遗传性癫痫伴热性惊厥附加症scn1a基因新突变的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明设及疾病相关突变基因领域，特别是遗传疾病基因突变，遗传性癒痛伴热性惊厥附加症相关基因突变。【
背景技术：
】[0002]热性惊厥（FebrileSeizure,F巧是人类最常见的惊厥事件，发生于3个月至六岁间，由于急性发热（排除中枢神经系统感染或损伤）而诱发的惊厥发作。它具有明确的遗传易感性，家族性发病常见，热性惊厥患者同胞的患病率较普通人群高19.9%-24.9%。良性FS本身不属于癒痛范畴，但复杂性或频繁发作的FS日后出现癒痛发作的概率明显高于普通人群。目前普遍认为，热性惊厥相关性癒痛发作是一种与遗传密切相关的癒痛综合征。[0003]癒痛是神经系统第二大类疾病，为最常见的慢性疾病之一，患病率为4~7%。，其中约50%的癒痛与遗传有关。到目前为止，已明确的单基因遗传性癒痛7种，可由10种单基因病变导致，其中有9种为离子通道基因；多基因遗传性癒痛3种，设及6种基因；另外已明确的癒痛易患基因有70多种，绝大部分表达的是离子通道或离子通道调节因子。而临床上尚有更多患者的癒痛易患基因有待确定。[0004]全面性癒痛伴热性惊厥附加症（GeneralizedElpil巧sywithFebrileSeizuresPlus,GEFS+)，目前已更名为遗传性癒痛伴热性惊厥附加症（Genetic化il巧sywithFebrileSeizuresPlus,GEFS+)是Scheffer等人于1997年在一个热性惊厥大家系研究中首先总结的一种临床表型多样并具有显著遗传异质性特点的癒痛综合征，其发作表型谱包括热性惊厥（FebrileSeizure,FS)、热性惊厥附加症（FebrileSeizureplus,FS+)、FS+伴有其他发作形式（如FS+伴有失神、肌阵李或者失张力性等全面发作形式）和肌阵李巧倒发作性癒痛（myoclonic-astaticepilepsy,MAE)。进一步的基础研究发现GEFS+是呈常染色体显性方式遗传的一种儿童良性发作性癒痛综合征，并具有显著遗传异质性特点。随后，通过众多的GEFS+家系的分析和报道，癒痛学者们不断完善其发作谱。现多认为，它还包括FS+伴部分性发作、FS+相关性颠叶癒痛、顽固性儿童强直阵李性癒痛（intractablechildhoodepilepsywithgeneralizedtonic-clonicseizures，ICEGTC)、婴儿严重肌阵李癒痛（SevereMyoclonicElpilepsyofInfan巧，SMEI/DravetSyn化ome)。从自限性的热性惊厥到难治性癒痛脑病SMEI，GEFS+综合征的病例在治疗及预后方面因临床表型的差异而大相径庭。现在认为，热性惊厥相关性癒痛是一个大范畴癒痛综合征的概念。目前，FS+相关部分性发作比率占GEFS+表型中的10%左右，其中的部分性癒痛越来越引起众多学者的重视和关注，FS+伴部分性发作在国际上已有一定报道。[0005]癒痛学者及分子生物学家试图从遗传学和分子生物学角度来解释自限性和非自限性热性惊厥及其后癒痛发作的在临床表现、治疗和预后方面的巨大差异。在近十年的研究中，学者们依次发现GEFS+的致病基因有：电压口控性钢通道01亚基的编码基因(voltage-gated3〇(1;[11111(化+)-油3]1]161|31subunitgene,SCN1B);电压口控性钢通道曰1亚基的编码基因（voltage-gated3〇(1;[11111(化+)-油3]1]161a1subunitgene,SCN1A);丫-氨基了酸A型受体丫2亚基编码基因（gamma-aminobutyricacid(GABA)Arec巧torsubunitgamma2，GABRG2);电压口控性钢通道a2亚基的编码基因（voltage-gated3〇(1;[11111(化+)-油3]1]161(323址)11]1；[1gene,SCN2A),分别称之为GEFS+I型、GEFS+II型、GEFS+III型和GEFS+IV型。临床和遗传学研究发现，GEFS+的不同临床表型可W由同一个致病基因造成，具有表型异质性，相同的表型也可W由不同的致病基因造成，具有遗传异质性。[0006]电压口控性钢通道的分子结构是一种跨膜糖蛋白，当细胞膜去极化时，它选择性地对钢离子通透，而在静息状态下通常关闭。在中枢神经系统中对动作电位的起始和传播起着非常重要的作用，同时又是众多抗癒痛药物作用的关键祀点。钢通道通常由一个曰型大亚基（260邸）和一个或多个0型小亚基（32~37邸）组成。a亚基是钢通道的功能性单位，由四个高度同源性的结构域（I~IV)通过胞内连接环（loop)相连而成。每个结构域含有6个跨膜片段（S1~S6)，其中S5和S6片段之间的连接环构成通道孔壁，其决定着通道离子选择性。S4片段富含正电荷残基，可充当通道的电压感受器（voltagesensor),当膜电位去极化时可使S4片段跨膜移动，激活通道，而当结构域上m和IV之间的胞内连接环堵塞通道内口时，便导致通道关闭，被称为"失活闽口"。现已明确，编码a亚基的SCN1A和SCN2A基因都定位于2q24~q33,它们的基因产物均在中枢神经系统高度表达，SCN1A主要在大脑皮质和海马，SCN2A在神经元轴突处，该些部位均为癒痛发生的重要区域。SCN1A、SCN2A的突变可使钢通道失活延缓，从而在静息状态下产生持续性的钢内流，使膜电位慢性去极化，细胞兴奋性增高。不同基因位点的突变不仅产生多样的临床表型，而且影响了某些作用于该基因或某位点的抗癒痛药物的药理作用。SCN1B是最先发现在GEFS+家系中存在突变的致病基因，该基因目前与热性惊厥相关的突变共发现四个位点：C121W，I70_E74del，R85C和R8甜。SCN1A是目前在热性相关性癒痛中发现突变位点最多的基因，至今国际上已报道超过900多个位点，是与热性相关性癒痛关系最密切的致病基因，而且也最不稳定，容易发生突变。目前关于SCN1A基因与热性惊厥相关性癒痛发作研究较多，从FS+、GEFS+、到SME，临床表型即从预后良好的癒痛综合征到严重癒痛性脑病，都与SCN1A基因密切相关。在GABRG2基因上，癒痛学者们陆续发现了六个位点与热性惊厥相关性儿童失神癒痛密切相关；1(2891、1?4：39、9351《、1￥56+21〉6、1?1396和1￥58+11601'。在5〔肥八上，目前只有S个突变位点发现于热性惊厥相关性癒痛的患者：R19K，R188W和R524Q。不同基因位点的突变不仅产生多样的临床表型，而且影响了某些作用于该基因或某位点的抗癒痛药物的药理作用。卡马西平，苯妥英钢W及拉莫=嗦都是电压依赖性钢通道特异阻滞剂。它们在钢通道开放失活状态下缓慢的结合在a2亚基的孔区内壁数个氨基酸残基上，具有频率依赖性，即对病理状态下高频放电起抑制作用。[0007]总之，热性惊厥相关性癒痛发作多样的临床表型、显著的遗传异质性和复杂的药物反应已成为癒痛专科医师、癒痛遗传学者W及遗传药理学者们共同关注及研究的热点。探索热性惊厥相关性癒痛发作的各种临床表型与某种基因型及其药物反应性之间的关系，从而为遗传性癒痛的分子诊断奠定基础，为指导临床诊断及开展特异治疗提供理论基础。[0008]全外显子测序技术已被证明为降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段，仅通过对几个很少的个体的全外显子进行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。[0009]确定新的SCNIA基因的致病突变，对开展遗传性癒痛伴热性惊厥附加症的分子诊断具有重要意义。【
发明内容】[0010]本发明采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族常染色体显性遗传的G邸S+家系进行了全部外显子区域的高通量测序，结合生物信息分析发现SCN1A基因上的C.4442T〉C/p.Vall481Ala突变与GEFS+有关，并通过共分离实验等方法验证了该一变异，该一结果将会为G邸S+发病机制的研究奠定重要基础，也有可能为G邸S+患者治疗提供全新的理论依据，为开发有效的早期致病基因筛查和干预治疗措施提供科学依据。[0011]因此，本发明设及GEFS+病基因的突变，具体为；SCN1A基因上的C.4442TXVр.Vall481Ala〇[0012]在第一方面，本发明设及GEFS+病的生物标记物，即SCNIA的突变，所述生物标记物是具有如下的突变SCN1A基因或蛋白；C.4442TXVP.Vall481Ala。[0013]在一个实施方案中，本发明的突变SCNIA基因为具有W下突变的SEQIDNO:1;с.4442T>C〇[0014]在一个实施方案中，本发明的突变SCNIA蛋白为具有W下突变的SEQIDN0:2;р.Vall481Ala〇[0015]在一个实施方案中，本发明还设及包含突变SCNIA基因的构建体或重组细胞，所述突变是；c.4442T〉C，例如所述突变SCN1A基因为具有W下突变的SEQIDN0:1;с.4442T>C〇[0016]在第二方面，本发明设及一种检测G邸S+病的方法，所述方法包括检测受试者的SCN1A基因中是否存在突变位点，当前第1页1 2