使用具有增强的鞭毛形成及运动性级联基因的表达的肠杆菌科细菌生产l-氨基酸的方法
【专利摘要】本发明提供了一种使用属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，特别是属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)或泛菌属(Pantoea)的能动细菌生产L-氨基酸的方法，其中细菌被修饰从而高表达至少一种鞭毛形成和运动性级联(motility?cascade)基因。
【专利说明】使用具有增强的鞭毛形成及运动性级联基因的表达的肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法
[0001]发明【技术领域】
[0002]本发明涉及微生物工业，更具体地涉及一种肠杆菌科细菌，其中与鞭毛形成和运动性级联相关的基因的表达被去调控，并涉及通过发酵上述鞭毛形成和运动性级联基因的表达增强的细菌来生产L-氨基酸的方法。
【背景技术】
[0003]传统上，L-氨基酸是利用从自然资源获得的微生物菌株，或其突变体，通过发酵方法生产的。典型地，将微生物加以修饰以提高L-氨基酸的产量。
[0004]已经报道了许多用于提高L-氨基酸产量的技术，包括使用重组DNA转化微生物(见例如美国专利N0.4，278，765)和改变调控区，例如启动子、前导序列和/或衰减子或其它本领域技术人员已知的区域(见例如US20060216796和W09615246A1)。其它可用于提高产量的技术包括提高参与氨基酸生物合成的酶的活性，和/或使目标酶对由产物L-氨基酸所致的反馈抑制脱敏(见例如W09516042A1，EP0685555A1或美国专利Nos.4，346，170，5，661，012 和 6，040，160)。
[0005]可用于通过发酵生产L-苏氨酸的菌株是已知的，包括参与L-苏氨酸生物合成的酶的活性增加的菌株(EP0219027A2 或美国专利 Nos.5，175，107; 5，661，012; 5，705，371; 5，939，307)，耐受化合物如L -苏氨酸及其模拟物的菌株(W00114525A1，EP301572A2,美国专利N0.5，376，538)，目标酶对由产生的L-氨基酸或其副产物所致的反馈抑制脱敏的菌株(美国专利Nos.5，175，107和5，661，012)，和苏氨酸降解酶被失活的菌株(美国专利Nos.5，939，307 和 6，297，031)。
[0006]有文献报道，运动性细菌例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)等可显示不同的生活方式，并可以是运动性的单细胞(或浮游状态)，也可以是少动的细胞(sedentary cells)，利用粘附菌毛(adhesive fimbriae)彼此聚集在一起并在表面上形成生物膜(O，Toole G.A.etal., Annu.Rev.Microbiol., 2000:54, 49-79) ? 例如，大肠杆菌(E.coli)细胞在对数后生长期(post-exponential growth phase)是高度可动的(Amsler C.D.et al., J.Bacteriol.，1993:175，6238-6244)，当进入静止期时则会通过诱导粘附性的curli菌毛(curIi fimbriae)而聚集或黏着在表面上(01s6n A.et al.，Nature, 1989:338，652-655)。
[0007]已知在大肠杆菌中，鞭毛形成与运动性、以及curli介导的粘附级联均处于前馈调控级联的控制之下，每一个级联均在顶端有一个主调控子，其发挥大环境信号整合子(massive environmental signal integrator)的作用(Pesavento C.etal., Gen.Dev.，2011:22, 2434-2446)。curli菌毛控制的级联是一般胁迫响应中的一个模块，其中oS因子(sigmaS, RpoS)发挥主调控子的作用(Hengge-Aronis R.2000.The general stress response in E.col1.1n Bacterial stress responses(eds.G.Storz and R.Hengge-Aronis), 161 - 178 页.ASM Press, Washington, DC.)。CsgD 蛋白显示是curli结构基因操纵子(csgBAC)的主要激动子(Gerstel U.et al., Mol.Microbiol.，2003:49，639-654)。
[0008]对于鞭毛表达和运动性级联而言，主调控子是FlhDC复合体，其是由flhDC操纵子表达的，f IhDC操纵子被定义为鞭毛第I类操纵子。鞭毛主调控子FlhDC以FlhD与FlhC蛋白所成的异源寡聚复合体(FlhD4C2复合体)的形式发挥功能，来源于大肠杆菌的该复合体的晶体结构已经得到解析(Wang S.et al.，J.Mol.Biol.，2006，355:798-808)。FlhDC 复合体调控细菌中来自多个鞭毛和非鞭毛操纵子的转录，特别地，它激活第2类操纵子的表达，第2类操纵子负责鞭毛和多种因子(FliA, FlgM)的内部部分(Pesavento C.et al.，Gen.Dev.，2011:22, 2434-2446)。在FlgM因子被分泌之后，FliA被释放而激活第3类操纵子，这类操纵子编码鞭毛发挥功能和趋化性所需的其他鞭毛蛋白的外部亚单位，以及若干功能仍然未知的蛋白(Aldrigde P.D.et al.，Gen.Dev.，2006:20，2315-2326)。
[0009]细胞运动性和curli菌毛表达的另一个关键调控子是降解二 _(3’ _5’)_环二鸟苷单磷酸(c- 二 -GMP)的磷酸二酯酶(I3DE)，例如YhjH和YciR (后者除了 c_ 二 -GMP PDE活性之外，还发挥相反方向的二鸟苷酸环化酶的功能)。已经证明过表达C-二-GMP PDE可以通过强烈抑制curli菌毛的表达和生物膜基质组分纤维素而干扰肠内细菌的运动性(Romling U.et al., Mol.Microbiol., 2005:57, 629-639; Jenal U.and Malone J., Annu.Rev.Genet.，2006:40, 385-407)。在特殊的实例中，YhjH显示在运动性中发挥正向作用(KoM.and Park C.，J.Mol.Biol.，2000:303，371-382)。
[0010]FliZ蛋白由处于fliA的直接下游的基因表达,它被证明是大肠杆菌中curli菌毛形成的高强度抑制物，抑制方式是通过干扰控制curli表达相关基因的O s因子的活性(Pesavento C.et al.，Gen.Dev.，2011:22，2434-2446)。更具体地，只要鞭毛基因持续表达，FliZ便会短暂地给予运动性(并且因此给予觅食策略)以优先于一般的胁迫响应的优先性。
[0011]被修饰而减弱了 CSgBAC或/和CSgDEFG操纵子的表达(RU2338782)或被修饰而不产生I型菌毛粘附蛋白(EP1838726A1)的肠杆菌科细菌已被用于生产L-氨基酸，特别是L-苏氨酸。
[0012]而且，从W02002097089A1已知，失活或删除了一个或多个与鞭毛构成或鞭毛运动相关的基因的含鞭毛微生物可以用作生产有用物质(例如氨基酸)的宿主(W02002097089A1)。
[0013]目前为止，尚没有报道强调关于提高细菌中参与鞭毛形成和运动性级联的基因(flhDC, yhjH和fIiZ)的表达对L-氨基酸，更特别是L-苏氨酸和L-苯丙氨酸，的生产的有利效果。
[0014]发明的公开
[0015]本发明的方面包括提供一种属于肠杆菌科的细菌，特别是属于埃希氏菌属、肠杆菌属和泛菌属的细菌，其中增强了鞭毛形成和运动性级联基因的表达，并提供了使用所述细菌生产L-氨基酸，特别是L-苏氨酸和L-苯丙氨酸的方法。该目的是通过如下的发现而实现的，即大肠杆菌中鞭毛形成和运动性级联基因的表达增强导致L-氨基酸的产生增加，这样的基因例如flhDC操纵子基因，它们编码DNA结合性转录双调控子FlhD和FlhC，FlhD和FlhC是鞭毛主调控子FlhD4C2复合体的一部分。本发明人还发现，通过将flhDC操纵子基因与其它具有增强的表达的鞭毛形成和运动性级联基因如yhjH和fliZ组合使用，可以实现L-氨基酸生产的增加。
[0016]本发明的一个方面是提供一种用于生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养细菌，其中所述细菌属于肠杆菌科，并能够产生L-氨基酸，和从培养基收集L-氨基酸，其中细菌已经过修饰而增强了鞭毛形成和运动性级联的至少一种基因的表达。
[0017]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述至少一种基因选自下组:flhDC操纵子基因、yhjH基因、fIiZ基因，及其组合。
[0018]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述flhDC操纵子基因的表达是通过修饰基因的表达控制区而增强的。
[0019]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述flhDC操纵子基因的表达是通过增加所述基因的拷贝数而增强的。
[0020]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属。
[0021]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。
[0022]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于肠杆菌属。
[0023]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于泛菌属。
[0024]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中flhD基因编码选自下组的蛋白:
[0025](A)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白；
[0026](B)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、但是其中有一个或数个氨基酸残基进行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根据氨基酸序列SEQ ID N0:2的DNA结合性转录双调控子活性；和
[0027](C)上述的组合。
[0028]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中flhC基因编码选自下组的蛋白:
[0029](D)包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的蛋白；
[0030](E)包含SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列、但是其中有一个或数个氨基酸残基进行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根据氨基酸序列SEQ ID N0:4的DNA结合性转录双调控子活性；和
[0031](F)上述的组合。
[0032]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中yhjH基因编码选自下组的蛋白:
[0033](G)包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的蛋白；和
[0034](H)包含SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列、但是其中有一个或数个氨基酸残基进行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根据氨基酸序列SEQ ID N0:6的环-二 -GMP磷酸二酯酶活性；和
[0035](I)上述的组合。
[0036]本发明的另`一个方面是提供如上所述的方法，其中fliZ基因编码选自下组的蛋白:[0037](J)包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的蛋白；和
[0038](K)包含SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列、但是其中有一个或数个氨基酸残基进行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根据氨基酸序列SEQ ID N0:8的调控子活性；和
[0039](L)上述的组合。
[0040]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是芳香族L-氨基酸。
[0041]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。 [0042]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是非芳香族L-氨基酸。
[0043]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中非芳香族L-氨基酸是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
[0044]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
[0045]本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸是L-苏氨酸。
[0046]附图简述
[0047]图1是构建kan_Ptae7DNA片段的示意图。
[0048]图2是构建cat-PyhjH_yhjH DNA片段的示意图。
[0049]图3是构建Cat-Ptac7DNA片段的示意图。
[0050]发明详细说明
[0051]下面对本发明进行详细说明。
[0052]1.根据本发明的细菌
[0053]词语“L-氨基酸生产细菌”可以意指当该细菌在培养基中培养时，能够产生L-氨基酸并造成L-氨基酸在培养基中积累的细菌。L-氨基酸生产能力的意思是，当细菌在培养基中培养时，细菌在培养基或细菌细胞中产生L-氨基酸、并将L-氨基酸积累到能够从培养基或细菌细胞中收集L-氨基酸的程度的能力。术语“L-氨基酸”可以包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。
[0054]术语“芳香族L-氨基酸”可以包括L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、和L-色氨酸。术语“非芳香族氨基酸”可以包括L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、和L-精氨酸。L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸是特别的例子。
[0055]L-氨基酸可以包括游离形式或其盐形式的L-氨基酸，例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐和钾盐。
[0056]L-氨基酸可以通过本发明的方法单独产生或者作为两种或更多种L-氨基酸的混合物产生。
[0057]细菌可以本身具有L-氨基酸生产能力或者可以如本文所述使用突变方法或DNA重组技术加以修饰而具有L-氨基酸生产能力。
[0058]属于肠杆菌科的细菌可以包括来自肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、摩根氏菌属(Morganella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)等,并具有前述的L-氨基酸生产能力的细菌。具体地，可以使用可根据NCBI (美国国家生物技术信息中心)数据库
[0059](www.ncb1.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)中使用的分类法分类到肠杆菌科的细菌。可以如本文所述进行修饰的肠杆菌科菌株的实例包括来自埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。 [0060]可以被修饰从而获得根据本公开主题的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属菌株没有特别的限制，具体地说，可以使用在Neidhardt等的工作中描述的那些(Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives ofE.coli K-12, 2460-2488 页.该文收载于 F.C.Neidhardt 等(编辑)，Ε.coli andSalmonella:cellular and molecular biology,第二 版.ASM Press, Washington, D.C.，1996)。大肠杆菌物种是一个具体实例。大肠杆菌的具体实例包括大肠杆菌W3110(ATCC27325),大肠杆菌MG1655 (ATCC47076)等，其来自于原型野生型菌株K-12。这些菌株可以从例如美国典型微生物菌种保藏中心(P.0.Boxl549, Manassas, VA20108, United States of America)获得。也就是说,每一个菌株均有登录号，并且这些菌株可以通过这些登录号进行订购(参考冊w.atcc.0rR)0菌株的登录号在美国典型微生物菌种保藏中心的目录中列出。
[0061]肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌属细菌的例子包括Pantoea ananatis等等。成团肠杆菌的一些菌株最近根据其16S rRNA的核苷酸序列分析等被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis 或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。可以使用属于肠杆菌属或泛菌属中任一属的细菌，只要它是可被归类到肠杆菌科的细菌即可。当通过遗传工程技术繁育Pantoea ananatis菌株时,可以使用Pantoea ananatis AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356 菌株(FERM BP-6615)、AJ13601 菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。当这些菌株首次被分离时，它们被鉴定为成团肠杆菌，并以成团肠杆菌的名义保藏。然而，根据如上所述的其16S rRNA的核苷酸序列等，它们最近被重新归类为Pantoeaananatis。
[0062]词语“运动性细菌”(motile bacterium)可以是单细胞细菌或浮游细菌,其在培养基中培养时处于或者进入有限生长期(definite growth phase),在合适的环境下会使用多根或单根鞭毛显示自我推进的运动，但不仅限于此。具体地，可以使用在《Bergey’sManual of Systematic Bacteriology》(第二版，Springer, New York)中描述的那些。本发明中采用的词语“运动性细菌”还指如下的细菌，其能够或者具有向前移动(游动)的能力，以低于、等于或高于野生型或未经修饰的亲本细菌的速度通过培养基。词语“运动性细菌”还指如下的细菌，其能够或者有能力以运动性单细胞或浮游状态存在，其存在时期短于、等于或长于野生型或未经修饰的亲本细菌。[0063]本发明可以通过增强或增加与鞭毛形成和运动性级联相关的基因的表达来实现。
[0064]词语“与鞭毛形成和运动性级联相关的基因”是指任何这样的基因，其参与鞭毛形成和运动性级联，并且编码通过各种机制直接或间接参与功能性鞭毛形成和组装，或者编码和促进或延长细菌能动性的蛋白。与鞭毛形成和运动性级联相关的基因的实例可以是，但不限于，编码鞭毛主调控子FlhD4C2复合体的flhDC操纵子基因，该复合体对细菌鞭毛形成有积极影响。与鞭毛形成和运动性级联相关的基因的其它实例包括编码C-二-GMP PDE的yhjH基因，其减少细菌中的c-d1-GMP池，和干扰O s活性的fliZ基因。
[0065]词语“功能性鞭毛”可以指能够进行旋转或其它运动、使得细菌可被视为运动性细菌的正确组装的鞭毛。
[0066]词语“鞭毛形成和运动性级联的至少一种基因”可以指鞭毛形成和运动性级联的一种或多种基因，可以包括，但不限于，flhDC操纵子基因、yhjH基因和fliZ基因的任意组
口 o
[0067]词语“flhDC操纵子基因、yhjH基因、和fliZ基因的任意组合”可以指从flhDC操纵子基因、yhjH基因、和fIiZ基因中选出的一个基因，或者从flhDC操纵子基因、yhjH基因、和fliZ基因中选出的两个或多个不同的基因，但不仅限于这些组合。
[0068]词语“经过修饰从而增强了鞭毛形成和运动性级联的至少一种基因的表达”可以指，与未经修饰的菌株，例如野生型或亲本菌株相比，每个细胞中由flhDC操纵子基因和/或yhjH基因和/或fliZ基因编码的分子数目提高，或者由这些基因编码的蛋白中每个分子的活性(可以称作比活性)提高。细菌可以被修饰，从而使每个细胞中蛋白的活性提高到未经修饰菌株中活性的150%或更高，在另一个实例中被提高到200%或更高，在另一个实例中被提高到300%或更高。作为上述比较中的参照物的未经修饰菌株的实例，例如属于肠杆菌科微生物的野生型菌株，包括例如大肠杆菌MG1655菌株(ATCC47076)，W3110菌株(ATCC27325), Pantoea ananatis AJ13335 菌株(FERMBP-6614)等。
`[0069]可用于增强这些基因或操纵子基因的表达的方法包括增加操纵子基因的拷贝数和/或将这些基因或操纵子基因引入到能够增加这些基因或操纵子基因在肠杆菌科细菌中的拷贝数的载体中。为了提高这些基因的表达，可以增加细胞中所述基因的拷贝数，例如通过利用基因重组技术来实现。可以通过将含有基因的DNA片段连接到可在宿主细菌中发挥功能的载体，例如多拷贝载体中，制成重组DNA，并将其引入到细菌内以转化细菌，来增加基因的拷贝数。可在大肠杆菌细胞中自主复制的载体实例包括pUC19，pUC18，pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG 和 pACYC 系列载体可以从 Takara Bio Inc.获得)，RSFlO 10，pBR322, pMW219 (pMW219 可以从 Nippon Gene C0.Ltd 获得)，pSTV29 (可以从Takara Bio Inc.获得)等。
[0070]基因或操纵子基因表达的增强还可以通过将所述基因或操纵子基因的多个拷贝导入细菌染色体DNA中来实现，例如通过同源重组、Mu整合等。同源重组可以利用在染色体DNA中以多拷贝存在的序列来实施。在染色体DNA中具有多拷贝的序列包括，但不限于，存在于可转座元件末端的重复DNA或倒位重复序列。此外，有可能将基因或操纵子基因组入转座子中，并让其转移，从而将该基因或操纵子基因的多个拷贝导入染色体DNA中。通过使用Mu整合，在一次操作中可以向染色体DNA中引入最多达3个基因拷贝。
[0071]增强基因或操纵子基因的表达还可以通过将DNA置于强启动子的控制之下来实现。例如，Iac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的Pk或Plj启动子是公知的强启动子。可以使用能够在属于肠杆菌科的细菌中提供高水平基因表达的强启动子。或者，启动子的效果可以通过如下方法加以增强，例如在细菌染色体基因或操纵子基因的启动子区引入突变，从而获得更强的启动子功能，因此导致位于启动子下游的基因或操纵子基因的转录水平提高。而且，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区内的，特别是起始密码子直接上游的序列中的数个核苷酸替换对mRNA的可翻译性有深远的影响。例如，发现表达水平有20倍的范围波动，这取决于起始密码子的前三个核苷酸的性质(Gold L.et al., Annu.Rev.Microbiol., 1981:35, 365-403; Hui A.et al., EMBOJ.，1984:3, 623-629)。强启动子的使用可以与基因拷贝的增加组合使用。
[0072]用于制备质粒DNA，消化、连接和转化DNA，选择寡核苷酸作为引物等的方法，可以是本领域技术人员众所周知的普通方法。这些方法在例如Sambrook J., FritschE.F.and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二 版”，ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)中有描述。分子克隆和异源基因表达的方法在 Bernard R.Glick, Jack J.Pasternak and Cheryl L.Patten, “MolecularBiotechnology: principles and applications of recombinant DNA”，第四版，Washington, D.C: ASM Press (2009) ; Evans Jr., T.C.and Xu M.-Q., “Heterologousgene expression in E.coli，，，第一版，Humana Press (2011)中有描述。
[0073]基因的表达水平可以通过使用各种已知的方法测量从基因转录的mRNA的量加以确定，所述方法包括Northern印迹、定量RT-PCR等。由基因编码的蛋白量可以通过已知的方法进行测量，包括SDS-PAGE，随后进行免疫印迹测定(Western印迹分析)等。
[0074]鞭毛形成和运动性 级联的基因包括选自flhDC操纵子、yhjH和fliZ基因中的基因。
[0075]flhDC操纵子包括两个基因，即flhD和flhC。
[0076]flhD 基因编码 DNA 结合性转录双调控子 FlhD (KEGG, Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes,登录号 N0.bl892)。flhD 基因(GenBank 登录号 N0.NC_000913.2;核苷酸位置:1,975,871-1，976，221，互补物;基因ID:945442)位于大肠杆菌K-12染色体flhC和insB基因之间。flhD基因的核苷酸序列和由flhD基因编码的FlhD蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示。
[0077]fIhC 基因编码 DNA 结合性转录双调控子 FlhC(KEGG, Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes,登录号 N0.bl891)。f IhC 基因(GenBank 登录号 N0.NC_000913.2;核苷酸位置:1,975, 290-1,975, 868,互补物;基因ID:947280)位于大肠杆菌K-12染色体motA和flhD基因之间。fIhC基因的核苷酸序列和由f IhC基因编码的FlhC蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0078]yhjH基因编码环-二-GMP憐酸二酯酶YhjH(KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,登录号 N0.b3525)。yhjH 基因(GenBank 登录号 N0.NC_000913.2;核苷酸位置:3,676, 443-3，677，210，互补物;基因ID:948042)位于大肠杆菌K-12染色体上的yhjG和kdgK基因之间。yhjH基因的核苷酸序列和由yhjH基因编码的YhjH蛋白的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示。
[0079]f IiZ基因编码RpoS拮抗剂和假定的FliA活性调控子FliZ (KEGG, KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes,登录号 N0.bl921)。fliZ 基因(GenBank 登录号N0.NC_000913.2;核苷酸位置:1，998，497-1，999，048，互补物；基因 ID:946833)位于大肠杆菌上的K-12染色体fIiY和fliA基因之间。fIiZ基因的核苷酸序列和由fIiZ基因编码的FliZ蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0080]因为肠杆菌科各属或菌株之间DNA序列可能存在一些差异，所以染色体上要增强的flhDC操纵子基因和yhjH和fliZ基因分别并不仅限于SEQ ID NO: 1，3，5或7所示的基因，而可以包含与NO: 1，3，5或7同源的基因，其编码FlhD，FlhC, YhjH或FliZ蛋白的变体。词语“变体蛋白”可以指序列发生改变，可以是一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、添加、替换或倒位，的蛋白，但是仍然保持分别与FlhD，FlhC, YhjH或FliZ蛋白相似的活性。变体蛋白中的改变数目取决于在蛋白三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。在一个实例中，SEQ ID N0:2，4，6或8中是1-30个，在另一个实例中是1-15个，在另一个实例中是1-5个。
[0081]一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、添加或替换可以是保守突变，从而使flhDC操纵子基因和yhjH和fliZ基因编码的蛋白的活性被保持。代表性的保守突变可以是保守取代。保守取代可以是如下取代，其中如果取代位点是芳香族氨基酸，则取代在Phe、Trp和Tyr之间相互发生；如果取代位点是疏水氨基酸，则发生于Leu、Ile和Val之间；如果是极性氨基酸，则发生于Gln和Asn之间；如果是碱性氨基酸，则发生于Lys、Arg和His之间；如果是酸性氨基酸，则发生于Asp和Glu之间；如果是具有羟基的氨基酸，则发生于Ser和Thr之间。视为保守取代的具体取代实例包括Ser或Thr取代Ala ；Gln, His或Lys取代 Arg ；Glu, Gin, Lys, His 或 Asp 取代 Asn ；Asn, Glu 或 Gln 取代 Asp ；Ser 或 Ala 取代 Cys ；Asn, Glu, Lys, His, Asp 或 Arg 取代 Gln ；Gly, Asn, Gin, Lys 或 Asp 取代 Glu ；Pro 取代 Gly ；Asn, Lys, Gin, Arg 或 Tyr 取代 His ；Leu, Met, Val 或 Phe 取代 He ；Ile, Met, Val 或 Phe 取代Leu ；Asn, Glu, Gin, His 或 Arg 取代 Lys ；Ile, Leu, Val 或 Phe 取代 Met ；Trp, Tyr, Met, Ile 或Leu 取代 Phe ；Thr 或 Ala 取代 Ser ；Ser 或 Ala 取代 Thr ；Phe 或 Tyr 取代 Trp ；His, Phe 或Trp取代Tyr ；Met, Ile或Leu取代Val。如上所述的这些氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加、倒位等突变还可以包括根据具有flhDC操纵子基因和yhjH和fliZ基因(突变体或变体) 的微生物的个体差异、物种差异自然发生的突变等。
[0082]变体中的这些变化可以发生在对蛋白质功能不关键的蛋白区域内。这是因为一些氨基酸与另一种高度同源，以至于三维结构或活性不会因这种改变而受到影响。因此，由flhDC操纵子的每一个基因或yhjH或fliZ基因编码的蛋白变体与SEQ ID N0s:2，4，6或8所示的整个氨基酸序列相比可以具有不小于80%的同源性，在另一个实例中不小于90%，在另一个实例中不小于95%，在另一个实例中不小于97%，或者在另一个实例中不小于99%的同源性，只要能够保持如上所述的FlhD或FlhC蛋白的功能性，或者由FlhD和FlhC蛋白组装的FlhD4C2复合体的功能性，以及YhjH或FlizH蛋白的功能性即可。两条氨基酸序列之间的同源性可以使用众所周知的方法加以确定，例如计算机程序BLAST (基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool), www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),其计算三种参数:得分、同一性和相似度。
[0083]而且，flhDC操纵子的每一个基因和yhjH和fliZ基因可以是这样的变体，其在严格条件下同与SEQ ID N0s:l，3，5或7所示序列互补的核苷酸序列杂交，或者在严格条件下同从所述核苷酸序列中制备出的探针杂交，只要它能够编码功能性FlhD或FlhC蛋白，或者由FlhD和FlhC蛋白组装的FlhD4C2复合体，或在失活之前的YhjH或FlizH蛋白即可。“严格条件”包括如下的条件，在该条件下能够形成特异的杂交体，例如同源性不小于80%的杂交体，在另一个实例中是同源性不小于90%的杂交体，在另一个实例中是同源性不小于95%的杂交体，在另一个实例中是同源性不小于97%的杂交体，在另一个实例中是同源性不小于99%的杂交体，而不会形成非特异的杂交体,例如同源性小于上述的杂交体。例如，严格条件的实例可以是在1XSSC，0.1%SDS的盐浓度下，或者在另一个实例中在0.1XSSC,0.1%sds的盐浓度下，在60°c，或者在另一个实例中在65°C下清洗I次或者更多次，或者在另一个实例中清洗2次或3次。清洗的持续时间取决于用于印迹的膜的类型，并且，原则上应当是制造商所推荐的。例如，对于Amersham Hybond?-N+正电荷尼龙膜(GE Healthcare),在严格条件下的推荐清洗持续时间为15分钟。清洗步骤可以执行2-3次。作为探针，也可以使用与SEQ ID N0:1，3，5或7所示序列互补的序列的一部分。这类探针可以通过PCR产生，使用根据SEQ ID N0:1，3，5或7所示序列制备的引物，和含有该核苷酸序列的DNA片段作为模板。探针的长度推荐为>50bp ;它可以根据杂交条件合适地选出，通常为100bp-lkbp。例如，当使用长度为大约300bp的DNA片段作为探针时，杂交后的清洗条件的实例可以为2 X SSC, 0.1%SDS，50°C或60°C，或者在另一个实例中为65°C。
[0084]因为编码大肠杆菌中FlhD，FlhC，YhjH和FliZ蛋白的基因已经被阐明(见上文)，所以它们以及它们的变体蛋白可以通过PCR获得(聚合酶链式反应；参考White T.J.etal.，Trends Genet.，1989:5，185-189)，分别使用根据 flhD, flhC, yhjH 和 fIiZ 基因的核苷酸序列制备的引物。其它微生物中编码FlhD，FlhC, YhjH和FliZ蛋白或其突变体蛋白的基因可以用类似的方式获得。
[0085]下面描述赋予属于肠杆菌科的细菌生产L-氨基酸，例如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸和/或L-高丝氨酸的方法，和增强属于肠杆菌科的细菌的生产上述L-氨基酸的能力的方法。
[0086]为了赋予生产L-氨基酸的能力，可以使用在埃希氏菌属的棒状杆菌型细菌选育中通常米用的方法(见“Amino acid fermentation，，, Gakkai Shuppan Center (Ltd.)，77-100页，第一版，1986)。这些方法包括获得营养缺陷突变体、L-氨基酸类似物抗性菌株、或代谢条件突变体的性质，或者通过构建重组菌株，使其过表达某种L-氨基酸生物合成酶。这里，在L-氨基酸生产细菌的选育中，可以赋予上述的一种或多种性质，例如营养缺陷、类似物抗性和代谢调控突变。L-氨基酸生物合成酶的表达可以单独地提高，或者是两种或更多种组合提高。而且，赋予营养缺陷、类似物抗性和代谢调控突变等性质的方法可以和增强生物合成酶相组合。
[0087]具有生产L-氨基酸能力的营养缺陷突变体菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株、或代谢调控突变体菌株可以通过这样的方式获得:使亲本或野生型菌株经历常规的突变，例如暴露于X射线或UV辐射，或使用突变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)，然后从所得的突变体菌株中选出显示营养缺陷、类似物抗性或代谢调控突变，同时还具有L-氨基酸生产能力的菌株。
[0088]L-苏氨酸生产细菌
[0089]可用于衍生L-苏氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美国专利N0.5，175，107，美国专利 N0.5，705，371)，大肠杆菌 472T23/pYN7 (ATCC98081)(美国专利 N0.5，631，157)，大肠杆菌NRRL-21593 (美国专利N0.5，939，307)，大肠杆菌FERM BP-3756 (美国专利N0.5,474,918)，大肠杆菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美国专利 N0.5,376,538)，大肠杆菌 MG442 (Gusyatiner M.et al.，Genetika (俄语)，1978:14，947-956)，大肠杆菌 VL643和 VL2055 (EPl 149911A)等。
[0090]菌株TDH-6是thrC基因缺陷的,具有鹿糖同化性(sucrose assimilability),并且ilvA基因具有渗漏突变。该菌株在rhtA基因中也有突变，其赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996包含质粒PVIC40，其通过将包含突变thrA基因的thrA*BC操纵子插入到RSF1010衍生载体中获得。该突变thrA基因编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I，其对苏氨酸所致的反馈抑制基本上脱敏(美国专利N0.5，175，107)。菌株B-3996于1987年11月19日以保藏号RIA1867保藏在抗生素联合科学中心(All-Union Scientific Centerof Antibiotics)(Russian Federation,117105Moscow, Nagatinskaya Street3_A)。该菌株还于1987年4月7日以登录号B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(Russian Federation,117545Moscow, 1st Dorozhny proezd, I)。 [0091]大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792B1)也可以用作用于衍生L-苏氨酸生产细菌的亲本菌株。菌株B-5318对异亮氨酸是自养的，温度敏感型入噬菌体Cl阻遏物和PR启动子代替了质粒PVIC40中苏氨酸操纵子的调控区。菌株VKPM B-5318于1990年5月3日以保藏号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms)(VKPM)。
[0092]细菌可以被额外修饰以增强下述一个或多个基因(RU2275424)的表达:
[0093]-突变的thrA基因，其编码对L-苏氨酸所致的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I ;
[0094]-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；
[0095]-thrC基因,其编码苏氨酸合酶；
[0096]-rhtA基因，其编码苏氨酸和高丝氨酸外流系统(一种内膜转运子)蛋白；
[0097]_asd基因，其编码天冬氨酸-0 -半醛脱氢酶；和
[0098]-aspC基因，其编码天冬氨酸转氨酶。
[0099]编码大肠杆菌天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经被阐明(KEGG条目号 b0002;GenBank 登录号 NC_000913.2;核苷酸位置:337-2, 799;基因 ID:945803) ?在大肠杆菌K-12的染色体上，thrA基因位于thrL和thrB基因之间。
[0100]编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因已经被阐明(KEGG条目号b0003; GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:2，801-3，733;基因ID:947498)。在大肠杆菌K-12的染色体上，thrB基因位于thrA和thrC基因之间。
[0101]编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC基因已经被阐明(KEGG条目号b0004;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:3，734-5，020;基因ID: 945198)。在大肠杆菌K-12的染色体上，thrC基因位于thrB和yaaX基因之间。所有三个基因作为一个苏氨酸操纵子thrABC发挥功能。为了增强苏氨酸操纵子的表达，从操纵子除去影响转录的衰减子区是理想的(W02005049808A1, W02003097839A1)。[0102]编码对L-苏氨酸所致的反馈抑制抵抗的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I突变thrA基因，以及thrB和thrC基因可以从众所周知的质粒pVIC40上作为一个操纵子获得，该质粒存在于产生苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPMB-3996中。质粒pVIC40在美国专利N0.5，705, 371中有详细描述。
[0103]编码大肠杆菌苏氨酸和高丝氨酸外流系统(一种内膜转运子)的rhtA基因已经被阐明(KEGG条目号 b0813;GenBank登录号 NC_000913.2;核苷酸位置:848，433-849，320，互补物；基因ID:947045)。在大肠杆菌K-12的染色体上，rhtA基因位于dps和ompX基因之间，接近编码谷氨酰胺转运系统组分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与ybiF基因(KEGG条目号B0813)相同。
[0104]编码大肠杆菌天冬氨酸-β -半醛脱氢酶的asd基因已经被阐明(KEGG条目号b3433;GenBank 登录号 NC_000913.2;核苷酸位置:3，571，798-3，572，901，互补物;基因ID:947939) 0在大肠杆菌K-12的染色体上，asd基因位于相同链上的glgB和gntU基因(相反链上是yhgN基因)之间。
[0105]另外，编码大肠杆菌天冬氨酸转氨酶的aspC基因已经被阐明(KEGG条目号b0928; GenBank 登录号 NC_000913.2;核苷酸位置:983，742-984，932，互补物；基因ID:945553)。在大肠杆菌K-12的染色体上，aspC基因位于相反链上的ycbL基因和相同链上的ompF基因之间。
[0106]而且，L-苏氨酸生产细菌中对L-苏氨酸合成或积累有负调控作用的酶的活性可以被降低或没有活性。这些酶的实例包括tdh基因编码的苏氨酸脱氢酶等(W02009022754A1)。
[0107]大肠杆菌Β-3996Λ (ordL-narff)菌株也可以用作用于衍生L-苏氨酸生产细菌的亲本菌株。菌株Β-3996Λ (ordL-narW)被命名为AG7843，并于2010年5月21日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms) (Russian Federation, 117545Moscow, 1st Dorozhny proezd, I),登录号为B-10647，并且后来根据布达佩斯条约的规定于2012年7月19日将国家保藏形式转变为国际保藏形式。
[0108]L-赖氨酸生产细菌
[0109]下面示例描述L-赖氨酸生产细菌和用于构建它们的方法。
[0110]具有L-赖氨酸生产能力的菌株实例包括，例如L-赖氨酸类似物抗性菌株和代谢调控突变菌株。L-赖氨酸类似物的实例包括，但不限于，氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸异轻厢酸(lysine hydromate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、Y-甲基赖氨酸、α _氯代己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等。可通过对属于埃希氏菌属的细菌施以常规人工诱变处理，获得对这些赖氨酸类似物有抗性的突变体菌株。L-赖氨酸生产细菌的具体实例包括大肠杆菌AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185,见日本特开昭56-18596和美国专利N0.4，346，170)，大肠杆菌VL611菌株(日本特开2000-189180)，等。也可以使用WC196菌株作为产L-赖氨酸的大肠杆菌(见国际专利公开W096/17930)。
[0111]而且，L-赖氨酸生产细菌还可以通过增加L-赖氨酸生物合成系统酶的活性来构建。这类酶的活性可以通过增加细胞中编码该酶的基因的拷贝数，或者通过修饰其表达控制序列来增加。增加编码`L-赖氨酸生物合成系统的酶的基因的拷贝数和修饰其表达控制序列可以通过与后文中对gltP和gits基因所述的相同的方法来实现。
[0112]编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的实例包括编码二氨基庚二酸通路的酶的基因，例如二氢吡唳二羧酸(dihydrodipicolinate)合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(IysC)、二氢吡唳二羧酸还原酶基因(dapB), 二氨基庚二酸(diaminopimelate)脱羧酶基因(IysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(前述所有基因见W096/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(日本特开昭60-87788)，天冬氨酸转氨酶(aspC)(日本特公平6-102028)，和天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd) (W000/61723),和编码氨基己二酸(aminoadipic)途径的酶的基因，例如高乌头酸(homoaconitrate)水合酶基因(日本特开N0.2000-157276)。此外，细菌菌株可以具有更高表达水平的参与能量效率的基因(cyo)(欧洲专利公开1170376)，编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利N0.5,830,716),编码具有L-赖氨酸分泌活性的蛋白的ybjE基因(W02005/073390)，编码谷氨酰胺脱氢酶的基因(gdhA) (Gene23:199-209，1983)，或这些的随机组合。基因的缩写在括号中显示。在前述基因中，ybjE基因是一个实例。
[0113]已知，来自大肠杆菌的野生型二氢吡啶二羧酸合成酶被L-赖氨酸所致的反馈抑制，并且已知来自大肠杆菌的野生型天冬氨酸激酶受到L-赖氨酸所致的阻遏和反馈抑制。因此，当使用dapA基因和IysC基因时，可以使用编码对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱敏的突变酶的基因。编码对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱敏的突变二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA的实例包括编码具有如下氨基酸序列的蛋白的DNA，其中118位的组氨酸残基被酪氨酸残基代替。编码对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱敏的突变天冬氨酸激酶的DNA的实例包括编码具有如下氨基酸序列的AKIII蛋白的DNA，其中352位的苏氨酸残基、323位甘氨酸残基和318位的甲硫氨酸残基分别被异亮氨酸、天冬氨酸和异亮氨酸残基替换(关于这些突变体，见美国专利Nos.5，661，012和6，040，160)。这些突变DNA可以使用PCR通过定点诱变等方法获得。
[0114]宿主范围宽的质粒RSFD80、pCABl和pCABD2已知含有编码突变二氢吡啶二羧酸合成酶的突变dapA基因和编码突变天冬氨酸激酶的突变IysC基因(美国专利N0.6，040，160)。用这种质粒转化的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ12396(美国N0.6，040, 160)，并且该菌株于1993年10月28日保藏在通商产业省工业技术院生命工学技术石开究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency ofIndustrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology,International Patent OrganismD印ositary)，保藏号为FERM P-13936，并且后来根据布达佩斯条约的规定于1994年11月I日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-4859。RSFD80可以通过常规方法从AJ12396菌株获得。
[0115]而且，L-氨基酸生产细菌中催化导致从L-氨基酸生物合成通路发生分支，并产生另一种化合物的反应的酶的活性可以被降低或没有活性。另外，该细菌中对L-氨基酸合成或积累有负面影响的酶的活性可以被降低或没有活性。这些参与L-赖氨酸生产的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA，ldcC)、苹果酸酶等，这些酶的活性降低或缺失的菌株在 W095/23864, W096/17930, W02005/010175 等中公开。[0116]编码赖氨酸脱羧酶的cadA和IdcC基因的表达可以均被降低，以便降低或缺失赖氨酸脱羧酶活性。两种基因的表达可以通过例如W02006/078039中描述的方法加以降低。
[0117]为了减少或消除酶的活性，可以通过已知的突变方法或基因重组技术在基因组上编码这些酶的基因中引入突变，从而减少或消除细胞内所述酶的活性。这种突变的引入可以通过，例如，利用遗传重组消除基因组上编码酶的基因，或者修改表达控制序列，例如启动子或Shine-Dalgarno (SD)序列，来实现。还可以引入突变以赋予氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)，或移框突变，其导致基因组上在编码酶的区域内添加或缺失一个或两个核苷酸，或者所述基因部分或完全缺失(J.Biol.Chem.,272:8611-8617，1997)。
[0118]酶活性的降低或消除还可以通过构建编码突变酶的基因，所述突变酶中编码区被完全或部分缺失，并通过同源重组等用该基因代替基因组上的正常基因，或者通过在基因中引入转座子或IS因子。例如，为了通过遗传重组引入降低或消除上述酶的活性的突变，可以使用如下方法。通过修饰目标基因序列的一部分制备突变基因，使其不编码能正常行使功能的酶，然后可以用含有该突变基因的DNA转化属于肠杆菌科的细菌，导致基因组上相应的基因与突变基因重组，从而使突变的基因取代基因组上的目标基因。这些使用同源重组进行基因取代的实例包括使用线性DNA的方法，例如称作Red-驱动整合(Datsenko K.A.and Wanner B.L.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000, 97:6640-6645)的方法，和将Red-驱动整合与源自于λ噬菌体的切出系统联用的方法(Cho Ε.H.et al.，J.Bacteriol., 2002, 184:5200-5203)(参考 W02005/010175)，使用含有温度敏感复制原点的质粒的方法(美国专利N0.6，303，383，日本专利特开平05-007491)等。而且，这些如上所述的基于使用同源重组进行基因取代的定点突变方法还可以使用不能在宿主体内复制的质粒来实施。
[0119]L-赖氨酸生产细菌的实例包括大肠杆菌WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2菌株(W02006/078039)。该菌株的构建是通过将含有赖氨酸生物合成基因的质粒pCABD2 (美国专利N0.6, 040, 160)引入到cadA和IdcC基因被打断的WC196菌株中，这两个基因编码赖氨酸脱羧酶。WC196菌株是从衍生自大肠杆菌K-12的W3110菌株选育而得，其中用编码突变体天冬氨酸激酶III的突变IysC基因取代了 W3110菌株染色体上的野生型IysC基因，该突变体天冬氨酸激酶III中352位苏氨酸被异亮氨酸代替，导致对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱`敏(美国专利N0.5，661，012)，并使赋予所得的菌株AEC抗性(美国专利N0.5，827，698)。WC196菌株被命名为大肠杆菌AJ13069，于1994年12月6日保藏在通商产业省工业技术院生命工学技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technologyj Agency of Industrial Science andTechnology)(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心)(independentadministrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology, International Patent Organism Depositary)地址日本茨城县筑波市东一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)，保藏号为FERM P-14690。之后其于1995年9月29日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，保藏号为FERM BP-5252(美国专利N0.5，827，698)。WC196 Δ cadA Δ IdcC菌株自身也是一个示例性L-赖氨酸生产细菌。WC196 Δ cadA Δ IdcC被命名为AJl 10692，于2008年10月7日保藏在通商产业省工业技术院生命工学技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心)(地址日本茨城县筑波市东一丁目1-1，筑波中央第6,305-8566))，作为国际保藏，保藏号为FERM BP-11027。
[0120]质粒PCABD2含有一个来自大肠杆菌的突变dapA基因，其编码二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)并具有一个用于对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱敏的突变，一个来自大肠杆菌的突变IysC基因，其编码天冬氨酸激酶III并具有一个用于对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱敏的突变，一个来自大肠杆菌的dapB基因，其编码二氢吡啶二羧酸还原酶，和来自乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium Iactofermentum)的ddh基因，其编码二氨基庚二酸脱氢酶。
[0121]L-半胱氨酸生产细菌
[0122]用于衍生L-半胱氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌JM15，其用编码抗反馈抑制的丝氨酸转乙酰基酶的不同cysE等位基因转化而得(美国专利N0.6，218，168，俄罗斯专利申请2003121601);大肠杆菌W3110，其过表达编码适合于分泌对细胞有毒物质的蛋白的基因(美国专利N0.5，972，663);具有低活性半胱氨酸脱巯基酶的大肠杆菌菌株(JP11155571A2);大肠杆菌W3110，其具有活性增加的正向转录调控子，用于调控由cysB基因编码的半胱氨酸调控子(W00127307A1);等。
[0123]L-亮氨酸生产细菌
[0124]用于衍生L-亮氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如对亮氨酸耐受的大肠杆菌菌株(例如菌株57(VKPMB-7386，美国专利N0.6，124，121))或对亮氨酸类似物包括(6-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸耐受的大肠杆菌菌株(JP62-34397B和JP8-70879A);通过W096/06926中所述基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(JP8-70879A)等。
[0125]细菌可以通过增强 一种或多种参与L-亮氨酸生物合成的基因的表达加以改良。实例包括IeuABCD操纵子基因，其代表是突变的IeuA基因，该基因编码不被L-赖氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(美国专利6，403，342)。此外，细菌可以通过增强一种或多种编码将L-氨基酸分泌出细菌细胞的蛋白的基因的表达进行改良。这些基因的实例包括b2682和 b2683 基因(ygaZH 基因)(EP1239041A2)。
[0126]L-组氨酸生产细菌
[0127]用于衍生L-组氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌菌株24 (VKPM B-5945, RU2003677);大肠杆菌菌株80 (VKPMB-7270, RU2119536);大肠杆菌 NRRL B-12116 - B12121 (美国专利 N0.4，388，405);大肠杆M H-9342 (FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美国专利 N0.6，344，347);大肠杆菌H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087);大肠杆菌AI80/pFM201 (美国专利N0.6，258，554)等。
[0128]用于衍生L-组氨酸生产细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，其中一种或多种编码L-组氨酸生物合成酶的基因的表达被增强。这些基因的实例包括编码如下蛋白的基因:ATP磷酸核糖转移酶(hisG)，磷酸核糖AMP环化水解酶(hisl)，磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisIE),磷酸核糖亚胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核糖异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase) (hisA),氨基转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)，组氨醇脱氢酶(hisD)等。
[0129]已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸抑制，因此还可以通过在ATP磷酸核糖转移酶中引入对反馈抑制提供抵抗的突变来高效地增强L-组氨酸的生产能力(俄罗斯专利Nos.2003677和2119536)。[0130]具有产L-组氨酸的能力的菌株的具体实例包括大肠杆菌FERM-P5038和5048，它们中引入了携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体(JP56-005099A)，引入了用于氨基酸外排的rht基因的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，被赋予了对磺胺脒、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸、和链霉素的抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270,俄罗斯专利N0.2119536)，等。
[0131]L-谷氨酸生产细菌
[0132]用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株,例如大肠杆菌礼334访1~(:+出？1172433)。大肠杆菌VL334 (VKPM B-1641)是一种L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷菌株，在thrC和ilvA基因(美国专利N0.4，278，765)中具有突变。thrC基因的野生型等位基因通过使用在野生型大肠杆菌菌株K12(VKPM B-7)细胞上生长的噬菌体Pl进行的一般转导方法进行转移。结果，获得了 L-亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)，其能够产生 L-谷氨酸。
[0133]用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株包括，但不限于，其中一种或多种编码L-谷氨酸生物合成酶的基因的表达被增强的菌株。这些基因的实例包括编码下列酶的基因:谷氨酸脱氢酶(gdhA)，谷氨酰胺合成酶(glnA)，谷氨酸合成酶(gltAB)，异柠檬酸脱氢酶(icdA),乌头酸水合酶(acnA, acnB),柠檬酸合酶(gltA),磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc),丙酮酸羧化酶(Pyc),丙酮酸脱氢酶(aceEF, IpdA),丙酮酸激酶(pykA, pykF),磷酸烯醇丙酮酸合酶(PPsA),烯醇化酶(eno),磷酸甘油酸变位酶(pgmA, pgml),磷酸甘油酸激酶(Pgk),甘油醒3-磷酸脱氢酶(gapA),磷酸丙糖异构酶(tpiA),果糖二磷酸醒缩酶(fbp),磷酸果糖激酶(pfkA, pfkB),和葡萄糖磷酸异构酶(pgi)。
[0134]被修饰从而增强了柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的菌株实例包括在EP1078989B1，EP955368B1，和EP952221B1中公开的菌株。
[0135]用于衍生L-谷氨酸生产细菌的亲本菌株还包括如下菌株，其中催化从L-谷氨酸生物合成通路分支合成L-谷氨酸之外的化合物的酶的活性被降低或消除。这些酶的实例包括异柠檬酸裂解酶(aCeA)，？a-酮戊二酸脱氢酶(sucA)，磷酸转乙酰基酶(pta)，乙酸激酶(ack)，乙酰羟酸合酶(ilvG)，乙酰乳酸合酶(ilvl)，甲酸乙酰转移酶(Pfl)，乳酸脱氢酶(Idh)，和谷氨酸脱羧酶(gadAB)。属于埃希氏菌属且a-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的细菌以及用于获得它们的方法在美国专利Nos.5，378，616和5，573，945中有描述。具体地，这些菌株包括如下:
[0136]大肠杆菌W3110sucA::KmR
[0137]大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)
[0138]大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)
[0139]大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)
[0140]大肠杆菌W3110suCA::KmK是通过打断大肠杆菌W3110的a -酮戊二酸脱氢酶基因(下文称作“sucA基因”)获得的菌株。该菌株是a-酮戊二酸脱氢酶完全缺陷的。
[0141]L-谷氨酸生产细菌的其它实例包括属于埃希氏菌属并对天冬氨酸抗代谢物耐受的细菌。这些菌株也可以是a-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷型，并且包括例如大肠杆菌AJ13199 (FERM BP-5807)(美国专利 N0.5，908，768)，FFRM P-12379,其额外具有低 L-谷氨酸分解能力(美国专利 N0.5，393,671) ; AJ13138 (FERM BP-5565)(美国专利 N0.6，110, 714)等
[0142]L-谷氨酸生产细菌的实例包括属于泛菌属的突变菌株，其是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷型或者α-酮戊二酸脱氢酶活性降低，并可以如上所述地获得。这些菌株包括 Pantoea ananatis (Pantoea ananatis) AJl3356 (美国专利 N0.6，33I, 4I9)。Pantoeaananatis AJ13356于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心)(地址日本茨城县筑波市东一丁目1-1，筑波中央第6，305-8566)，保藏号为FERM P-16645，并且后来根据布达佩斯条约的规定于1999年I月11日根据布达佩斯条约的条款转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6615。Pantoea ananatis AJ13356 由于打断了 a KGDH-E1 亚单位基因(sucA)导致α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷。当上述菌株被分离时曾被鉴定为成团肠杆菌，并以成团肠杆菌AJ13356的名义保藏。然而，最近根据16S rRNA的核苷酸序列等，它被重新归类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356在前述保藏时是作为成团肠杆菌保藏的,但是为本专利说明书的目的，它们被作为Pantoea ananatis描述。
[0143]L-苯丙氨酸生产细菌
[0144]用于衍生L-苯丙氨酸生产细菌的亲本菌株包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197);包含突变的pheA34基因的大肠杆菌HW1089 (ATCC55371)(美国专利N0.5，354，672);大肠杆菌 MWEC101-b(KR8903681);大肠杆菌 NRRL B_12141，NRRL B-12145, NRRL B-12146和NRRL 8-12147(美国专利如.4，407，952)。另外，作为亲本菌株，可以使用大肠杆菌 K-12[W3110(tyrA)/pPHAB(FERM BP-3566)，大肠杆菌 K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659),大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)和大肠杆菌 K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]，其被命名为 AJ12604(FERM BP-3579)(EP488424B1)。而且，也可以使用属于埃希氏菌属且由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的活性增强的产L-苯丙氨酸细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
[0145]L-色氨酸生产细菌
[0146]用于衍生L-色氨酸生产细菌的亲本菌株包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌 JP4735/pMU3028 (DSM10122)和 JP6015/pMU91 (DSM10123)，其是由突变trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷型(美国专利N0.5，756，345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不被丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不被色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因(美国专利 N0.6，180, 373);大肠杆菌 AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRLB-12264)，其色氨酸酶缺陷(美国专利N0.4，371，614);大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps，其中磷酸烯醇丙酮酸生产能力增强(W09708333，美国专利N0.6，319，696)等。也可以使用属于埃希氏菌属并且yedA基因或yddG基因所编码的特定蛋白的活性提高的产色氨酸细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
[0147]用于衍生L-色氨酸生产细菌的亲本菌株的实例还包括其中一种或多种选自下组的酶的活性被增强的菌株:邻氨基苯甲酸合成酶、磷酸甘油酸脱氢酶、和色氨酸合酶。邻氨基苯甲酸合成酶和磷酸甘油酸脱氢酶均被L-色氨酸和L-丝氨酸反馈抑制，因此可以在这些酶中引入导致对该反馈抑制脱敏的突变。具有这种突变的菌株的具体实例包括大肠杆菌SV164，其包含脱敏的邻氨基苯甲酸合成酶，和通过向大肠杆菌SV164引入质粒pGH5获得的转化菌株(W094/08031)，其含有编码反馈脱敏的磷酸烯醇丙酮酸脱氢酶的突变serA基因。
[0148]用于衍生L-色氨酸生产细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，其中已引入了含有编码脱敏的邻氨基苯甲酸合成酶基因的色氨酸操纵子(JP57-71397A，JP62-244382A,美国专利N0.4，371，614)。而且，可以增强色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合成酶的基因的表达，来赋予生产L-色氨酸的能力。色氨酸合成酶由a和P亚基构成，其分别由trpA和trpB基因编码。此外，可以通过增强异柠檬酸裂解酶_苹果酸合酶操纵子的表达来改善生产L-色氨酸的能力(W02005/103275)。
[0149]L-脯氨酸生产细菌
[0150]用于衍生L-脯氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的细菌，例如大肠杆菌702i IvA (VKPM B-8012)，其是i IvA基因缺陷的并能够产生L-脯氨酸(EP1172433)。可以通过提高一种或多种参与L-脯氨酸生物合成的基因的表达对细菌进行改良。这些用于产L-脯氨酸的细菌的基因的实例包括proB基因，其编码对L-脯氨酸的反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶(DE专利3127361)。此外，可以通过提高一种或多种编码将L-氨基酸从细菌细胞外泌的蛋白的基因的表达对细胞进行改良。这些基因的实例是b2682和 b2683 基因(ygaZH 基因)(EP1239041A2)。
[0151]属于埃希氏菌属并具有产生L-脯氨酸的能力的细菌实例包括如下大肠杆菌菌株:NRRL B-12403 和 NRRL B-12404 (GB 专利 2075056)，VKPM B-8012 (俄罗斯专利申请2000124295),在 DE 专利 312 7361 中描述的质粒突变体，在 Bloom F.R.等(The15th Miamiwinter symposium, 1983,第34页)中描述的质粒突变体，等。
[0152]L-精氨酸生产细菌
[0153]用于衍生L-精氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的细菌，例如大肠杆菌菌株237 (VKPM B-7925)(美国专利申请2002/058315A1)及其带有突变N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄罗斯专利申请N0.2001112869);大肠杆菌菌株382 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)，一种其中引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的精氨酸生产菌株(EP1170361A1)，等等。
[0154]用于衍生L-精氨酸生产细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，其中一种或多种编码L-精氨酸生物合成酶的基因的表达被提高。这些基因的实例包括编码如下蛋白的基因:N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)，鸟氨酸乙酰转移酶(argj)，N-乙酰谷氨酸激酶(argB),乙酰鸟氨酸转氨酶(argD),鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF),精氨琥拍酸合成酶(argG),精氨酸酶(argH),和氨甲酰磷酸合成酶(carAB)。
[0155]L-缬氨酸生产细菌
[0156]用于衍生L-缬氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，已被修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利N0.5，998，178)。最好除去ilvGMEDA操纵子中为衰减作用所需要的区域，使得操纵子的表达不会被所产生的L-缬氨酸所衰减。而且，最好打断操纵子中的ilvA基因，以降低苏氨酸脱氨酶活性。
[0157]用于衍生L-缬氨酸生产细菌的亲本菌株的实例还包括具有氨基-乙酰t-RNA合成酶突变的突变体(美国专利N0.5，658，766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，其在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日被保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms) (Russion Federation, 117545Moscow, 1st Dorozhny proezd, I),保藏号为VKPM B-4411。而且，也可以使用需要类脂酸维持生长和/或缺少H+-ATP酶的突变体作为亲本菌株(W096/06926)。
[0158]L-异亮氨酸生产细菌
[0159]用于衍生L-异亮氨酸生产细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，对6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突变体(JP5-304969A)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸和异亮氨酸轻I亏酸(isoleucine hydroxamate)有抗性的突变体，和额外具有对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸轻厢酸(arginine hydroxamate)抗性的突变体(JP5-130882A)。此外，也可以使用用编码参与L-异亮氨酸生物合成的蛋白(例如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合成酶)的基因转化的重组菌株作为亲本菌株(JP2-458A，FR0356739，和美国专利N0.5，998，178)。
[0160]2.根据本发明的方法
[0161]本发明的方法是通过在培养基中培养本发明的细菌以产生L-氨基酸并将其分泌到培养基中，和从培养基收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸的方法。
[0162]从培养基等培养、收集和纯化L-氨基酸等可以用与用细菌产生氨基酸的常规发酵方法相似的方式事实。
[0163]用于培养的培养基可以是合成的或天然培养基，只要该培养基包含细菌生长所需的碳源和氮源和矿物质，以及如果必需的话，合适量的营养物质。碳源可以包括各种碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖，和各种有机酸。根据所选择的微生物的同化模式，可以使用醇，包括乙醇和甘油。作为氮源，可以使用各种铵盐，例如氨和硫酸铵，其它氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆水解物和经过消化的发酵微生物。作为矿物质，可以使用磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、氯化钙等。作为维生素，可以使用硫胺素、酵母提取物等。
`[0164]培养可以在有氧条件下实施，例如通风振荡培养和搅拌培养，温度为20_40°C，或30-38°C。培养物的pH通常为5-9，或者6.5-7.2。培养物的pH可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱、和缓冲液进行调控。通常培养1-5天可以在液体培养基内积累靶L-氨基酸。
[0165]培养之后，可通过离心或膜过滤从液体介质中除去固体如细胞，然后可收集L-氨基酸，并通过浓缩、和/或结晶方法，和/或各种色谱方法进行纯化。
[0166]所收集的L-氨基酸组合物中除了 L-氨基酸之外，还可能含有细菌细胞、培养基组分、水分和微生物的代谢副产品。所收集的L-氨基酸的纯度可以是例如50%或更高，85%或更高，或者甚至95%或更高(美国专利N0.5，431，933，日本专利公开N0.1-214636，美国专利 Nos.4，956，471，4，777，051，4，946，654，5，840，358，6，238，714，美国专利申请公开N0.2005/0025878)。
[0167]而且，当L-氨基酸沉淀在培养基中时，可以通过离心、过滤或类似方法进行收集。沉淀在培养基中的L-氨基酸和溶解在培养基中的L-氨基酸可以在将溶解在培养基中的L-氨基酸结晶之后一起分离。
实施例[0168]通过参考下面的非限制性实施例对本发明进行更确切的说明。
[0169]实施例1:大肠杆菌 MG1655:: A tdh, rhtA*, Ptac7flhDC 菌株的构建
[0170]大肠杆菌MG1655:: Atdh，rhtA*，Ptae7flhDC菌株通过用来自Pta。启动子的启动子Ptae7替换菌株MG1655:: A tdh，rhtA*中flhDC操纵子的天然启动子区而获得(图1)。Ptae7启动子在LacI结合位点区带有C-核苷酸删除(ATG密码子上游第23位)，从而消除了Lac1-依赖性的阻遏。
[0171]为了替换flhDC操纵子的天然启动子区，将携带Ptae7启动子和由kan基因编码的卡那霉素抗性标记(KmE)的DNA片段通过Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000，97:6640-6645)所述的方法(也称“Red介导的整合”和/或“Red驱动的整合)整合到大肠杆菌MG1655:: Atdh，rhtA*菌株染色体上并代替天然的启动子区。菌株MG1655:: Atdh, rhtA*是如俄罗斯专利N0.2364628C2和W02009022754A1中详细描述的那样构建的。使用具有温度敏感性复制子的重组质粒pKD46 (Datsenko K.A.and WannerB.L.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000，97:6640-6645)作为负责 Red-介导重组系统的噬菌体入-衍生基因的供体。含有重组质粒PKD46的大肠杆菌菌株BW25113可以从耶鲁大学大肠杆菌遗传资源中心(E.Coli Genetic Stock Center, Yale University)(地址 NewHaven, USA)获得，保藏号为CGSC7630。在质粒pKD46整合到大肠杆菌MG1655:: Atdh, rhtA*菌株之后，获得了 菌株 MG1655:: A tdh, rhtA*/pKD46。
[0172]Ptac7启动子片段通过PCR获得，使用可商购的质粒pKK223-3 ( “Pharmacia”)作为模板，和引物Pl (SEQ ID NO:9)和P2(SEQ ID N0:10)。引物Pl含有与进一步与Ptae7启动子连接所需的kan基因的5’-区同源的21个核苷酸。引物P2含有与进一步整合到细菌染色体内所需的flhD基因的 5’ -区同源的40个核苷酸。此外，P2在LacI结合位点区带有C-核苷酸(ATG密码子上游第23位)删除。
[0173]含有由kan基因编码的Khik标记的DNA片段通过PCR获得，使用可商购的质粒PACYC177 (GenBank 保藏号 X06402, “Fermentas”, Lithuania)作为模板，和引物 P3 (SEQ IDNO: 11)和P4(SEQ ID N0:12)。引物P3含有与进一步整合进入细菌染色体所需的flhD基因的起始密码子上游188bp的区域同源的41个核苷酸。引物P4含有与进一步与kan基因连接所需的Ptac;7启动子的5’ -区同源的21个核苷酸。
[0174]PCR 使用 “GeneAmp PCR System2700” 热循环仪(Applied Biosystems)来进行。反应混合物总体积为50 iil，由5 ill含有25mM MgCl2的IOx PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)，200 u M 每种 dNTP, 25pmol 每种引物和 IUTaq-聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)构成。向反应混合物添加大约5ng质粒DNA作为PCR扩增的模板DNA。温度曲线如下:最初在95°C变性5min，随后25个如下的循环:95°C变性30秒，54 °C退火30秒，和72°C延伸20秒(对启动子Ptae7)或50秒(对kan基因)；最终在72° C延伸5min。然后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，用“GenElute SpinColumns” ( “Sigma”，USA)提取,并用乙醇沉淀。
[0175]DNA片段通过重叠PCR获得，使用两种上述DNA片段和引物P1(SEQID NO:9)和P4(SEQ ID NO: 12)实现DNA片段重叠和扩增。通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增出的kan-Ptae7DNA 片段，用“GenElute Spin Columns”( “Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。用所得的DNA片段进行电穿孔和Red-介导的整合导入到大肠杆菌MG1655:: A tdh, rhtA*/PKD46的细菌染色体中。
[0176]将MG1655:: A tdh, rhtA*/pKD46细胞在添加有氨苄青霉素(100 y g/ml)的液体LB培养基中30° C培养过夜，然后用添加有氨苄青霉素(IOOii g/ml)和L-阿拉伯糖(IOmM)的 SOB 培养基(酵母提取物，5g/l;NaCl，0.5g/l;胰蛋白胨，20g/l ;KC1，2.5mM;MgCl2, IOmM)(Datsenko K.A.and Wanner B.L., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2000, 97:6640-6645)以1:100稀释，并在30° C培养达到细菌培养物光密度00_为0.4-0.7。将来自IOml细菌培养物的经培养细胞用冰冷的去离子水清洗3次，随后悬浮在100 ill水中。向细胞悬浮物中添加10 u I溶解在去离子水中的DNA片段(IOOng)。用“Bio-Rad”电穿孔仪(USA)(N0.165-2098，version2_89)根据制造商的说明进行电穿孔。
[0177]向 Iml SOC 培养基(Sambrook et al, “Molecular Cloning A LaboratoryManual, 2nd ed.，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))中加入经热激的细胞，在37°C温育2小时,然后涂布到含有20 u g/ml卡那霉素的L-琼脂上。 [0178]对于24h内长出的克隆，用引物P5(SEQ ID NO: 13)和P6 (SEQ ID N0:14)进行PCR，来测试其中替换flhDC操纵子的天然启动子区的KmK标记的存在。为此目的，将新鲜分离的克隆悬浮在20 Ul水中，然后使用I U I所得悬液用于PCR。温度曲线如下:最初在95°C进行DNA变性5min，随后30个如下的循环:95°C变性30秒，55°C退火30秒，和72 °C延伸1.5min ;和最终在72° C延伸5min。测试的少数KmK克隆含有期望的1460bp DNA片段，验证了替换flhDC操纵子的天然840bp启动子区的Khik标记DNA的存在(图1)。对所得菌株中的一个通过在37°C下培养脱除热敏感质粒PKD46，得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655:: A tdh, rhtA*, Ptac7flhDC。
[0179]实施例2:通过大肠杆菌MG1655:: A tdh, rhtA*, Ptac7flhDC菌株生产L-苏氨酸
[0180]用质粒pVIC40 (W09004636A1,美国专利N0.5，705，371)分别转化亲本菌株MG1655:: Atdh, rhtA* 和 MG1655:: Atdh, rhtA*, Ptac7f lhDC。将所得菌株在营养肉汤中 37°C培养18个小时，然后将0.1ml的每种所得培养物接种在置于20x200mm试管内的2ml发酵培养基中，并在旋转振荡器上37°C培养24和48小时。
[0181]发酵培养基中含有(g/1):
[0182]
葡萄糖40
NaCI0,8
(NH4)2SO422
K2HPO42.0
MgSO4-TH2O0.8
MnS04-5H200.02
[0183]
【权利要求】
1.一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养细菌，其中所述细菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)并且能够产生L-氨基酸,并从所述培养基收集L-氨基酸,其中该细菌已经过修饰而增强了鞭毛形成和运动性级联的至少一种基因的表达。
2.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种基因选自下组:fIhDC操纵子基因、yhjH基因和fliZ基因，以及其组合。
3.根据权利要求2的方法，其中所述基因的表达是通过修饰所述基因的表达控制区而增强的。
4.根据权利要求2的方法，其中所述基因的表达是通过增加所述基因的拷贝数而增强的。
5.根据权利要求1的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。
6.根据权利要求5的方法,其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)。
7.根据权利要求1的方法，其中所述细菌属于肠杆菌属(Enterobacter)。
8.根据权利要求1的方法，其中所述细菌属于泛菌属(Pantoea)。
9.根据权利要求2的方法，其中所述flhD基因编码选自下组的蛋白: (A)包含SEQID N0:2所示的氨基酸序列的蛋白； (B)包含SEQID N0:2所示的氨基酸序列，但其中有一个或数个氨基酸残基进行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根据氨基酸序列SEQ ID N0:2的DNA结合性转录双调控子活性；和 (C)上述的组合。
10.根据权利要求2的方法，其中所述flhC基因编码选自下组的蛋白: (D)包含SEQID N0:4所示的氨基酸序列的蛋白； (E)包含SEQID N0:4所示的氨基酸序列，但其中有一个或数个氨基酸残基进行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根据氨基酸序列SEQ ID N0:4的DNA结合性转录双调控子活性；和 (F)上述的组合。
11.根据权利要求2的方法，其中所述yhjH基因编码选自下组的蛋白: (G)包含SEQID N0:6所示的氨基酸序列的蛋白；和 (H)包含SEQID N0:6所示的氨基酸序列，但其中有一个或数个氨基酸残基进行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根据氨基酸序列SEQ ID N0:6的环-二 -GMP磷酸二酯酶活性；和 (I)上述的组合。
12.根据权利要求2的方法，其中所述fliZ基因编码选自下组的蛋白: (J)包含SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的蛋白；和 (K)包含SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列，但其中有一个或数个氨基酸残基进行了取代、缺失、插入、添加或倒位的蛋白，并且所述蛋白具有根据氨基酸序列SEQ ID N0:8的调控子活性；和 (L) 上述的组合。
13.根据权利要求1的方法，其中所述L-氨基酸是芳香族L-氨基酸。
14.根据权利要求13的方法，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
15.根据权利要求1的方法，其中所述L-氨基酸是非芳香族L-氨基酸。
16.根据权利要求15的方法，其中所述非芳香族L-氨基酸是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和甘氨酸。
17.根据权利要求1或13的方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
18.根据权利要求1或15`的方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸。
【文档编号】C12P13/04GK103732736SQ201280040251
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年8月14日 优先权日:2011年8月18日
【发明者】I.B.阿尔特曼, T.A.亚姆珀尔斯卡娅, L.R.普迪特辛 申请人:味之素株式会社