一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，包括测序引物，所述测序引物包括如下序列：SEQ ID NO:1-36。本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒的具有检测位点多、覆盖范围广、阳性检出率高、临床使用价值高、灵敏度高、准确性高、检测特异性高、重复性高和检测稳定性好的优点；可以用于婚前筛查、产前诊断、孕期胎儿及耳聋人群的遗传性耳聋基因位点筛查检测，可极大地避免聋儿的出生及迟发性耳聋的发生，减轻社会家庭的经济负担，实现优生优育。
【专利说明】一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因测序技术，特别涉及一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 耳聋是世界范围内最常见的感觉障碍性疾病之一，遗传性耳聋可以分为非综合征 性耳聋和综合征性耳聋。据第二次全国残疾人抽样调查显示，我国听力残疾人数约2004万 人，占残疾人总数的24. 16%;耳聋导致的言语残疾约127万人，占残疾人总数的1. 53%。先 天性耳聋在新生儿中的发病率约为1/1000,其中一半以上的先天性耳聋与遗传基因有关。
[0003] 在非综合征性耳聋中，GJB2、SLC26A4和线粒体DNA是我国最常见的致病基因。 GJB2基因编码连接蛋白（connexin 26)，参与细胞间信号介导和离子传递，突变的GJB2 基因可能导致连接蛋白异常，进而影响细胞间隙的连接功能，引起内耳钾离子回收障碍而 致耳聋。GJB2基因突变与非综合征性遗传性耳聋密切相关，包括常染色体显性遗传性聋 DFNA3和常染色体隐性遗传性聋DFNBl。在中国人群中，26 %?33 %的语前聋患儿为GJB2 基因突变所致，占常染色体隐性遗传性耳聋的28 %，其突变的主要方式为c. 235delC，检 出率约为13. 6%?21. 5%。GJB2基因突变还可导致非综合性常染色体显性遗传性耳聋。 SLC26A4基因突变与大前庭水管综合征/Mondin畸形和Pendred综合征（前庭水管扩大 或伴Mondini畸形、神经性聋和甲状腺肿）有着密切关系。SLC26A4基因编码Pendred蛋 白。Pendred蛋白主要由疏水性氨基酸组成，其功能主要参与碘/氯离子的转运。在内耳 中,Pendred蛋白表达于内淋巴管和内淋巴囊上皮细胞及椭圆囊和球囊边缘的神经细胞中。 Pendred蛋白发生异常即可影响细胞内外阴离子的转运，从而影响声音传递而导致听力损 失。在中国大陆，大前庭水管患者SLC26A4基因突变检出率为97. 9%，高于韩国（78% )、日 本（92% )和欧洲（40% )。
[0004] 目前，临床上用于耳聋基因进行检测的试剂盒所用技术方法有PCR-RFLP法、微阵 列芯片法、ARMS-PCR法、荧光定量PCR法，凝胶电泳法，荧光熔解曲线法，荧光毛细管电泳 法。现我国临床上主要用的是微阵列芯片法和荧光定量PCR法，它们的主要技术缺陷如下：
[0005] 微阵列芯片法检测需经过全血DNA提取（30min)、PCR扩增（2h以上）、产物杂交 分析（3h以上）等步骤，检测时间长以上），操作繁琐，不能满足临床对致聋基因大量 筛查的需求；由于操作流程过多，容易造成样本交叉污染；其次，对单个碱基的辨识率比较 低，易出现假阴性和假阳性，使结果的准确率受到影响；此外，微阵列芯片成本过高，需要专 门的芯片扫描仪器，检测成本高；普通ARMS-PCR产品的扩增效率仅为正常扩增的1-10%， 因此扩增体系缺乏稳定性；四引物ARMS-PCR的一个反应只能检一个突变位点。普通PCR产 品共有的缺点为：在结果判读时需要通过条带大小判断基因型，缺乏直观性。凝胶电泳检 测结果容易造成PCR交叉污染、检测灵敏度低且耗时长；利用Taqman探针进行SNP突变检 测，每检测一个位点需要2条探针，且对探针特异性有较高要求。探针合成成本较高，对荧 光PCR仪的通道数有要求，不利于推广；荧光熔解曲线法检测一管检测位点少，且受荧光染 料通道限制无法满足耳聋多基因多位点的检测；PCR-RFLP法检测技术操作繁琐，需要经过 酶切反应，反应时间长，同时需要凝胶电泳检测容易出现样本交叉污染。酶切位点易受基因 变异影响；多重PCR引物体系较复杂，较难设计，多对引物之间会形成相互干扰，竞争性抑 制。因此检测位点越多，所需引物越多，PCR体系优化难度越高，同时受毛细管电泳仪荧光 通道的限制，产品推广较难，一般检测位点最多不超过20个；
[0006] 现有产品共有的缺点是检测位点少，只能检测遗传性耳聋基因热点突变，无法检 测众多的稀有位点，然而耳聋致病基因多，突变位点多，以上方法均无法满足临床上快速， 简便，检测范围广的要求。在临床应用时存在漏检的可能，无法对患者的病因作出进一步的 解释，降低了临床使用的价值。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测范围广、速度快、灵敏度高的遗传性 耳聋基因突变检测试剂盒。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0009] -种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，包括测序引物，所述测序引物包括如下序 列：根据GJB2基因设计的上游引物Fl和下游引物R1，所述Fl的序列如SEQ ID N0:1，所述 Rl的序列如SEQ ID N0:2 ;根据GJB3基因设计的上游引物F2和下游引物R2,所述Fl的序列 如SEQIDN0:3，所述R1的序列如SEQIDN0 :4;根据SLC26A4基因设计的上游引物F3-F16 和下游引物R3-R16，所述F3-F16的序列如SEQIDN0 :5-18，所述R3-R16的序列如SEQID NO: 19-32 ;根据12S rRNA基因设计的上游引物F17-18和下游引物Rl7-18，所述F17-F18的 序列如 SEQ ID N0:33-34,所述 R17-R18 的序列如 SEQ ID N0:35-36。
[0010] 本发明的有益效果在于：
[0011] (1)本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒的测序引物针对GJB2基因、 SLC26A4基因、12S rRNA基因和GJB3基因进行设计，可检测出位于GJB2基因的37个位点 突变，位于GJB3基因的2个位点突变，位于SLC26A4基因的59个位点突变，位于12S rRNA 基因的7个位点突变，总共105个位点，具有检测位点多、范围广，可以检测遗传性耳聋多个 基因的热点突变及稀有突变。现有市面上产品均无法检测稀有位点或只能检测少数稀有位 点，存在漏检的可能。本试剂盒可以弥补现有产品的缺陷，一次检测众多的稀有位点突变， 从而实现检测位点多、覆盖范围广、阳性检出率高、临床使用价值高的目的；
[0012] (2)可以用于婚前筛查、产前诊断、孕期胎儿及耳聋人群的遗传性耳聋基因位点筛 查检测，为全面开展遗传性耳聋基因筛查创造了条件，可极大地避免聋儿的出生及迟发性 耳聋的发生，减轻社会家庭的经济负担，实现优生优育；
[0013] (3)本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒具有灵敏度高（最低检出限为 5ng)、准确性高（达99%以上）、检测特异性高（达99%以上）、重复性高（99%以上）和检 测稳定性好的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例的线粒体1555A>G纯合子测序图谱；
[0015] 图2为本发明实施例的线粒体14940T纯合子测序图谱；
[0016] 图3为本发明实施例的GJB2176del 16杂合子测序图谱；
[0017] 图4为本发明实施例的GJB2235del C杂合子测序图谱；
[0018] 图5为本发明实施例的GJB2299del AT纯合子测序图谱；
[0019] 图6为本发明实施例的GJB3538CXT纯合子测序图谱；
[0020] 图7为本发明实施例的SLC26A4IVS7-2A>G杂合子测序图谱；
[0021] 图8为本发明实施例的SLC26A42168A>G杂合子测序图谱；
[0022] 图9为本发明实施例的SLC26A41174A>T纯合子测序图谱；
[0023] 图10为本发明实施例的SLC26A41226G>A纯合子测序图谱；
[0024] 图11为本发明实施例的SLC26A41229CXT纯合子测序图谱；
[0025] 图12为本发明实施例的SLC26A42027T>A纯合子测序图谱；
【具体实施方式】
[0026] 为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附 图予以说明。
[0027] 本发明最关键的构思在于：针对GJB2基因、SLC26A4基因、12S rRNA基因和GJB3 基因设计测序引物，从而具有检测位点多、覆盖范围广的优点。
[0028] 本发明根据遗传性耳聋基因突变的位点，设计特异的引物进行扩增，通过测序反 应从而可以对遗传性耳聋基因检测位点进行快速、高通量检测。本发明可以检测位于遗传 性耳聋四个基因 GJB2、GJB3、SLC26A4、12SrRNA上的105个突变位点的108种突变，包括热 点突变及稀有突变，共有引物18对，对应特异的PCR产物18组。
[0029] 1、测序引物设计：测序引物在设计上对引物的特异性要求高，以确保所扩增的 PCR产物片断单一、特异并包含检测位点，同时不存在非特异扩增。引物的Tm过高，虽可提 高引物特异性，但影响引物与模板序列的结合效率，导致产物量低。Tm值过低，虽可提高结 合效率，但影响其特异性，容易出现非特异扩增。引物的特异性与效率之间的平衡是本发明 测序引物设计中的难点。本发明的测序引物为经过大量筛选优化后获得，可确保PCR扩增 特异性的同时保证其扩增效率。为了使本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒在使用 上的方便，将引物退火温度统一设计为58°C左右（±3-5°C )。从NCBI数据库获取GJB2、 GJB3、SLC26A4、12SrRNA基因的DNA序列，并根据各突变位点的位置设计引物，对应扩增18 组PCR产物。优化后的最优引物与检测位点的对应关系如表1所示。表1为测序引物与检 测位点的对应关系表。
[0030] 表 1
[0031]
【权利要求】
1. 一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括测序引物，所述测序引物包 括如下序列： 根据GJB2基因设计的上游引物F1和下游引物R1，所述F1的序列如SEQ ID N0:1，所 述R1的序列如SEQ ID N0:2 ; 根据GJB3基因设计的上游引物F2和下游引物R2,所述F1的序列如SEQ ID NO: 3,所 述R1的序列如SEQ ID NO:4 ; 根据SLC26A4基因设计的上游引物F3-F16和下游引物R3-R16,所述F3-F16的序列如 SEQ ID N0:5-18,所述 R3-R16 的序列如 SEQ ID N0:19-32; 根据12S rRNA基因设计的上游引物F17-18和下游引物R17-18,所述F17-F18的序列 如 SEQ ID N0:33-34,所述 R17-R18 的序列如 SEQ ID N0:35-36。
2. 根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反 应液，所述PCR反应液包括MgCl2、PCR Buffer、dNTP混合液和DNA聚合酶。
3. 根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR测 序试剂，所述PCR测序试剂包括BigDye和5XSequencing buffer。
4. 根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，还包括质控 品，所述质控品为正常人基因组DNA。
【文档编号】C12Q1/68GK104404164SQ201410795636
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】刘晶晶, 危林耿, 梁少明, 向筑 申请人:亚能生物技术（深圳）有限公司