B以上，能够很好地满足Irys系统或其他酶切图谱的要求。
[0084](4)本发明的动物组织长片段DNA的提取试剂盒，配方简单、使用方便，可实现动物组织长片段DNA的快速提取。
[0085]下面通过具体实施例方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0086]实施例1
[0087]利用本发明的动物组织长片段DNA的提取方法从金龙鱼的脑组织提取DNA，具体步骤如下:
[0088](I)将Ig的脑组织在已消毒的培养皿中用剪刀充分剪碎，加入ImL的细胞培养液(90 % DMEM 培养 +10 % FBS)，进一步剪碎；
[0089](2)将剪碎的组织转移到15mL的离心管中，再向培养皿中加入ImL的细胞培养液清洗剪刀及培养皿，并收入离心管中，用细胞培养液补充离心管内液体体积至原体积的5倍，上下颠倒混匀，制得组织匀浆；
[0090](3)向步骤⑵中得到的组织匀浆中加入160 μ L的浓度为50mg/mL胶原酶I至终浓度为lmg/mL及80 μ L的浓度为50mg/mL胶原酶IV至终浓度为0.5mg/mL，若组织是肝脏组织，则仅需要加入l_2mL的0.05%的胰酶，然后将加入酶的组织匀浆置于37°C水浴或培养箱中，水平放置2h，每隔15min混匀一次，直至组织块变为柔软的絮状；
[0091](4)取少量的组织消化液利用普通相差显微镜进行镜检，可以看到较多的分散细胞；
[0092](5)将消化好的组织匀浆液过70 μ m的过滤器(Filter, Falcon)，同时用5mL注射器的活塞进行轻微的研磨，过滤至培养皿中；
[0093](6)将过滤液分装到2mL的离心管中，500g，离心5min，弃上清液；将沉淀用IxPBS悬浮，500g，离心5min ;再用IxPBS洗2次，加入适量的Ix PBS，制得细胞悬液(cellsuspens1n buffer)待包埋；
[0094](7)将凝固的低熔点琼脂糖放置70°C待熔化，将500 μ L质量百分比浓度为2%的低熔点琼脂糖置于70°C的水浴锅中1min直到琼脂糖完全融化，将溶解后的琼脂糖转移至43°C的水浴锅或恒温仪中至少lOmin，将细胞悬液放置于43°C的水浴锅或恒温仪中至多1min ；
[0095](8)将45 μ L的低熔点琼脂糖快速加入75 μ L的细胞悬浮液，用Ρ1000枪头快速吸取90%的体积进行上下吹打，避免气泡产生，用Ρ200的枪头吸取细胞与胶的混合物95 μ L，快速添满成胶模具(plug cast)，确保细胞与胶在水浴锅或恒温仪中保持43°C ;
[0096](9)将成胶模具(plug cast)放置在冰上45min，或放在冰盒中放置4°C冰箱45min，要避免胶与碎冰的接触，制得胶块；
[0097](10)转移胶块(plugs)到含有2.6mL蛋白酶K消化液的离心管中，确保胶块(plugs)完全浸没，50°C水浴2h，每隔一段时间混匀一次，其中，蛋白酶K消化液由167yL的浓度为 20mg/mL 蛋白酶 K(Qiagen Proteinase K enzyme)与 2.5mL 裂解 buffer 混合而成；
[0098](11)弃掉蛋白酶K消化液，重复步骤(10);
[0099](12)弃掉蛋白酶K消化液，用I XWashing buffer冲洗3次；
[0100](13)用1mL的TE buffer快速冲洗胶块(plugs)两次，在室温用摇床180rpm摇晃浸入1mL的TE buffer中的胶块15min，重复三次；
[0101](14)弃掉步骤(13)中的TE Buffer将管塞上的胶块(plug)用下铲子移置离心管底部，每个离心管中加2.5mL的RNase酶消化液，在37°C水浴锅中消化lh，每隔一段时间混勾一次，其中，RNase 消化液由 50 μ L 的浓度为 10mg/mL 的 RNase 酶(Qiagen RNase enzyme)和2.5mL的TE buffer混合而成；
[0102](15)弃掉RNase酶消化液，用IXwashing buffer冲洗胶块三次，每次手动摇晃10s，然后加入1mL I Xwashing buffer慢洗四次，放在摇床上180rpm摇晃15min ；
[0103](16)弃掉I Xwashing buffer，改用1mL TE buffer慢洗五次，在摇床上于180rpm 下摇晃 15min，弃掉 TE buffer ；
[0104](17)用金属小I产子取一个胶块，在干净的吸水纸(Kimwipes)上通过触碰小I产子底部除去胶块多余的液体，不要让吸水纸碰触到胶面，轻轻接触胶块的边缘；将吸好的胶块放置在1.5mL离心管中；
[0105](18)将胶块用离心机5000rpm点甩ls，有利于更好的溶胶；
[0106](19)在70°C水浴锅溶胶2min，快速将离心管转移到43°C水浴锅中5min，加入2 μ L的浓度为0.2U/ μ L的琼脂糖酶(Epicentre)，用移液器快速搅拌1s保证酶混匀于琼脂糖中，在43°C水浴锅中45min，保证温差小于3°C ;
[0107](20)将15mL TE Buffer加入到6cm的培养皿中，用镊子将0.1 μπι透析膜放置在TE Buffer表面，盖盖静止润湿lOmin，用宽口枪头混匀DNA，将DNA全部点在膜上，不要点在膜边缘，每张膜可点2?3个DNA，将培养皿盖上盖子，在室温静止2.5h ；
[0108](21)用宽口枪头转移DNA到1.5mL离心管中，用枪头(USAScientific，#1111-1810)轻轻的吹打最多9次至DNA混匀，4°C保存备用。
[0109]接着，利用提取的金龙鱼DNA进行脉冲场凝胶电泳试验，步骤如下:
[0110](I)用150mL 0.5XTBE缓冲液制备一个1%琼脂糖凝胶。
[0111](2)胶凝后，小心移去样品梳，将样品跟loading buffer混合，慢慢注入加样孔中。
[0112](3)把胶放入电泳槽中，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14°C冷却。
[0113](4)将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速(5?10mL/rain)或打开变速泵至70。
[0114](5)调整电泳参数。大于50kb限制性片段在35s Initial switch time和90sFinal switch time的电脉冲下得以分离，时间20h。
[0115](6)在0.5 μ g/mL的溴化乙锭中进行染色并拍照。
[0116]通过得到的脉冲场凝胶电泳图(如图1所示)，上述步骤得到的DNA长度可达2MB，效果良好。
[0117]比较例I
[0118]利用研磨方法从金龙鱼的脑组织提取DNA，具体步骤如下:
[0119](I)称取40mg组织迅速转移到遇冷的研钵中。
[0120](2)快速加入遇冷的2mL MB buffer，研杵上下研20次，不能旋转，避免气泡产生。
[0121](3)冰浴5min，使未匀碎的组织下沉，将每500 μ L上清转移至1.5mL离心管中。
[0122](4)加入等体积无水乙醇，颠倒混匀5次，冰浴60min，中间摇匀一次。
[0123](5) 1500g，4°C离心 7min，弃上清。
[0124](6)加入ImL的MB buffer重悬细胞，1500g，4°C离心7min，弃上清。
[0125](7)重复(6) —次。
[0126](8)每 5mg 组织用 125 μ L MB buffer 重悬，室温放置 15min。
[0127](9)将凝固的低熔点琼脂糖放置70°C待熔化，将500 μ L 2%的低熔点琼脂糖置于70°C的水浴锅中1min直到琼脂糖完全融化，将溶解后的琼脂糖转移至43°C的水浴锅或恒温仪中至少lOmin，将细胞悬浮液放置43°C的水浴锅或恒温仪中至多lOmin。
[0128](10)将45 yL的2%琼脂糖快速加入75 μ L的细胞悬浮液，用P1000枪头快速吸取90%的体积进行上下吹打，避免气泡产生，用Ρ200的枪头吸取细胞与胶的混合物95 μ L，快速添满成胶模具(plug cast)，确保细胞与胶在水浴锅或恒温仪中保持43°C。
[0129](11)将成胶模具(plug cast)放置在冰上45min，或放在冰盒中放置4°C冰箱45min，要避免胶与碎冰的接触，制得胶块。
[0130](12)转移胶块(plugs)到含有2.6mL蛋白酶K消化液的离心管中，确保胶块(plugs)完全浸没。50°C水浴