刺参饲用复合益生菌剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种刺参饲用复合益生菌剂及其制备方法，该复合菌剂由3种芽孢杆菌菌液即枯草芽孢杆菌(DL?1)、甲基营养化芽孢杆菌(DL?2)和阿氏芽孢杆菌(DL?3)按照一定添加比例混合而成。将它们分别培养后，按照不同的配比混合后投喂刺参，结果表明：3种菌株最适添加比例为2:3:4，该配比下的复合菌可有效刺参体腔液中的免疫酶和消化酶的活性。本发明所挑选的3株菌株均为益生菌，将它们以科学的配比混合而成的复合菌剂可用于饲料添加剂使用，对刺参的免疫能力及抗应激能力可产生积极的刺激效果。CGMCC No.1125720150820CGMCC No.1125820150820CGMCC No.1125920150820
【专利说明】
刺参饲用复合益生菌剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及饲料添加剂技术，具体涉及刺参饲用复合益生菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 益生菌(Probiotics)又译为益生元或益菌素，是通过对有益微生物进行鉴定、筛 选、培养、干燥等一系列工艺制成的一种新型活菌制剂，广泛用于人类、动物和植物。因其本 身具有无毒副，无残留、安全性好等特点，因而也常作为一种较好的生长促进剂，添加至动 物饲料中，为养殖动物带来有益的影响，如促进生长、防治疾病等。近年来，随着水产养殖业 的快速发展，许多传统的抗微生物药物已不能有效防止疾病的发生，这使得益生菌制剂在 水产养殖方面得到了迅速的发展。
[0003] 益生菌在水产养殖中所发挥的作用主要包括以下几个方面:1)抑制有害微生物的 生长，消除水中过多的有害物质;2)有效调节养殖水体中的微生物群系，制衡有害微生物的 优势繁殖和发展，使其达到种群相对平衡;3)提高养殖动物的营养水平，增强其免疫力以及 对病害的抵抗能力，从而减少药物的使用，使养殖形成良性循环，进而达到健康养殖且成活 率高的目的。现今，益生菌株作为水产词料添加剂，使我们可以利用其特殊代谢能力，解决 当今饲料及养殖业的诸多难题，有效的提高了水产动物生产性能和健康水平，能够获得较 好的社会效益和经济效益。因而将其作为水产饲料添加剂十分符合可持续发展的要求，同 时也是目前饲料业发展的必然方向。
[0004] 然而，目前益生菌虽广泛应用于养殖生产，但在制备技术上存在诸多问题：1)生产 菌种来源不明，大多数企业生产用的菌种相互转接，没有经过分离选育，菌种退化严重，生 理活性降低；2)益生菌饲料所含的菌种略显单一，表现在完全替代抗生素的过程中抗病毒 效果不明显，在污染严重的水质环境中，促生长效果不理想；3)某些现今存在的复合菌种， 配伍缺乏科学依据，单一菌株，双菌株，甚至多菌株随意配比，不能说明菌株间配伍的合理 性，达不到菌株优良性状。
【发明内容】
[0005] 为了解决以上益生菌制剂存在的配伍不科学、协同效果差的问题，本发明提供了 一种配伍科学合理，益生作用更为明显的饲用复合益生菌剂，能够广泛应用于刺参养殖过 程中，并能够有效刺激刺参体内相关消化酶和免疫酶的活性，促进刺参生长的同时提高刺 参自身的免疫能力，增强其对有害菌的抵抗能力。
[0006] 本发明所述的刺参饲用复合益生菌剂是由3种益生菌分别培养后进一步制备所 得，所述的刺参饲用复合益生菌剂的制备方法，具体为:将保藏编号为CGMCC No. 11257的枯 草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No. 11258的甲基营养化芽孢杆菌 (Bacillus me thy lotrophicus)和保藏编号为CGMCC No · 11259的阿氏芽抱杆菌（Bacillus aryabhattai)分别培养后，离心收集菌体并称重，再按重量比为2:3:4的比例混合。
[0007] 进一步的，所述的刺参饲用复合益生菌剂的制备方法还包括下述步骤：
[0008] 保藏编号为CGMCC No. 11257的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的培养条件 为:采用LB液体培养基，30~35°C ;盐度为3~5%，pH为7.0~8.0;
[0009] 保藏编号为CGMCC No. 1 1 2 5 8的甲基营养化芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)的培养条件为:采用LB液体培养基，20~25°C ;盐度为3~5%，pH为7 · 0 ~8 · 0;
[0010] 保藏编号为CGMCC No. 11259的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)的培养条 件为:20~25°C ;采用LB液体培养基，最适盐度为3~5%，最适pH为7.0~8.0。
[0011] 本发明的另一方面保护利用上述方法获得的刺参饲用复合益生菌剂。
[0012] 本发明的另一方面保护上述刺参饲用复合益生菌剂在饲喂刺参中的应用。所述的 应用即，将刺参饲用复合益生菌剂按刺参体重的0.2%投喂。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] 能够将3种菌种按照合理的比例科学配伍，且菌株之间的协同性好，能够通过提高 多种酶的活性进而有效增强刺参的免疫和消化能力，降低发病率。除此之外，3种菌株经检 测均无毒性，有利于人们的身体健康和环境保护，符合现代化工业的生产标准。
【附图说明】
[0015] 图1.菌株DL-1，DL-2和DL-3对刺参免疫酶和消化酶活性的影响。
[0016] 图2复合菌株与单株菌株对刺参体内消化酶活性的影响。
[0017] 图3复合菌株与单株菌株对刺参体内免疫酶活性的影响。
【具体实施方式】
[0018] 下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。
[0019] 如无特殊说明，本申请所用培养基均由常规方法配制或由商业途径购买获得。
[0020] 本发明实施例中所使用的饵料为:海泥40% ;海藻粉40% ;鱼粉3% ;大豆蛋白3% ; 海带粉5% ;贝壳粉5%面粉4% ;，此饵料也可以更换为由商业途径购买的其他用于刺参养 殖的饲料。
[0021] 上述三种菌株均分离自辽东湾地区健康刺身养殖池塘底泥中，且已于2015年8月 20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为:北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0022] 菌株DL-1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，菌株保藏编号为CGMCC No.11257；
[0023] 菌株DL-2为甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，菌株保藏编号 为CGMCC No.11258;
[0024] 菌株DL-3为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai)，菌株保藏编号为CGMCC No.11259；
[0025] 2216E液体培养基购于青岛海博生物科技有限公司。
[0026] 实施例1
[0027] 将3株菌株分别按其最适生长条件进行培养；
[0028] 1 .DL-1菌制剂的制备方法如下：
[0029]第一步:挑取DL-1单菌落接种到2216E液体培养基中，于27°C150rpm荡培养24h; [0030]第二步：按照1:20的比例将上述活化后的菌液加入至100mL灭菌的LB液体培养基 中，置于不同温度条件下（15 °C，20 °C，25 °C，30 °C，35°C )振荡培养，摇床转速设定为150rpm， 在培养过程中每隔3h取样一次，测定菌液于660nm处的吸光值，绘制曲线分析菌体生长的特 性，确定其生长所需的最适温度。之后，采用同样的方法分别分析菌体于不同盐度条件 (3%，5%，7.5%，10%，12.5%)，以及不同？!1环境下(6,6.5,7,8,9)的生长特性，综合上述 实验结果确定菌体的最适培养条件。根据绘制的曲线分析:培养DL-1菌株的最适温度为30 ~35°C ;最适盐度为3~5%，最适pH为7.0~8.0。
[0031]选取均重为12±0.19g且长势健康的刺身40头，暂养一周后将其平均分为两组即 实验组和对照组，每组设置一组重复实验。实验组须将培养后的DL-1菌株按照每组被试刺 参总体重的0.2%配成干重为0.24g的菌液，添加至饵料中并投喂刺参，饵料的投加量为每 组被试刺参总体重的5%;对照组所投喂的饵料则不添加菌液。连续投喂7天后，分别从实验 组和对照组中随机各抽出5头刺参，反复消毒冲洗后，解剖取其体腔液及肠道，分析每组被 试刺参体内免疫酶和消化酶活性的变化。结果发现，菌株DL-1可有效刺激动物体腔液中相 关消化酶和免疫酶的活性，如实验组中刺参体内淀粉酶的活性提高了 70%，脂肪酶的活性 提高了5%，而蛋白酶的活性相对于对照组整体提高了 1.5倍;免疫酶中，酸性磷酸酶(ACP) 活性提高了 13%，碱性磷酸酶(AKP)活性提高了 35%、总超氧化物歧化酶(T-S0D)活性提高 了90%，而酸氧化酶(P0)活性提高了84%。
[0032] 2. DL-2菌制剂的制备方法如下：
[0033]第一步：挑取DL-2单菌落并接种到2216E液体培养基中，于27°C 150rpm振荡培养 24h；
[0034]第二步：按照1:20的比例将上述活化后的菌液加入至100mL灭菌的LB液体培养基 中，置于不同温度条件下（15 °C，20 °C，25 °C，30 °C，35°C )振荡培养，摇床转速设定为150rpm， 在培养过程中每隔3h取样一次，测定菌液于660nm处的吸光值，绘制曲线分析菌体生长的特 性，确定其生长所需的最适温度。之后，采用同样的方法分别分析菌体于不同盐度条件 (3%，5%，7.5%，10%，12.5%)，以及不同？!1环境下(6,6.5,7,8,9)的生长特性，综合上述 实验结果确定菌体的最适培养条件。根据绘制的曲线分析:培养DL-2菌株的最适温度为20 ~25°C ;最适盐度为3~5%，最适pH为7.0~8.0。
[0035]选取均重为12±0.19g且长势健康的刺身40头，暂养一周后将其平均分为两组即 实验组和对照组，每组设置一组重复实验。实验组须将培养后的DL-2菌株按照每组被试刺 参总体重的0.2%配成干重为0.24g的菌液，添加至饵料中并投喂刺参，饵料的投加量为每 组被试刺参总体重的5%;对照组所投喂的饵料则不添加菌液。连续投喂7天后，分别从实验 组和对照组中各随机抽出5头刺参，反复消毒冲洗后，解剖取其体腔液及肠道，分析每组被 试刺参体内免疫酶和消化酶活性的变化。结果发现，菌株DL-2可有效刺激动物体腔液中相 关消化酶和免疫酶的活性，如实验组中刺参体内淀粉酶的活性提高了 18 %，脂肪酶的活性 提高了37%，而蛋白酶的活性相对于对照组整体提高了8倍;免疫酶中，酸性磷酸酶(ACP)活 性相对于对照组提高了5倍，、碱性磷酸酶(AKP)活性提高了84.6%、总超氧化物歧化酶(Τ'- sod) 活性提高了 25 % ， 而酚氧化酶 (P0) 活性提高了 68.7 % 。
[0036] 3.DL-3制剂的制备方法如下：
[0037]第一步：挑取DL-3单菌落并接种到2216E液体培养基中，于27°C 150rpm振荡培养 24h；
[0038]第二步：按照1:20的比例将上述活化后的菌液加入至100mL灭菌的LB液体培养基 中，置于不同温度条件下（15 °C，20 °C，25 °C，30 °C，35°C )振荡培养，摇床转速设定为150rpm， 在培养过程中每隔3h取样一次，测定菌液于660nm处的吸光值，绘制曲线分析菌体生长的特 性，确定其生长所需的最适温度。之后，采用同样的方法分别分析菌体于不同盐度条件 (3%，5%，7.5%，10%，12.5%)，以及不同？!1环境下(6,6.5,7,8,9)的生长特性，综合上述 实验结果确定菌体的最适培养条件。根据绘制的曲线分析:上述DL-3菌株的培养适温为20 ~25°C ;最适盐度为3~5%，最适pH为7.0~8.0。
[0039]选取均重为12±0.19g且长势健康的刺身40头，暂养一周后将其平均分为两组即 实验组和对照组，每组设置一组重复实验。实验组须将培养后的DL-3菌株按照每组被试刺 参总体重的0.2%配成干重为0.24g的菌液，添加至饵料中并投喂刺参，饵料的投加量为每 组被试刺参总体重的5%;对照组所投喂的饵料则不添加菌液。连续投喂7天后，分别从实验 组和对照组中各随机抽出5头刺参，反复消毒冲洗后，解剖取其体腔液及肠道，分析每组被 试刺参体内免疫酶和消化酶活性的变化。结果发现，菌株DL-3可有效刺激动物体腔液中相 关消化酶和免疫酶的活性，如实验组中刺参体内脂肪酶的活性提高了 15.7%，蛋白酶的活 性提高了86%;而免疫酶中，酸性磷酸酶(ACP)活性相对于对照组提高了6倍、碱性磷酸酶 (AKP)活性提高了 79.6%、总超氧化物歧化酶(1'-500)活性提高了80%，而酚氧化酶(？0)活 性提高了 1.2倍。
[0040] 实施例2
[0041 ] 刺参的急毒性试验
[0042]将均重为12±0.19g的刺参暂养一周，选择长势优良的刺参进行试验。将上述3株 菌株分别培养后，离心收集各自菌体并准确称量干重，之后，将每种菌株均按比例分别配成 浓度为1〇11^凡、10〇11^凡、50〇11^凡、100〇11^凡和150〇11^凡的菌剂。将所配制的3个菌种不同浓 度菌液依次装入15个相同的10L玻璃缸内，每个玻璃缸内装入的菌液体积为5L，并放入5头 刺参。整个实验持续96h，期间需提供充足的氧气且不换水，投饵量仍为被试刺参总体重的 5%。分别于实验开始后的011、311、611、1211、2411、4811、7211和9611时观察并记录刺参的排脏、化 皮和死亡情况，记录死亡的刺参数量，实验结果如表1、2和3。每组实验生物学重复3次。 [0043] 表1 DL-1菌株对刺参的急性毒性试验结果
[0044]
[0045]
[0046] 表2 DL-2菌株对刺参的急性毒性试验结果
[0047]
[0048] 表3 DL-3菌株对刺参的急性毒性试验结果 [0049]
[0050]由表1、2和3可见，三株芽孢杆菌对刺参无任何毒性影响，且在试验期间，实验组和 对照组的刺参生长状况均良好，尚未出现嘴肿、化皮及死亡等症状。根据刺参急性毒性试验 结果和急性毒性试验国标中对毒性级别的规定，本发明最终确定当饲料中两株菌株的添加 浓度不超过1500mg/L时，对于刺参自身是无毒性的。
[0051 ] 实施例3
[0052] 制备混合益生菌剂
[0053]将均重为12±0.19g的刺参暂养一周，选择长势优良的刺参进行试验。将上述3株 菌株分别培养后，离心收集各自菌体并准确称量干重。实验组中，将3种菌株分别按被试刺 参总体重的0.2%投喂刺参并投饵，对照组则投饵不投菌，投饵量为被试刺身总体重的5%， 连续投喂7天，检测菌体对刺参体腔液中4种免疫酶和3种消化酶活性的影响。检测结果如图 1菌株DL-l，DL-2和DL-3对刺参免疫酶和消化酶活性的影响，通过综合平衡法，最终确定3种 菌株最适干重比为2:3:4,在此比例下，复合菌对刺参体的免疫和消化功能具有正向刺激作 用，且相对于单株菌株而言，益生效果更为显著，实验结果如图1。制备的混合益生菌剂需密 闭包装，密封保存。
[0054] 从图1A，C和E可看出，与对照组相比，单独饲喂菌株DL-1后对刺参体内ACP的活性 并明显影响；但却可有效提高ΑΚΡ、Ρ0和S0D的活性;而单独饲喂菌株DL-2或DL-3后，刺参体 腔液中的ACP、AKP、T-S0D和P0活性均大幅度提高。
[0055] 除此之外，从图IB，D和F可看出，菌株DL-1、DL-2和DL-3对刺参肠道内3种不同消化 酶的影响也不同。菌株DL-1对刺参肠道脂肪酶无明显刺激作用，但却能有效提高淀粉酶和 蛋白酶活性;菌株DL-3对刺参肠道内淀粉酶无明显刺激作用，但却能有效提高脂肪酶和蛋 白酶活性;而相比之下，菌株DL-2对3种消化酶的活性均具有正向的刺激作用，且对蛋白酶 的活性影响最大。
[0056] (4)根据刺参体腔中的各种免疫酶和消化酶的活性，进而确定3株菌株之间的最佳 配比，结果见表4。
[0057]表4三种菌株能对刺参产生正向刺激作用的最佳配比
[0058]
[0059] 从表4可看出，通过对不同种酶活性的刺激结果，最终所确定的菌株之间的最佳配 比会呈现差异，因此，在本发明中通过利用综合平衡法直观分析比较极差和K值，最终确定 了3株菌株之间的最佳组合为:A2B3C4。为了进一步检测该复合菌株对刺参的益生效果，本 发明继而分析了复合菌株对刺参体内酶活性的影响。从图2和图3可看出，与对照组和三种 单株菌株相比，对刺参投喂复合菌株后，可更为有效提高动物体内的消化酶和免疫酶的活 性，间接促进动物生长，增强其对外界不良环境的抵抗能力。
【主权项】
1. 一种刺参饲用复合益生菌剂的制备方法，其特征在于：将保藏编号为CGMCC No. 11257的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No. 11258的甲基营养 化芽抱杆菌(Bacillus methylotrophicus)和保藏编号为CGMCC No· 11259的阿氏芽抱杆菌 (Bacillus aryabhattai)分别培养后，离心收集菌体并称重，再按重量比为2:3:4的比例混 合。2. 如权利要求1所述的刺参饲用复合益生菌剂的制备方法，其特征在于： 保藏编号为CGMCC No. 11257的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的培养条件为:采 用LB液体培养基，30~35°C ;盐度为3~5 %，pH为7.0~8.0; 保藏编号为CGMCC No. 11258的甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的 培养条件为:采用LB液体培养基，20~25°C ;盐度为3~5%，pH为7.0~8.0; 保藏编号为CGMCC No.11259的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)的培养条件为： 20~25°C ;采用LB液体培养基，最适盐度为3~5%，最适pH为7.0~8.0。3. 如权利要求1所述方法获得的刺参饲用复合益生菌剂。4. 如权利要求3所述刺参饲用复合益生菌剂在饲喂刺参中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:权利要求3所述的刺参饲用复合益生菌剂 按刺参体重的0.2 %投喂。
【文档编号】C12N1/20GK105838640SQ201610057334
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年1月27日
【发明人】关晓燕, 董颖, 周遵春, 陈仲, 姜冰, 王摆, 杨爱馥, 蒋经纬, 姜北
【申请人】辽宁省海洋水产科学研究院