一种适合rapd分析的金线莲dna提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种适合RAPD分析的金线莲DNA提取方法。
【背景技术】
[0002]DNA的提取质量是分子生物学实验的关键，直接影响后续实验的准确性和重复性。目前国内已有多种DNA提取方法，其中最为常见且使用的是CTAB法和SDS法，由于不同植物的成分和代谢产物存在较大差异，根据不同的植物特点选择最适合的提取方法十分关键。金线莲由于其含有大量的多糖和多酚类物质，但其植物蛋白含量不高。SDS方法的特点在于其去除蛋白的能力，而对于多糖、多酚的去除方面不如CTAB法。本发明基于传统的CTAB提取法进行改良，根据金线莲的植物特点，得到最适合金线莲RAPD分析的高纯度DNA。
[0003]RAPD (random amplified polymorphic DNA)随机扩增多态性 DNA，是以 PCR 为基础，以10碱基随机引物扩增基因组DNA，从而产生多态性DNA片段。由于其操作简单，成本低的特点，广泛用于植物种质资源的鉴定。由于RAro很不稳定，外界条件的变化很容易影响实验结果。因此开发一种适合RAPD的高纯度金线莲DNA提取方法尤为重要，为今后利用RAH)分子标记技术分析金线莲遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面研究提供了科学依据。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种适合金线莲植物RAPD分析的高纯度、高得率的DNA提取方法，为今后利用RAPD分子标记技术分析金线莲遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面研究提供了科学依据。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
本发明的目的可通过以下步骤来实现:
(1)取样品0.4-0.6g，加液氮研磨后，倒入2mL离心管中，加入CTAB溶液；使用前加2%β -巯基乙醇，震荡，放65°C水浴45分钟，中途每隔5分钟轻微颠倒数次，在20°C下12000转离心15min ；
(2)取上清液，加入2/3体积的氯仿:异戊醇，平躺静置5min，再在20°C下12000转离心10分钟；
(3)取上清液，加入1/3体积氯仿，平躺静置5min，在20°C下12000转离心10分钟；
(4)取上清液，加等体积-20°C预冷的异丙醇，加1/5上清液体积pH5.2、3 mol/LNaAc，在_20°C冰箱放置30min，在4°C下12000转离心15min，使DNA沉淀；
(5)去除上清液，用75%乙醇洗涤沉淀三次，用无水乙醇洗涤一次，晾干，加入25uL水使沉淀溶解；
(6)加入500uL高盐TE，离心后取上清液，重复(2)至(5)步骤；
(7)加入IuL RNase A放置在37°C水浴30min，放入_20°C冰箱备用。
[0006]所述CTAB 溶液中包含 3wt.%CTAB，pH 8.0、100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0、20mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，4wt.%PVP(K-30)。
[0007]所述的氯仿:异戊醇体积比为24:1。
[0008]所述高盐TE 中包含 100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；20 mmol/LEDTA, pH 8.0 ；1.4mol/L NaCl0
[0009]本发明的优点在于:
(I)在传统CTAB提取液中，提高PVP使用量至4%，提高盐浓度至2.0moI/L0金线莲中富含分类化合物，这些酚类化合物氧化后易与DNA共价结合，使DNA褐变，并能抑制DNA酶解反应，在DNA提取过程中加入一定量的PVP能防止植物细胞中的酚类物质氧化，而在金线莲DNA提取过程中，适当提高PVP的使用量能够有效地提高0D260/230的值，即提高DNA的纯度。经实验表明，PVP添加量在4%时0D260/230值最高，效果最好。高盐环境可以提高DNA在水中的溶解度且不破坏其结构，适当提高盐浓度有助于DNA在异丙醇中沉淀，从而提高得率，而金线莲中富含的多糖类化合物结构与DNA十分相似，不易去除，而适当提高提取液的盐浓度可以促进多糖化合物的分离，从而提高所提DNA的纯度。
[0010](2)使用氯仿:异戊醇(24:1) —方面节约了成本，一方面可减少有毒药品的使用，且不用担心迹量酚影响DNA纯度。实验结果证明，使用改良的方法后0D260/280值仍在1.7至1.9之间，说明氯仿:异戊醇(24:1)能完全去除DNA中的少量蛋白质。
[0011](3)在异丙醇沉淀 DNA 后加入 500uL 高盐 TE(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；20mmol/LEDTA，pH 8.0 ；1.4 mol/L NaCl)重沉淀，这一步虽然会减少DNA的得率，但2次沉淀能够有效地提高0D260/230值，提高所提DNA的纯度。
[0012](4)最后加入RNaseA会导致0D260/230值的下降，但这主要是由于其中甘油的影响，而甘油作为保存剂不影响后续的分子实验，无需考虑去除。有的传统方法是在沉淀前加入RNaseA,但这依然不能避免0D260/230值的降低，反而容易降解部分DNA，影响得率。使用改良后的方法提取的金线莲DNA在后续RAPD实验中，条带清晰、明亮、稳定、重复性高。
【附图说明】
[0013]图1 DNA样品的电泳检测结果。
[0014]图2 DNA样品的电泳检测结果。
[0015]图3 CTAB4法提取DNA的RAI3D扩增结果(20个不同种质资源金线莲的RAPD图谱，包括1.福建钝尖叶、2.福建红叶、3.福建红霞、4.福建大圆叶、5.福建小叶、6.福建大青杆、7.福建小圆叶、8.福建绒叶(细一线)、9.福建绒叶(粗一线)10.福建绒叶(无线)11.福建小叶变种、12.广东大黑叶、13.广东大叶A、14.广东大叶变种、15.广东大叶B、16.福建红霞小叶、17广西尖叶、18.云南品种、19.台湾品种、20.福建大红叶)。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
(I)适量样品(0.5g)，加液氮研磨后，倒入2mL离心管中，加入CTAB溶液(3%CTAB ;100mmol/L Tris-HCLpH 8.0 ；20 mmol/LEDTA，pH 8.0 ；2.0 mol/L NaCl ；4%PVP (K-30);使用前加2% β -巯基乙醇，震荡，放65°C水浴45分钟，中途每隔5分钟轻微颠倒数次，在20°C下12000 转离心 15min。
[0017](2)取上清液，加入2/3体积的氯仿:异戊醇(体积比为24:1)，平躺静置5min，再在20。。下12000转离心10分钟。
[0018](3)取上清液，加入1/3体积氯仿，平躺静置5min，在20°C下12000转离心10分钟。
[0019](4)取上清液，加等体积-20°C预冷的异丙醇，加1/5上清液体积3mol/L NaAc (pH 5.2)，在_20°C冰箱放置30min，在4°C下12000转离心15min，使DNA沉淀。
[0020](5)去除上清液，用75%乙醇洗涤沉淀三次，用无水乙醇洗涤一次，晾干，加入25uL水使沉淀溶解。
[0021](6)加入 500 uL 高盐 TE(100 mmol/L Tris-HCLpH 8.0 ；20 mmol/LEDTA,pH 8.0 ；1.4 mol/L NaCl)，重复(2)至(5)步骤。
[0022](7)加入I uL RNase A放置在37°C水浴30min。放入_20°C冰箱备用。
[0023]检测DNA质量的方法主要是电泳检测及分光光度计的检测。电泳检测结果中的条带必须达到清晰、明亮、无拖带。在分光光度计检测中，核酸在260nm处有吸收峰，0D260/280值必须在1.7至1.9之间，如所提DNA由蛋白质残留，其值将小于1.7，若DNA中有RNA残留，其值将大于1.9。0D260/230值必须大于1.8，若DNA中有多糖、多酚、酒精等杂质残留，将使0D260/230值降低。
[0024]采用本发明所述方法提取的金线莲DNA，如图1所示，经过电泳检测，得到清晰，明亮的条带。如图2所示，经微量分光广度计检测，其浓度为785.4ng/uL，0D260/280=1.84，0D260/230=1.96。如图3所示，用本发明方法提取的金线莲DNA应用于RAPD分析，所得的RAro条带清晰、整齐、稳定、无拖带现象，说明本实验建立的方法切实可行。
[0025]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种适合RAPD分析的金线莲DNA提取方法，其特征在于该方法包括下列步骤: (1)取样品0.4-0.6g，加液氮研磨后，倒入2mL离心管中，加入CTAB溶液1.5mL ;使用前加2wt.% β-巯基乙醇，震荡，放65°C水浴45分钟，中途每隔5分钟轻微颠倒数次，在20°C下12000转离心15min ； (2)取上清液，加入2/3体积的氯仿:异戊醇，平躺静置5min，再在20°C下12000转离心10分钟； (3)取上清液，加入1/3体积氯仿，平躺静置5min，在20°C下12000转离心10分钟； (4)取上清液，加等体积-20°C预冷的异丙醇，加1/5上清液体积pH5.2、3 mol/LNaAc，在_20°C冰箱放置30min，在4°C下12000转离心15min，使DNA沉淀； (5)去除上清液，用75%乙醇洗涤沉淀三次，用无水乙醇洗涤一次，晾干，加入25uL水使沉淀溶解； (6)加入500uL高盐TE，离心后取上清液，重复(2)至(5)步骤； (7)加入IuL RNase A放置在37°C水浴30min，放入_20°C冰箱备用。2.根据权利要求1所述的一种适合RAPD分析的金线莲DNA提取方法，其特征在于:所述 CTAB 溶液中含 3wt.%CTAB，pH 8.0、100 mmol/L Tris-HCLpH 8.0、20 mmol/L EDTA, 2.0mol/L NaCl，4wt.%PVP(K-30)。3.根据权利要求1所述的一种适合RAPD分析的金线莲DNA提取方法，其特征在于:所述的氯仿:异戊醇体积比为24:1。4.根据权利要求1所述的一种适合RAPD分析的金线莲DNA提取方法，其特征在于:所述高盐 TE 中含 100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；20 mmol/LEDTA, pH 8.0 ；1.4 mol/L NaCl。
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种适合RAPD分析的金线莲DNA提取方法。本发明根据金线莲的植物特点，从而得到高纯度、高得率的金线莲DNA。本发明主要包括以下4个方面优点。（1）在传统CTAB提取液中，提高PVP使用量至4%，提高盐浓度至2.0mol/L。（2）使用氯仿：异戊醇（24:1）（3）在异丙醇沉淀DNA后加入500uL高盐TE(100mmo1/L？Tris-HC1，pH8.0；20mmo1/LEDTA，pH8.0；1.4mol/L？NaCl)重沉淀。（4）最后加入RNaseA。使用本发明方法提取的金线莲DNA在后续RAPD实验中，条带清晰、明亮、稳定、重复性高。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105018467
【申请号】CN201510421526
【发明人】张重义, 王剑锴, 李明杰, 王建明, 冯法节, 张宝
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月17日