优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应 用。
【背景技术】
[0002] 植酸（Phytate，Phyticacid,IP6)又称肌醇六憐酸脂，含有6个憐酸基团，带有丰 富的憐，是饲料中憐的重要胆存形式。植酸酶（Phytase)能够催化植酸及植酸盐水解成肌 醇与憐酸（或憐酸盐）。
[0003] 单胃动物体和水产动物体内缺乏分解植酸的植酸酶，W植酸形式存在的憐很难被 动物吸收利用而造成W下几种问题：第一，植酸在饲料中存在具有抗营养作用，植酸憐本身 难于被猪禽和水产动物自身的消化道水解利用；植酸在动物胃肠道的消化过程中会与多种 金属离子和蛋白质结合，形成不溶性的复合物，使一些消化酶的作用受到抑制，使得饲料中 的矿物元素和其他营养物质的消化利用率大大降低。第二，为了满足动物对憐的需求，必须 在饲料中添加无机憐酸盐。运样不仅大大增加了饲料生产的成本，而且大量不被动物利用 的憐直接排出体外，造成憐源的浪费及严重的环境问题。因此，饲料中添加植酸酶，不仅可 W提高动物对饲料中植酸憐的利用率，减少憐对环境的污染，还可W降低植酸憐的抗营养 作用。
[0004] 通过基因工程手段使植酸酶基因在重组菌株中高效表达是植酸酶得W大规模廉 价生产的有效途径。目前植酸酶的生产主要依靠真菌、细菌的微生物发酵。毕赤酵母是近 年来发展比较快的一个真核表达系统，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。毕赤酵 母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰W及糖基化修饰等方面有明显的优势，而且还具 有表达产量高、背景蛋白少、产物易于纯化、培养简单廉价、发酵密度高、发酵方法成熟等优 点，是生产植酸酶较为理想的表达系统。
[0005] 目前来源于Escherichiacoli,Aspergillusniger,Aspergillusfumigatus,Sel enomonasruminantium等微生物的植酸酶已经在毕赤酵母中得到高效表达。来源于大肠杆 菌的植酸酶APPA具有比活高的优点，是比较有应用潜力的植酸酶。野生的植酸酶APPA热 稳定性差，目前市场上商品化的大肠杆菌植酸酶制剂大多数都是经过优化改良的，优化改 良的植酸酶在热稳定上有了较大的提高，但是比活和生产效率的下降也令人堪忧，因此怎 样让热稳定好的植酸酶在宿主菌中得到更高效的表达是企业提高产品质量降低成本的关 注焦点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是通过对大肠杆菌来源的植酸酶衍生体PHd和表达载体进行改造， 使改造后的植酸酶在溫度的耐受性和/或表达量方面更加优良。
[0007] 本发明的目的是提供优化改良的植酸酶突变体及其基因。
[0008] 本发明的目的是提供优化改良的毕赤酵母表达载体。
[0009] 本发明的再一目的是提供包含上述突变的植酸酶基因的重组载体。
[0010] 本发明的再一目的是提供包含上述突变的植酸酶基因的重组菌株。
[0011] 本发明的再一目的是提供一种提高毕赤酵母表达植酸酶的方法。
[0012] 本发明的再一目的是提供上述植酸酶的应用。
[0013] 大肠杆菌植酸酶APPA的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示：
[0022] 大肠杆菌植酸酶衍生体PHd的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示：
[0030] 优化合成的大肠杆菌植酸酶衍生体PHd的核酸序列，如SEQIDNO. 3所示：
[0042] 本发明优选采用定点饱和突变的方法对SEQIDNO. 2所示的植酸酶进行改造，优 选地，首先在植酸酶PHd的第1(H立，第7(H立，第142化第159位和第255位进行单点饱和 突变。因此，基于SEQIDNO. 2的植酸酶突变体，在第1(H立，第7(H立，第142化第159位 和第255位中至少一个位置上具有氨基酸改变。
[0043] 在优选的实施方案中，相对于SEQIDNO. 2所示的植酸酶，新的植酸酶突变体具有 至少一个W下改变：S10F，S10M，S10N，S10Q;G70V，G70E，G70R;D142K，D142R，D41 沈；R159P， R159W，R159Y;Y255N，Y255Q，Y255D，Y255H，Y255S。在该列中，原位点为各位置编号之前的 氨基酸，突变后氨基酸为在位置编号之后提及的氨基酸。并且，任何所提及的某位置的可能 的氨基酸取代均可W与任何剩余提及位置的可能氨基酸改变进行组合。因此，本发明的植 酸酶突变体可W具有至少一个提及的单改变或所述改变集合之一。
[0044] 根据所取代的位置和氨基酸，各单独的或组合的突变可W使植酸酶突变体的酶活 提高5%到30%，或在75°C处理5分钟时的热稳定性增加2%到25%，因此，可W通过选择 相应的突变数目和突变类型，来选择对应于不同目的植酸酶突变体。
[0045] 本发明还包含分离的核酸序列，其编码上述的在单个位置或多个位置上具有所述 可能改变的本发明植酸酶之一，特别是基于SEQIDNO. 2在W下氨基酸位置上具有W下改 变的植酸酶：
[0083] 本发明也包括编码植酸酶的分离的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO. 3所示 的核酸序列具有至少98. 8%的同一性。
[0084] 本发明还包括重组表达载体，所述载体包含根据本发明的植酸酶突变体的编码核 酸序列之一。
[0085] 本发明也包括重组宿主细胞，所述宿主细胞包含根据本发明的植酸酶突变体的编 码核酸序列之一或包含根据本发明的植酸酶突变体的重组表达载体。
[0086] 本发明还采用定点饱和突变的方法对毕赤酵母表达载体（如pPICZaA)的a 信号肤（序列如SEQ ID NO. 4进行改造），pPICZ a A载体的a信号肤序列如SEQ ID NO. 4 :MRFPSIFTAV 10 LFAASSALAA 20 PVNTTT邸ET 30 AQIPAEAVIG 40 YSDLEGD抑V 50 AVLPFSNSTN 60 NGLLFINTTI 70 ASIAAKEEGV 80 SLEKREAEA 89
[0087] 优选地，基于SEQ ID NO. 4,本发明在a信号肤的第85位氨基酸进行饱和突变。
[0088] 在优选的实施方案中，a信号肤的第85位氨基酸R，被置换为W下氨基酸之一 ：K， E，V，G。
[0089] 本发明还设及上述改良的任一植酸酶突变体与上述改造的任一a信号肤的任意 组合。构建形成的运些优化改良的植酸酶重组表达载体，既包含根据本发明的植酸酶突变 体的核酸序列之一，又包含根据本发明a信号肤的核酸序列之一。
[0090] 本发明也包括重组宿主细胞，所述宿主细胞包含根据本发明的植酸酶突变体的核 酸序列之一与根据本发明的a信号肤的核酸序列之一的任意组合形成的重组表达载体。
[0091] 本发明还提供了包含上述植酸酶突变体和表达载体的重组菌株，优选重组菌株是 毕赤酵母菌株X33。
[0092] 本发明还提供了表达上述植酸酶突变体的方法，包括W下步骤：
[0093] I)用上述的改良的重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0094] 2)重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达；
[0095] 3)发酵结束后，回收并纯化所表达的植酸酶。
[0096] 具体地，将上述毕赤酵母重组表达质粒，转化到酵母宿主菌株X33中，高通量筛选 高拷贝的转化子，热稳定试验检测筛选的转化子的耐溫性，将最终筛选到的转化子，在化 的发酵罐中进行发酵，发酵过程中，每隔24h取发酵液测定ODewW及菌体湿重，取上清液进 行植酸酶活性检测。
[0097] 本发明还提供了上述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用。
[0098] 本发明利用基因工程手段对大肠杆菌来源的植酸酶衍生体和毕赤酵母表达载体 进行改良，W得到耐高溫、高酶活植酸酶的毕赤酵母生产菌，生产的植酸酶，热稳定性得到 很大的提高，在75°C水溶液中保溫5分钟，仍有75%的酶活保留，80°C和85°C水溶液中保溫 5分钟，剩余酶活分别达到30%和40%，而改造前的植酸酶在75°C水溶液中保溫5分钟，剩 余酶活不到50%，80和85度°C水溶液中保溫5分钟，剩余酶活不到10% ;将该优化改良的 植酸酶突变体添加到饲料中，经90°C高溫制粒处理，其酶活仍保留70%W上，而改造前的 植酸酶经90°C高溫制粒处理，酶活保留不足原来的50%，说明本发明的经过改良的植酸酶 在热稳定方面更优势。同时，该菌株生产植酸酶的产量也得到了大幅度的提高，其在180小 时的发酵酶活达到25400U/mU比改造前的植酸酶生产菌提高59. 8%。因此，本发明的优化 改良的植酸酶可在饲料工业中显示出巨大的应用潜力。
【附图说明】
[0099] 图1为KM植酸酶工程菌在7升发酵罐中的发酵情况。
[0100] 图2为植酸酶KM和改造前的植酸酶PHd在不同抑值环境下的相对酶活曲线图。
[010。图3为植酸酶閒1和改造前的植酸酶PHd经不同溫度处理后的相对酶活曲线图。
【具体实施方式】
[0102] 实验材料和试剂：