基于Ms1基因构建的介导玉米雄性生育力的多控不育载体及其应用
【技术领域】
[0001]一般地，本发明涉及分子生物学和植物基因工程领域。具体地，本发明涉及用于恢复雄性不育玉米育性的育性恢复基因的构建体、包含所述构建体的重组载体、以及用所述构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因植物细胞和转基因玉米制备方法，且由此产生的玉米雄性不育系种子和保持系种子。
【背景技术】
[0002]杂种优势是杂合体在一种或多种性状上优于它的两个亲本的现象。例如不同品系、不同品种、甚至不同种属间进行杂交所得到的杂种一代往往比它的双亲表现更强大的生长速率和代谢功能，从而导致器官发达、体型增大、产量提高，或者表现在抗病、抗虫、抗逆力、成活力、生殖力、生存力等的提高。这是生物界普遍存在的现象。利用植物杂种优势可以显著地提高作物的产量和品质。
[0003]在作物中，存在着自花授粉作物和异花授粉作物。自花授粉是指一株植物的花粉，对同一个体的雌蕊进行授粉的现象。与此相反，一株植物的花粉给另一植株的雌蕊授粉就称作异花授粉。水稻的雄蕊和雌蕊在同一器官中，通常以自花授粉方式进行繁殖。对水稻进行杂交育种和杂种优势利用，获得雄性不育系是关键。上世纪70年代“杂交水稻之父”袁隆平等人在野外发现了雄花败育的普通野生稻，这一雄性不育系的发现，为应用“三系”(雄性不育系、保持系、恢复系)配套选育杂交水稻的成功，打开了一个突破口，从而为我国甚至世界的粮食生产做出了重大的贡献。
[0004]对于异花授粉的作物玉米，因为缺乏良好的雄性不育系，目前对其进行杂交育种和制种主要采用人工去雄或机械去雄的方法。这种方法存在诸多弊端，比如成本高、纯度不稳和易受环境影响等问题，制约了杂种优势在玉米实际生产中的应用和发展。
[0005]玉米隐性核雄性不育材料不存在去雄的问题，但由于缺乏有效的保持和繁殖技术，很难应用于实际生产当中。现代生物技术的发展为玉米隐性核雄性不育材料的利用创造了条件。本发明旨在将隐性核雄性不育材料的育性恢复基因表达盒、抑制雄配子体形成的基因表达盒、焚光蛋白标记基因表达盒和除草剂抗性基因表达盒串联起来，构建尚效的玉米多控不育遗传转化载体，导入相应的隐性核雄性不育材料中，获得玉米不育系的保持系，从而有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题，以实现高效的不育化杂交育种和杂交制种。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种基于基因的能恢复雄性不育玉米生育力的多控不育载体(构建体)及其应用的方法。
[0007]本发明所述的多控不育载体是指用于恢复雄性不育玉米生育力的遗传转化载体，其含有多个功能元件(4种不同类型表达盒的元件)，这些功能元件的组装和表达，使转化植株得以可控地(通过雄性育性、种皮颜色和除草剂抗性)用于玉米雄性不育系的繁殖和保持。
[0008]本发明所述的多控不育载体的4种不同类型表达盒元件，包含玉米雄性育性相关基因的表达盒、抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒、除草剂抗性基因表达盒和颜色标记基因表达盒。
[0009]( I)具体地，玉米雄性育性相关基因的表达盒中，从上游至下游依次包括雄性器官特异表达启动子或组成型表达启动子、育性相关基因和终止子。
[0010]进一步，上述育性相关基因即玉米基因。
[0011]上述启动子可以是雄性器官特异表达启动子5126、Msl的启动子或组成型表达的Ubiquitin 启动子。
[0012]5126启动子是玉米花药特异性启动子。
[0013]Ubiquitin启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因(maize poly ubi gene)，由Ubi基因的启动子区，5’非翻译区和第一内含子组成。
[0014](2)抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒中，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官特异启动子、抑制植物雄配子体的形成或功能的基因以及终止子。
[0015]具体地，上述花药或雄蕊器官特异启动子可以为Pg47启动子或Zml3启动子；抑制植物雄配子体的形成或功能的基因为玉米α淀粉酶基因或Dam甲基化酶基因；终止子为Ιη2-1终止子或Pin II终止子。
[0016]Pg47和Zml3都是花粉特异性启动子，Pg47启动子来自玉米花粉特异性聚半乳糖醛酸酶(Pg47)基因的 5’ 调节区(Allen 和 Lonsdale，Plant J(1993) 3:261-271)。
[0017]玉米α淀粉酶基因，可以是玉米α淀粉酶_1基因，该基因在雄性组织表达时会导致花粉粒能量来源崩溃进而花粉发育被遏制。
[0018]Dam 甲基化酶基因(Brooks et al., Nucleic Acids Res (1983) 11: 837-851)的表达产物催化对植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化。经甲基化的腺嘌呤会影响到细胞存活。
[0019]终止子为In2-1终止子(玉米In2_l基因的终止子)或Pin II终止子(马铃薯蛋白酶抑制剂 II 的终止子，An et al., Plant Cell (1989) 1: 115-122)。
[0020](3)除草剂抗性基因表达盒为35S启动子驱动Bar基因的表达盒，终止子是35S终止子。
[0021]35S启动子来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区(Franck et al.，Cell(1980)21:285-294)。
[0022](4)颜色标记基因表达盒为由Ltp2启动子、红色焚光蛋白DsRed2基因或mCherry基因以及pin II终止子依次串联构成的表达盒。
[0023]Ltp2启动子是大麦脂质转移蛋白基因的启动子，在种子的糊粉层特异表达(Kallaet al., Plant J(1994) 6: 849-860)。
[0024]上述含多基因表达盒的构建体是以来自pCambia系列载体的pCambia3301 (信息见网址:http://www.cambia.0rg/daisy/cambia)为骨架进行依次构建的。
[0025]利用本发明所述的构建体，本发明还提供了一种用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态，并能繁殖玉米雄性不育系的保持系植株的方法，其中还包括鉴定玉米保持系种子和植株的方法。
[0026]本发明提供的获得上述雄性不育系和保持系的培育方法是将恢复雄性不育玉米育性的多控不育构建体导入目的植物一玉米隐性核不育系中获得的。
[0027]上述导入目的植物的方法是通过花粉管或农杆菌导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得植株。
[0028]本发明所述的用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，包含:
Ca)提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因的纯合隐性等位基因且所述第一植株是雄性不育的；
(b)向上述第一植株中引入权利要求1所述的构建体以获得第二植株，所述第二植株只在同源染色体的其中一条染色体上含有所述构建体，即所述构建体为半合子状态。
[0029]半合子(hemizygote)指的是具有二组相同的染色体组但有一个或多个基因是单价的，只存在于一个染色体组，另一个染色体组没有与之相对应的等位基因，这种合子称为半合子。所述第二植株包含与所述第一植株相同的雄性不育基因?^的纯合隐性等位基因，当其构建体中的玉米雄性育性控制基因表达时将恢复第二植株雄性生育力；当抑制植物雄配子体的形成或功能的基因(如淀粉酶基因或细胞毒素基因)表达时，所述第二植株抑制可育雄性配子的形成或功能，从而使得在所述第二植株中只能产生不包含所述构建体的可育雄性配子，其基因型为msl'
(c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以保持并产生所述第一植株纯合隐性状态的后代。
[0030]本发明所述的用于繁殖玉米不育系的保持系植株的方法，包含:
通过权利要求21所述的第二植株自花受精，产生50%的含有所述构建体的种子(即保持系种子)；产生50%的正常不育系种子。
[0031 ] 鉴定保持系种子和植株的方法，具体为:
将所述第二植株的种子播种后，其产生的花粉作为供体(父本)，与其它正常育性植株(作为母本)杂交，所获得Fl种子全部是正常颜色种子(非荧光种子)。
[0032]将所述第二植株自交后产生的种子在荧光显微镜下观察，具有红色荧光的种子即为保持系。
[0033]种植所述第二植株自交后产生的种子，使所述种子长成待鉴定植株，用除草剂喷洒所述待鉴定植株，保持系植株与非保持系植株相比，没有植物损伤症状或具有的损伤症状程度更轻。
【附图说明】
[0034]图1所示为玉米多控不育载体pMCSOlOl和pMCS0103构建流程图
图2所示为玉米多控不育载体pMCSOlOl的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为11，336bp，其中包含4个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，雄性育性恢复基因Msl的表达盒以及颜色标记基因DsRed的表达盒。
[0035]图3所示为玉米多控不育载体pMCSOlOl的质粒图谱
图4所示为玉米多控不育载体pMCSOlOl的酶切鉴定图。M为I kb plus DNA marker ；1，2，3分别为卩]\?^0101质粒用 BglII/HindII1、KpnI 和 BamHI 进行酶切。用 Bglll/Hindlll双酶切的产物大小为12.3 kb/4.3 kb/960 bp ；KpnI酶切产物大小为9.3 kb/4.6 kb/3.6kb ；BamHI 酶切产物大小为 10.8 kb/4.2 kb/2.5 kb。
[0036]图5所示为pMCS0103的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为12，904 bp，其中包含5个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒(α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒)，雄性育性恢复基因Msl的表达盒，以及颜色标记基因DsRed的表达盒。
[0037]图6所示为玉米多控不育载体PMCS0103的质粒图谱。
[0038]图7所示为玉米多控不育载体pMCS0103的酶切鉴定图。M为I kb plus DNAmarker ; I，2，3 分别为 pMCSO 103 质粒用 Bgl II/Hindl 11、BamHI 和 KpnI 进行酶切。用 Bgl 11/HindIII双酶切的产物大小为12.3 kb/4.3 kb/1.6 kb/960 bp ;BamHI酶切产物大小为10.8kb/3.6 kb/2.5kb/2.3kb ； KpnI 酶切产物大小为 9.3kb/5.2 kb/4.6 kb。
[0039]图8所示为玉米多控不育载体PMCS0104构建流程图
图9所示为玉米多控不育载体pMCS0104的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为12，418bp，其中包含5个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Msl的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒(α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒)，以及颜色标记基因mCherry的表达盒。
[0040]图10所示为玉米多控不育载体PMCS0104的质粒图谱。
[0041]图11所示为玉米多控不育载体PMCS0104的酶切鉴定图。