自然发情母羊。
4、转基因载体的构建用常规方法将山羊β酪蛋白基因的5’调控区连接于mAAT结构基因的5’端，然后接入β酪蛋白的3’调控区，形成完整的转基因结构，再连接到T载体上，常规方法进行扩增、提取和纯化。所构建的表达载体如
图1所示，其中β酪蛋白基因5’调控区为7987bp、mAAT结构基因(含内含子)为4805bp、β酪蛋白基因3’调控区为1526bp；β酪蛋白基因5’调控区的5’端有Not I和Not I/BamH I酶切位点，mAAT结构基因中有BamH I酶切位点，β酪蛋白基因3’调控区的3’端有BamH I酶切位点。对所获得的转基因载体的核苷酸序列进行序列测定，验证序列准确无误。
5、注射用DNA溶液的准备用Not I内切酶酶切重组质粒，回收14kb的外源片段，溶解于转基因专用的TE缓冲液(Promaga Catalog，2001年)中，调整DNA浓度为2g/ml，使每ml溶液中DNA的分子数为4.8×1011。
6、显微注射与移植采用手术冲卵法在末次配种后24-28小时内冲取胚胎，对受精的胚胎雄原核进行显微注射，每个原核注射外源基因的量为1-2pl。然后将使得鲜胚迅速采用手术法移植给供体或自然发情的受体，保证每个受体至少移植两枚质量较好的胚胎。胚胎在受体中孕育，足月自然分娩得到羔羊。
7、自所得到的羔羊中筛选出转基因阳性的个体。
8、用常规的方法自上述转基因羊的奶液中提取人抗胰蛋白酶因子。
实施例2、转基因个体的鉴定1、PCR自所生羔羊的耳部采集组织块，-80℃冰箱保存，提取基因组DNA后用5’端(引物I)和3’端(引物II)两对引物分别进行PCR扩增，检测阳性个体，引物的序列如下引物I 正向5‘-ATTGGACAGAAGGAGGAGACTGG-3’反向5‘-TGGCATACAGCAGGTGATGGAC-3’引物II正向5‘-TTGTGGAGAGTGAAAGGCTGTC-3’反向5‘-CTCCGTCTCTACCAGGAATGGC-3’5’末端扩增片段长度为313bp(引物I)；3’调控区扩增片段长度为289bp(引物II)。
PCR扩增条件94℃ 5min-94℃30sec-60℃30sec-72℃30sec(30cycles)-72℃5min；扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测结果如图2所示。图中，各个符号的意义是，M分子量标准；C空白对照；H人的基因组对照；P含有人mAAT基因质粒的阳性对照；3、15、90、06为转基因阳性羔羊个体的编号；6、47为转基因阴性羔羊个体的编号；箭头所指为目的片段。
2、PCR-Southern检测为了保证所扩增片段的可靠性，对所生羔羊个体又进行了PCR-Southern检测。按照试剂盒要求采用上述两对引物对杂交探针进行DIG标记，测定标记效率。对PCR产物转膜后进行Southern杂交。结果如图3所示。图中，各个符号的意义是，阿拉伯数字为羔羊个体的编号，其中3、15、90、06为PCR检测阳性个体，6、47为转基因阴性个体；H人的基因组DNA；P含有外源片段的质粒克隆；M质粒PBR322酶切分子量标准；箭头所指为目的片段。
3、Southern检测通过分光光度计测定杂交所用基因组DNA的含量，并定量到8g/样品，然后利用BamH I内切酶进行消化，转入的外源片段应为3.1kb，再经过转膜、杂交、显色等过程，将引物I进行DIG标记成为探针，并利用该探针进行杂交处理。结果如图4所示。图中，各个符号的意义是，M分子量标准；P含有外源片段的质粒；H人的基因组DNA；阿拉伯数字所生羔羊个体的编号，其中06、90、15、3为阳性个体，6、47、8为阴性个体；箭头所指为目的片段。
序列表(1)一般信息(I)申请人中国农业大学北京兴绿原三高科技有限责任公司(II)发明名称修正的人α抗胰蛋白酶基因在羊乳腺中表达的方法(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度6237碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GGATCCCCAG GGAGATGCTG CCCAGAAGAC AGATACATCC CACCATGATC AGGATCACCC61 AACCTTCAAC AAGATCACCC CCAACCTGGC TGAGTTCGCC TTCAGCCTAT ACCGCCAGCT121 GGCACACCAG TCCAACAGCA CCAATATCTT CTTCTCCCCA GTGAGCATCG CTACAGCCTT181 TGCAATGCTC TCCCTGGGGA CCAAGGCTGA CACTCACGAT GAAATCCTGG AGGGCCTGAA241 TTTCAACCTC ACGGAGATTC CGGAGGCTCA GATCCATGAA GGCTTCCAGG AACTCCTCCG301 TACCCTCAAC CAGCCAGACA GCCAGCTCCA GCTGACCACC GGCAATGGCC TGTTCCTCAG361 CGAGGGCCTG AAGCTAGTGG ATAAGTTTTT GGAGGATGTT AAAAAGTTGT ACCACTCAGA421 AGCCTTCACT GTCAACTTCG GGGACACCGA AGAGGCCAAG AAACAGATCA ACGATTACGT481 GGAGAAGGGT ACTCAAGGGA AAATTGTGGA TTTGGTCAAG GAGCTTGACA GAGACACAGT541 TTTTGCTCTG GTGAATTACA TCTTCTTTAA AGGTAAGGTT GCTCAACCAG CCTGAGCTGT601 TTCCCATAGA AACAAGCAAA AATATTTCTC AAACCATCAG TTCTTGAACT CTCCTTGGCA661 ATGCATTATG GGCCATAGCA ATGCTTTTCA GCGTGGATTC TTCAGTTTTC TACACACAAA721 CACTAAAATG 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权利要求
1.生产人抗胰蛋白酶因子的方法，包括以下步骤1)选择具有正常繁殖机能的母羊作为供体，对其进行处理，使之超数排卵；2)获取原核期胚胎；3)向原核期胚胎显微注射修正的人α抗胰蛋白酶基因，鲜胚移植；4)获得转基因羊；5)自上述转基因羊的奶液中提取人抗胰蛋白酶因子。
2.根据权利要求1所述的生产人抗胰蛋白酶因子的方法，其特征在于所述母羊供体为山羊。
3.根据权利要求1所述的生产人抗胰蛋白酶因子的方法，其特征在于所述母羊供体为绵羊。
4.根据权利要求1所述的生产人抗胰蛋白酶因子的方法，其特征在于用促卵泡素加促黄体素的方法使所述供体羊超数排卵。
5.根据权利要求1所述的生产人抗胰蛋白酶因子的方法，其特征在于所述超数排卵后，用自然或人工的方法使卵受精，进而获取原核期胚胎。
6.根据权利要求1所述的生产人抗胰蛋白酶因子的方法，其特征在于向原核期胚胎显微注射的修正的人α抗胰蛋白酶基因，其转基因载体的构建步骤为将羊β酪蛋白基因的5’调控区连接于mAAT结构基因的5’端，然后接入β酪蛋白的3’调控区，再连接到T载体上，用Not I内切酶酶切重组质粒，回收14kb的外源片段，得到转基因载体。
7.根据权利要求1所述的生产人抗胰蛋白酶因子的方法，其特征在于所述注射了修正的人α抗胰蛋白酶基因的鲜胚移植给所述供体或自然发情的受体。
8.根据权利要求1所述的生产人抗胰蛋白酶因子的方法，其特征在于判定所述转基因羊的方法是，提取所生羔羊的总DNA，用PCR-Southern方法检测转入外源基因编码区N-末端和3’调控区部分序列是否为阳性。
全文摘要
本发明公开了一种生产人抗胰蛋白酶因子的方法，包括以下步骤1)选择具有正常繁殖机能的母羊作为供体，对其进行处理，使之超数排卵；2)获取原核期胚胎；3)向原核期胚胎显微注射修正的人α抗胰蛋白酶基因，鲜胚移植；4)获得转基因羊；5)自上述转基因动物的奶液中提取人抗胰蛋白酶因子。用本发明的方法，可以利用羊的乳腺大规模、低成本地生产人α抗胰蛋白酶因子，丰富医药用品市场。
文档编号C12N9/00GK1397643SQ0112032
公开日2003年2月19日 申请日期2001年7月20日 优先权日2001年7月20日
发明者李宁, 连正兴, 桑振宇, 韩斌 申请人:中国农业大学, 北京兴绿原三高科技有限责任公司