一种肌苷生产菌的复合诱变方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物菌种的诱变选育技术领域，尤其涉及一种原生质体与常压室温等离子体诱变复合选育肌苷高产菌株的方法，依据此方法可以选育获得高产肌苷产率的菌株。
【背景技术】
[0002]肌苷(Inosine)又称次黄嘌呤核苷，分子式为CltlH12N4O5,分子量268.23。肌苷在医药和食品等领域有着非常重要的用途:肌苷是机体内ATP、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸的组成部分，参与机体的物质代谢和能量代谢。肌苷对细胞膜有良好的通透性，能直接进入细胞，肌苷在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，参与细胞的能量代谢和蛋白质合成，提高各种酶，特别是辅酶A与丙酮酸氧化酶的活性，从而使细胞在缺氧状态下继续进行代谢，活化肝脏功能，促进受损伤肝脏的恢复。在急、慢性肝炎、肝硬化导致肝功能异常时，肌苷可作为一辅助保肝药使用，也可用于抢救肝昏迷。在食品方面，它是食品中较好的呈味物，其含量常常作为衡量食品“新鲜度”的特征指标之一；他是食品工业中5'-肌苷酸的原料，同时也是各种调味食品(例如味精、酱油等)的营养助鲜剂。
[0003]在发酵产业化生产肌苷时，菌株容易出现性状不稳定，导致异常发酵，带来高昂成本和巨大的经济损失。为得到遗传性状稳定的高产菌株，需要对相应菌株进行诱变选育并应用于产业化生产，为生产带来稳定的经济效益。
[0004]诱变选育是常用的微生物育种方法。常规诱变育种主要采用化学诱变剂(如硫酸二乙酯、亚硝基胍等)或者物理诱变(如紫外线、X射线等)对细菌直接进行诱变处理，但由于菌体有细胞壁，一定程度上会降低菌体对诱变剂的敏感性，难以获得理想的诱变效果。而原生质体作为诱变对象，其优越性是脱去细胞壁后的原生质体，诱变剂更容易进入细菌内部结构，可以快速地作用于细胞内遗传物质，因此遗传物质发生变异的概率更大、效率更高，诱变效果会更明显。传统诱变育种方法基本是具毒性或致癌性，对人及环境均有危害。而常压室温等离子体诱变是一种与传统诱变育种方法不同的新型微生物基本组诱变技术，该技术设备简单、操作方便、不需要真空条件，等离子体射流温度低且活性粒子分布均匀，对环境及人没有危害。
【发明内容】
[0005]针对上述技术缺陷，本发明提供一种了一种设备简单、操作方便、诱变效率高的枯草芽孢杆菌诱变选育方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是:一种肌苷生产菌的复合诱变方法，它是在枯草芽孢杆菌原生质体上进行常压室温等离子体诱变。它包括以下步骤:(I)菌株活化培养；(2)菌株摇瓶液体培养；(3)菌体酶解脱壁；(4)常压室温等离子体诱变；(5)原生质体再生培养；(6) 24孔板筛选；(7)摇瓶发酵复筛。
[0007]进一步:在上述肌苷生产菌的复合诱变方法中，所述步骤(3)菌体酶解脱壁:取对数期菌液10±2mL，4000±50r/min离心10±2min，弃上清液，将菌体用SMM液洗涤2?3次后离心，弃上清液；再将菌体悬浮在5mL土 ISMM液中，然后加入5± ImL溶菌酶溶液，混匀，置于36 ± 3°C水浴保温处理30 土 2min后，4000 土 50r/min离心10 土 2min，弃上清液，用高渗SMM液洗涤2?3次除去溶菌酶，将原生质体悬浮于5± ImL SMM液中备用；SMM液配制(mol/U:蔗糖 0.5±0.05，顺丁烯二酸 0.02±0.002，MgC120.02±0.002，纯水配制，ρΗ6.5±0.2，121°C灭菌15±lmin，4±0.5°C保存备用。溶菌酶溶液配制:称取溶菌酶，溶解于SMM液中，酶浓度为100g/L，0.22μM无菌过滤器除菌，-20±l°C保存备用。对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。
[0008]所述步骤(4)常压室温等离子体诱变:将原生质体悬液用SMM液稀释至OD值为0.4-0.8，吸取10± I μ L置于载片上，常压室温等离子体诱变处理120± 10s，工作条件为:照射距离2+1_，气体流量10± lslpm，照射功率120±10W。OD是optical delnsity (光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。
[0009]所述步骤(5)原生质体再生培养取诱变后和未经诱变(对照)的原生质体用SMM液系列梯度稀释为?ο—1?10 Λ 10—1?10 _8表示稀释倍数。吸取0.1 + 0.0lmL/皿原生质体稀释液于再生固体培养基中进行再生培养，培养条件36 ± 3 °C培养20 ± 2h，前4 ± Ih转速为100± lOrpm，4_20h转速为180± lOrpm。(mL/皿表示一个培养皿所加原生质体的体积)，原生质体再生培养基配方(g/L):葡萄糖20±2，磷酸二氢钾1.5±0.2，酵母粉2±0.2，琼脂20±2，用 SMM 液来溶解配制，ρΗ7.0-7.2，121±5°C灭菌 15± Imin。
[0010]在上述肌苷生产菌的复合诱变方法中，它还包括步骤(8)传代稳定性的检测:将低温保藏的甘油种活化培养，此为第一代；从第一代斜面种用接种环挑一环菌转接到新的斜面培养，此为第二代；从第二代斜面种用接种环挑一环菌转接到新的斜面培养，此为第三代；以此类推，传至第50代，将50代菌株进行摇瓶发酵试验，并检测发酵液肌苷产率。
[0011]所述步骤(I)菌株活化培养将-72±2°C低温保藏的枯草芽孢杆菌甘油种转接到斜面培养基进行活化培养，34-37°C培养20-24h ;斜面培养基配方(g/L):蛋白胨3±0.3，牛肉膏 5±0.5，酵母膏 5±0.5，琼脂 20±2，ρΗ7.0-7.2，121±5°C灭菌 15±lmin。
[0012]所述步骤(2)菌株摇瓶液体培养:从活化培养好的斜面种，用接种环挑取一环菌苔接种到装有50±2mL种子培养基的500±20mL三角瓶中，34-37 °C，180 ± 1rpm培养16±lh，然后取1±0.1mL菌液转接入50±2mL新鲜种子培养基，34-37°C，180 ± 1rpm培养5±0.5h进入对数生长期；种子培养基配方(g/L):葡萄糖20±2，磷酸二氢钾1±0.1，酵母粉 1±0.1，尿素 2±0.2，ρΗ7.0-7.2，121±5°C灭菌 15±lmin。
[0013]所述步骤(6)24孔板筛选:将在原生质体再生培养基上生长起来的单菌落用24孔板进行初筛选。a.种子培养:每个孔装2±0.2mL种子培养基，接种I个诱变单株，34-37°〇，180±10印111培养16±111。b.发酵培养:每个孔装0.9±0.05mL发酵培养基，接种
0.1±0.01mL，37±2°C，300±10rpm培养60±2h。通过检测每个单株的肌苷产率来筛选产率高的单株进行保藏。发酵培养基配方(g/L):葡萄糖130±5，酵母粉25±2，磷酸二氢钾
2.5±0.5，硫酸铵10±1，硫酸镁1.5±0.2，蛋白胨12±1，鸟嘌呤0.1±0.01，味精20±2，ρΗ7.0-7.2，121±5°C灭菌 15±lmin。
[0014]所述步骤(J)摇瓶发酵复筛:对初筛保藏的产苷有提高的单株进行摇瓶发酵复筛。a.种子培养:500mL三角瓶装50±3mL种子培养基，温度34-37°C，往复式摇瓶振幅7±1011，转速80±5印111，培养16-2411。b.发酵培养:500mL三角瓶装20±2mL发酵液，种子接种量为10 %，温度37 ± 2°C，往复式摇床振幅7 ± 1cm，转速110 土 lOrpm，培养24 ± lh。
[0015]再进一步:在上述肌苷生产菌的复合诱变方法中，所述的肌苷产率测定方法是24孔板筛选用直测法，摇瓶发酵复筛用纸层析方法。所述的直测法是24孔板于3500±500rpm离心10± lmin，取上清液稀释2?3倍后，用多功能酶标仪检测在260± 1nm波长下的紫外吸收光值。所述的纸层析方法是发酵液于10000±500rpm离心15±2min，取上清液稀释2?3倍后，用点样针取10±1 yL点在滤纸上，层析液为正丁醇:醋酸:水=4:1:1，展开2?3后，将肌苷斑点剪下在盐酸洗脱液中水浴70±5°C恒温浸泡30±5min，260nm波长检测紫外吸收光值。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:一是脱去细胞壁后的原生质体，诱变剂更容易进入细菌内部结构，可以快速地作用于细胞内遗传物质，遗传物质发生变异的概率更大、效率更高，诱变效果会更明显；二是常压室温等离子体诱变技术设备简单、操作方便、不需要真空条件，等离子体射流温度低且活性粒子分布均匀，对环境及人没有危害:三是经过诱变后，获得肌苷产率大幅提高的诱变菌株，具有较好的遗传稳定性，产苷浓度从60g/L提高到72g/L，转化率提高了 20%，效果显著。
【具体实施方式】
[0017]实施例1:枯草芽孢杆菌原生质体的诱变选育方法
[0018](I)菌株活化培养:将_72°C低温保藏的枯草芽孢杆菌甘油种转接到斜面培养基进行活化培养，34-37°C恒温培养20-24h ;斜面培养基配方(g/L):蛋白胨3，牛肉膏5，酵母膏 5，琼脂 20，ρΗ7.0-7.2，121°C