专利名称：使用转座子的用于转化的载体、通过该载体转化的微生物及用其生产l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用转座子基因以用于转化的载体、用所述载体转化的微生物 以及用所述微生物制备赖氨酸的方法。
背景技术：
棒状杆菌，尤其是谷氨酸棒杆菌是一种用于生产L-氨基酸的革兰氏阳性微生 物。L-氨基酸，特别是L-赖氨酸广泛用于生产动物饲料，人用药物及化妆品。该氨基 酸是通过棒状杆菌发酵产生的。L-赖氨酸的传统生产方法一般是使用这样的棒状杆菌，其具有增强的L-赖氨 酸生物合成相关基因。例如，美国专利US6,746,855记载了一种通过培养棒状杆菌属 (Corynebacterium sp.)生产L-赖氨酸的方法，所述的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)中 的赖氨酸释放载体基因IysE得到了增强，同时还导入了选自下组中的另一基因，该组基 因由编码二氢吡啶二羧酸合成酶的dapA、编码天冬氨酸激酶的lysC、编码丙酮酸羧化酶 的pyc和编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB组成。并且，美国专利6,221,636记载了一 种用重组DNA转化的棒状杆菌，其对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制基本不敏感，所 述重组DNA包含编码二氨基庚二酸盐脱羧酶和天冬氨酸激酶的DNA序列。在缺乏抗生素抗性序列的情况下增强所述的L-赖氨酸生物合成相关基因，可以 提高基因的拷贝数也可以通过突变提高酶活。迄今为止有两种提高基因拷贝数的方法。提高基因拷贝数的两种方法之一是在其内部原有基因的旁边再插入额外的基因 形成串联重复序列。另一种方法是在棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)染色体区的一个 或多个地方插入额外的基因(US7,160,711)。然而，这些方法均受限于基因插入位点，在 插入多个基因时非常困难。为克服该问题，人们试图在基因组rDNA的多拷贝区插入靶 基因。据报道，该方法比之前的方法更成功。尽管如此，由于破坏两个或更多个rDNA 拷贝会影响微生物的生长，因此该方法仍有不足。转座子也称为插入序列元件，是一种能在染色体或质粒上移动的序列。转座子 包括转座酶，转座酶具有识别特定的插入序列的活性。迄今为止，各种细菌中已有数百 种转座子被报道(TRANSPOSON-BASEDSTRATEGIES FOR MICROBIAL FUNCTIONAL GENOMICS ANDPROTEOMICS (2003) Annual Review of Genetics 37 3_29Finbarr Hayes)。
发明内容
技术问题本发明人试图利用转化载体生产一种能生产高浓度赖氨酸的菌株，所述载体可 与位点无关地插入两个或更多靶基因的拷贝而不抑制该微生物的生长。本发明人证实使 用转座子基因的用于转化的载体对插入外源基因非常有用，并最终完成了本发明。
因此，本发明的目的之一是提供一种使用转座子基因的用于转化的载体。本发明的另一目的是提供一种棒状杆菌属微生物，其通过由所述转化载体转化 而具有增强的赖氨酸生产能力。本发明的另一目的是提供一种由所述棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)培养液生 产赖氨酸的方法。技术方案为完成上述目标，本发明提供一种包含转座子基因和多克隆位点的用于转化的 载体。本发明还提供一种棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)微生物，其通过由所述用于
转化的载体转化而具有增强的赖氨酸生产能力。 本发明还提供一种由所述棒状杆菌属微生物的培养液生产赖氨酸的方法。有益效果本发明提供一种能够生产高浓度赖氨酸的棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)微生
物。其通过将天冬氨酸激酶基因(IysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、二氢吡啶二羧 酸合酶基因(dapA)和二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)连续的插入到棒状杆菌属基因 组上将转座子基因作为多拷贝存在的区域，从而提高了内源生活性，同时还将棒状杆菌 原本没有的果糖激酶基因(srk)额外地插入到转座子基因区域从而被赋予了新的活性。
根据随后描述的优选实施方式和附图，本发明所述物品、特点和优点将更加显 而易见。附图中图1是棒状杆菌染色体插入载体pDZTn的示意图。图2是棒状杆菌染色体插入载体pDZTn-lysC/asd的示意图。
图3是棒状杆菌染色体插入载体pDZTn-dapA/dapB的示意图。图4是载体pDZTn-srk的示意图。
具体实施例方式本发明提供一种包含转座子基因和多克隆位点的用于转化的载体。所述转座子基因可源自棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)。棒状杆菌属有多 个类型的转座子。例如，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032包括9个群的24种转座子(The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032genome sequence and its impact on the production of-aspartate-derivedamino acids and vitamins (2003) Journal of Biotechnology 104, 5-25JornKalinowski et al)。其中ISCgl和ISGg2分别包括4个和5个拷贝，各拷贝之间 具有至少99%的同源性。本发明转座子基因优选源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(基因库登录号 NC_003450, NCgll021)的ISCgl (序列号22)家族的成员，特别是具有序列号1和2所 示序列的转座子。所述多克隆位点是为了通过多个限制性内切酶容易被识别而人工插入的核苷酸 序列，从而方便靶基因的插入。
能够插入到所述多克隆位点的基因是aspB(编码天冬氨酸氨基转移酶的基因)， IysC (编码天冬氨酸激酶的基因)，asd(编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因)，dapA(编码二 氢吡啶二羧酸合酶的基因)，dapB(编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因)和IysA(编码二 氨基庚二酸脱羧酶的基因)，这些基因是涉及生产L-氨基酸的棒状杆菌属内源基因。另 夕卜，还可插入外源性基因srk(编码果糖激酶的基因)。优选选自aspB，IysC, asd, dapA，dapB和IysA的一种或多种基因插入到所述
多克隆位点。也可以将选自上组的内源性基因和外源性基因一起插入多克隆位点。更优 选将lysC/asd和dapA/dapB连续插入多克隆位点，或同时插入棒状杆菌属缺乏的外源srk基因。在本发明优选的实施方式中，所述lysC，asd, dapA和dapB分别具有源自 谷氨酸棒状杆菌KCCM 10770Pb(基因库登录号NC_003450，NCgl0247 0248和 NCgl 1896 1898)的如序列号17，18，19和20所示的核苷酸序列。外源基因srk可 以是具有源自厌氧性梭孢杆菌Clostridiumacetylbutyricum ATCC 824 (基因库登录号NP 347064)的如序列号21所示的核苷酸序列。本发明转化载体中插入的基因可以通过二次交换整合到棒状杆菌属 (Corynebacterium sp.)微生物的染色体中。本发明利用转座子基因的用于转化的载体不仅能扩增至少2拷贝的内源性基 因，并且由于含有复合转座子，还能通过高效交换的方式插入基因。该载体还可以用于 生产使用同一载体扩增一系列不同的基因的菌株。转座子基因是不影响微生物的生长并 有助于提高减少基因的不稳定。此外，即使缺乏特异性靶位点外源基因能够被插入，并 能一系列地制备。本发明还提供一种棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)，其通过由所述转化载体转
化从而具有增强的赖氨酸生产力。本发明中，可用所述载体转化的具有赖氨酸生产力的微生物可以是下面任意 一种棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)。例如，本发明可利用的棒状杆菌属是，谷氨 酸棒状杆菌 ATCC 13032 或热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)FERM BP-1539。另外还包括，由这两种菌株获得的产L-氨基酸株或突变株，例如谷氨酸棒状 杆菌KFCC10881，谷氨酸棒状杆菌KFCC 11001和谷氨酸棒状杆菌KCCM10770。最优 选地该微生物是谷氨酸棒状杆菌KCCM 10770P。在本发明的一个优选实施例中，本发明所述棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)可以由转化载体 pDZTn-lscC/asd，pDZTndapA/dapB 或 pDZTn-crk 转化，这三 种载体的酶切图分别如图2，3或4所示。所述转化载体可以顺次转入棒状杆菌属 (Corynebacteriumsp.) 中，也可同时转入棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)中。可通过同
源重组等本领域公知的方法将载体插入染色体中。本发明还提供一种用所述棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)培养液生产赖氨酸的方法。 培养棒状杆菌属生产赖氨酸，可以使用本领域公知的传统方法。例如，补料分 批培养或重复补料分批培养。此处使用的培养基应满足特定菌株的特定培养条件。棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)的培养基在现有技术中已有教导(例如，Manualof Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981)。可用的糖原质例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、 纤维素；油和脂如豆油、葵花籽油、蓖麻子油和椰子油；脂肪酸如软脂酸、硬脂酸和亚 麻酸；醇类如甘油和乙醇；以及有机酸如醋酸。上述物质之一或其组合物都可以使用。可用的氮源例如有机氮源蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆和 豆粉，以及无机氮源尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。上述物质之一 或其组合物都可以。这里的培养基还可进一步包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其含钠盐作为磷源。 培养基还可包括金属盐如硫酸镁或硫酸铁。另外，氨基酸、维生素及其适当的前体也可 加入培养基中。培养基或其母液可以分批或连续地加入培养液中。在培养过程中，可通 过加入氨水、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸等来调整培养液的pH值。培养过程中，可通 过加入如聚甘油脂肪酸酯的消泡剂来抑制气泡的产生。为维持需氧的条件，可向培养液 中注入氧气或含氧气体(如空气)。优选的培养温度为20-45°C，更优选25-40°C。可 以进行连续培养，直到L-氨基酸的浓度达到理想浓度，优选的培养时间是10-160小时。 L-赖氨酸释放到培养液中或位于细胞内。本发明提供的在实际应用中优选的实施方式，通过随后的实施例进行了说明。然而，应当理解，对于本发明的内容，本领域技术人员可以在本发明的精神和 范围内进行改进和提高。实施例实施例1:构建引入转座子基因的载体(pDZTn)以及用该载体插入基因的方法。在这个实施例中，用于棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)染色体插入的pDZ载体
作为为基础载体，构建引入棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)转座子基因的pDZTn载体。
构建方法如下。为获得转座子基因，从NIH基因库获得了源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的全 核酸序列转座子基因的核苷酸序列信息(NCBI登录号NC_003450，NCgI1021)，并合成 了两对引物(表1，序列号3-6)。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体DNA为模板，以序列号3_6所示的寡核苷酸 为引物，用PfuUltra 高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶进行PCR。PCR条件 如下96°C下变性30秒，58°C下退火30秒，72°C下聚合1分钟，从变性到聚合重复30 个循环。表 权利要求
1.一种用于转化的载体，其包含源自棒状杆菌菌株属微生物的转座子基因和多克隆 位点。
2.权利要求1所述的用于转化的载体，其特征在于，所述转座子基因具有分别为序列 号1和序列号2的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的用于转化的载体，其特征在于，在所述多克隆位点处插入了一个 或多个选自下组的基因，所述的组由源自棒状杆菌菌株属微生物的编码天冬氨酸激酶的 IysC基因、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的asd基因、编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因 和编码二氢吡啶二羧酸的dapB基因构成。
4.权利要求1所述的用于转化的载体，其特征在于，在所述多克隆位点额外地插入了 编码外源性果糖激酶的srk基因。
5.权利要求4所述的用于转化的载体，其特征在于，所述的srk基因源自丙酮丁醇梭 菌 ATCC 824。
6.—种具有L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，特征在于，其由权利要求1-5中任 一项所述的载体转化。
7.权利要求6所述的具有L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述转 化微生物是谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P。
8.权利要求6所述的具有L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述的 谷氨酸棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P-CJ2 (保藏号KCCM10939P)。
9.权利要求6所述的具有产L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述 插入到转化载体多克隆位点的基因通过二次交换整合到染色体上。
10.—种生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤将权利要求6-9中任一项所述的微生 物进行培养，在细胞中或培养液中产生L-赖氨酸；并从细胞中或培养液中回收赖氨酸。
全文摘要
本发明涉及一种使用转座子基因的用于转化的载体，用所述载体转化的微生物，以及用所述微生物生产赖氨酸的方法。
文档编号C12N15/64GK102027119SQ200980107004
公开日2011年4月20日 申请日期2009年4月10日 优先权日2008年4月10日
发明者崔宗秀, 张在佑, 林相曹, 金喆河 申请人:Cj第一制糖株式会社