一种动物组织长片段dna的提取方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及DNA的提取领域，尤其涉及一种克服了物种和组织样品局限性的动物长片段DNA的提取方法，还涉及一种动物组织长片段DNA的提取试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]B1Nano公司推出了 Irys系统用于长链DNA的单分子成像。该系统利用单酶酶切和荧光标记对长达几百kb的单链DNA分子进行成像，利用高质量图像使基因组结构通过酶切图谱的方式展现无遗。Irys特有的超长序列读长能够轻松跨越重复片段和一些包含复杂元件的区域，在大大简化基因组组装的同时也让困扰NGS技术的拼接缺口无处遁形。
[0003]目前，国内外已有多种提取DNA的方法，如水煮法、酚抽提法、甲酰胺解聚法、盐酸胍裂解法、盐洗法等，但片段长度都不能Irys系统的要求，最近B1Nano公司推出了一种试剂盒，采用将动物组织进行研磨、处理后，作为样品进行DNA提取，此种方法可以使DNA长度达到10kb以上，但是由于研磨过程，容易破坏DNA，且此方法在物种方面及组织样品的局限性比较大，如对于一些组织，如神经组织，则不易获取DNA，限制了 Irys系统的应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是解决现有的DNA提取方法受物种及组织样品的局限性较大，从而无法有效实现动物组织长片段DNA的提取的问题。
[0005]因此，本发明提供了一种动物长片段DNA的提取方法，包括以下步骤:
[0006]I)通过酶消化法对动物组织进行消化，制得细胞悬液；
[0007]2)通过琼脂糖包埋所述细胞悬液中的细胞，制成胶块，然后在胶块中进行蛋白酶K消化及RNase酶消化；
[0008]3)将消化后清洗好的胶块进行溶胶、透析，制得长片段DNA。
[0009]在上述技术方案中，酶消化法，是通过酶消化液把已剪成小块的组织进一步松散，直接获得细胞的方法，此方法的细胞产量高，便于后续的DNA提取，同时可以避免研磨造成细胞破碎，DNA提前释放。通过将动物组织利用酶处理技术消化成细胞，可克服物种及组织样品的局限性，对于一些组织，如神经组织，通过研磨不易获取DNA，将组织消化成细胞可更好的获取DNA ;后续对细胞利用低熔点琼脂糖进行包埋处理，减少了 DNA提取过程中的机械损伤，更好的保证了 DNA的完整。利用本发明的动物组织长片段DNA的提取方法提取的DNA长度可达2MB以上，能够很好地满足Irys系统的要求。本发明中提到的“动物”是一个广泛的概念，既包括人，还包括其他动物。
[0010]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤I)中:若所述动物组织为肝组织，则通过胰酶对肝组织进行消化；若所述动物组织为非肝组织，则通过胶原酶I和胶原酶IV对非肝组织进行消化。所述非肝组织即除肝组织以外的其他动物组织，包括脑、肌肉等。
[0011]在上述技术方案中，胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。胶原酶分为多种类型，其中，胶原酶I用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。胶原酶IV包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不，它能消化多种组织。试验表明，胶原酶I和胶原酶IV结合使用，能够消化动物的多种组织，消化效果颇佳，解决了组织和酶的类别对细胞消化的限制，使得动物组织消化更为简单、便捷。肝组织消化可采用多种酶，如胰酶、胶原酶IV等，由于胰酶对肝组织消化效果较好，在此对动物肝脏组织进行消化时，优选胰酶。
[0012]作为对上述技术方案的更进一步改进，所述胰酶的消化体积百分比浓度为0.125?0.25 %，所述胶原酶I的消化浓度为0.7?1.3mg/mL，所述胶原酶IV的消化浓度为
0.3?0.7mg/mL。此处的消化体积百分比浓度为酶的最终反应体积百分比浓度，消化浓度是指酶的最终反应浓度。
[0013]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤I)为:制备动物组织匀浆；向所述组织匀浆中加入酶对组织进行消化，直至组织块变为柔软的絮状，镜检可观察到较多的分散细胞；过滤消化好的组织匀浆，离心过滤液，弃上清液，洗涤沉淀，加入缓冲液制备细胞悬液。所述缓冲液优选为PBS缓冲液。
[0014]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤I)的具体步骤如下:
[0015]al.将0.8?1.5g动物组织在已消毒的培养皿中用剪刀充分剪碎，加入0.5?
1.5mL的细胞培养液，进一步剪碎；
[0016]a2.将剪碎的组织转移到15mL的离心管中，再向培养皿中加入0.5?1.5mL的细胞培养液清洗剪刀及培养皿，并收入离心管中，用细胞培养液补充体积至原体积的4?5倍，上下颠倒混匀，制得组织匀浆；
[0017]a3.向制得的的组织匀浆中加入的胶原酶I至终浓度为0.7?1.3mg/mL及胶原酶IV至其终浓度为0.3?0.7mg/mL，若为肝组织，则仅需加入胰酶至其最终体积百分比浓度为0.125?0.25%，置于37°C温度下，水平放置1.5?3h，直至组织块变为柔软的絮状；
[0018]a4.取少量的组织消化液进行镜检，可以看到较多的分散细胞；
[0019]a5.将消化好的组织匀浆过70 μm的过滤器，同时用注射器的活塞进行轻微的研磨，过滤至培养皿中；
[0020]a6.将过滤液分装到离心管中，500g离心5?lOmin，弃上清液，将沉淀用IxPBS悬浮，洗涤，500g离心5?lOmin，重复2?3次，加入适量PBS，制得细胞悬液，待包埋。
[0021]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)为:将低熔点琼脂糖凝胶溶液与细胞悬液混合，并将制得的混合液加入成胶模具中进行凝固，制得胶块；将胶块转移至蛋白酶K消化液中，确保胶块完全浸没，45?55°C加热1.5?3h，每隔一段时间混匀一次，然后清洗胶块；将胶块转移至RNase酶消化液中，35?40°C消化I?2h，每隔一段时间混匀一次，然后清洗胶块。
[0022]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)中:所述蛋白酶K消化是在蛋白酶K消化液中进行的，所述RNase酶消化是在RNase酶消化液中进行的，所述蛋白酶K消化液由蛋白酶K与裂解缓冲液混合而成，其中，蛋白酶K的浓度为1.0?1.5mg/mL ；RNase酶消化液由RNase酶和TE缓冲液混合而成，其中，RNase酶的浓度为0.15?0.25mg/mL。
[0023]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)中:所述蛋白酶K消化的温度为50°C，消化时间为1.5?3h ;所述RNase酶消化的温度为37°C，消化时间为I?2h。
[0024]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)的具体步骤如下:
[0025]bl.将450?550 μ L质量百分比浓度为1.5?3%的低熔点琼脂糖置于65?75°C的温度下加热，直到低熔点琼脂糖完全融化，将溶解后的低熔点琼脂糖转移至40?45°C的温度下平衡至少lOmin，将细胞悬液放置在40?45°C的温度下加热至多1min ；
[0026]b2.将40?50 μ L低熔点琼脂糖快速加入到70?80 μ L的细胞悬浮液中，用枪头快速吸取90%的体积进行上下吹打，避免气泡产生，吸取细胞与胶的混合物90?100 μ L，快速添满成胶模具，接着将成胶模具置于冰上凝固，制得胶块；
[0027]b3.转移胶块到含有蛋白酶K消化液的离心管中，确保胶块完全浸没，其中，蛋白酶K消化液由150?170 μ L的浓度为20mg/mL的蛋白酶K和2.0?3.0mL裂解缓冲液混合而成，50°C加热1.5?2.5h ;
[0028]b4.弃掉蛋白酶K消化液，重复步骤b3 ；
[0029]b5.弃掉蛋白酶K消化液，用I XWashing buffer冲洗3?5次；
[0030]b6.用1mL的TE buffer快速冲洗胶块两次，放在摇床上180rpm摇晃10?20min，
重复二次；
[0031]bl.弃掉步骤b6中的TE Buffer，将管塞上的胶块用下铲子移置离心管底部，每个离心管中加入RNase酶消化液，在37°C水浴锅中消化I?2h，其中，RNase消化液由40?60 μ L的浓度为10mg/mL的RNase酶和1.5?2.5mL的TE buffer混合而成；
[0032]b8.弃掉RNase酶消化液，用I Xwashing buffer快速冲洗胶块三次，然后加入1ml I Xwashing buffer，放在摇床上180rpm摇晃15min，慢洗四次；
[0033]b9.弃