一株表达维生素D₃-25羟化酶的基因工程菌株的制作方法

一株表达维生素D₃-25羟化酶的基因工程菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种表达维生素D3?25羟化酶的基因工程菌株，该菌株是先将编码维生素D3?25羟化酶的基因进行克隆，并将其重组到能够稳定分泌维生素D3?25?羟化酶的毕赤酵母菌株载体中，获得维生素D3?25羟化酶毕赤酵母工程菌，然后对维生素D3?25羟化酶毕赤酵母工程菌诱导培养，分离出表达的目标产物D3?25羟化酶，最后利用该D3?25羟化酶羟化维生素D3使其转变成25?OH?D3。本发明使能够获得稳定多量维生素D3?25?羟化酶成为可能，使得后续的诱导表达以及工业扩大生产简单许多，为简化V?D3的生物转化途径探索了便捷方法，为新型食品添加剂和营养药物的研究提出一个研究思路。
【专利说明】
一株表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株
技术领域：
[0001] 本发明属于生物技术制药领域的基因工程药物，具体是一种表达维生素 D3-25羟 化酶的基因工程菌株。
【背景技术】：
[0002] 维生素 D3(V_D3)是维生素 D家族成员中最重要的成员之一，并且与人体及动物健康 紧密联系。但是维生素 D3须经过肝脏和肾脏的一系列转化，形成活性形式25-OH-D3或1，25_ (OH)2-D3才能被利用，在这个转化过程中是最关键的一步就需要D3-25-羟化酶的参与。近年 来对微生物转化V-D3的研究得到了快速的发展，但是转化率较低，所以提高活性V-D3产量的 关键就在于快速有效的得到大量的V-D3的关键代谢酶D3-25-羟化酶。传统合成25-OH-D 3的 方法是化学合成法，需要进行多步的基团保护和脱保护，然后经光照反应、开环和异构化得 至Ij25-OH-D3。此种合成方法步骤繁琐，分离纯化复杂，且回收率低，从而阻碍了活性维生素 D3无法在临床上大量使用。所以，利用生物转化法制备活性维生素 D3受到了人们的广泛重视。 为此，本申请利用生物转化法将编码维生素 D3-25羟化酶的基因克隆，重组到毕赤酵母表达 载体中，构建可表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株。

【发明内容】
：
[0003] 本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供一种表达维生素 D3-25羟化酶的 基因工程菌株。
[0004] 本发明还提供所述的一种表达维生素 D3_25羟化酶的基因工程菌株的构建方法。
[0005] 本发明采取以下技术方案：
[0006] 本发明的一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株为巴斯德毕赤酵母X33,保 藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M2015396。
[0007] 该菌株是先将编码维生素 D3-25羟化酶的基因进行克隆，并将其重组到能够稳定 分泌维生素 D3-25-轻化酶的毕赤酵母菌株的表达载体中，获得维生素 D3-25轻化酶毕赤酵母 工程菌，然后对维生素 D3-25羟化酶毕赤酵母工程菌诱导培养，分离出表达的目标产物D3- 25羟化酶，最后利用该D3-25羟化酶羟化维生素 D3使其转变成25-OH-D3。
[0008] 上述构建一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株的方法，包括如下步骤：
[0009] (1)设计合成25-轻化酶保守端碱基序列；
[0010] (2)提取动物肝脏的全基因组，扩增维生素 D3-25-羟化酶基因；
[0011] (3)将维生素 D3-25-羟化酶基因连接至PMD18-T载体上，酶切测序鉴定是否正确；
[0012] (4)将鉴定正确的维生素 D3-25-羟化酶基因导入至毕赤酵母菌株的表达载体上， 再次通过菌落PCR、酶切和测序鉴定；
[0013] (5)将重组质粒转入至毕赤酵母细胞，并用G418筛选高拷贝的转化子；
[0014] (6)用终浓度为0.5 %的甲醇对维生素 D3-25-羟化酶进行诱导表达；
[0015] (7)用West-Blot的方法检测维生素 D3-25-羟化酶表达情况。
[0016] 上述毕赤酵母菌株选用毕赤酵母X33,重组质粒为pPICZaA。
[0017] 上述维生素 D3-25羟化酶基因来源于鼠胚胎干细胞，所述维生素 D3-25羟化酶基因 本身的大小为1521bp。
[0018] 本发明的有益效果在于:本发明利用基因工程技术克隆出D3-25-羟化酶基因，并 将其构建入能够稳定分泌维生素 D3-25-羟化酶的毕赤酵母菌株中，获得基因工程菌株，对 菌株诱导培养，分离出表达的目标产物D3-25-羟化酶，利用该酶能够羟化维生素 D3使其转变 成可以利用的25-OH-D3这一生物学特性，为临床提高维生素 D3生物利用度探索了更加便捷 的途径。同时，本发明使能够获得稳定多量维生素 D3-25-羟化酶成为可能，使得后续的诱导 表达以及工业扩大生产简单许多，为简化V-D3的生物转化途径探索了便捷方法，为新型食 品添加剂和营养药物的研究提出一个研究思路。
【附图说明】：
[0019] 图1:维生素 D3-25羟化酶在培养上清和菌体表达情况的SDS-PSGE结果；
[0020]图2:维生素 D3-25羟化酶在培养上清和菌体表达情况的Western Blot结果；
[0021] 图3 :PH诱导的SDS-PSGE分析图。
【具体实施方式】：
[0022]下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0023] 一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株，是先将编码维生素 D3-25羟化酶的 基因进行克隆，并将其重组到能够稳定分泌维生素 D3-25-羟化酶的毕赤酵母菌株的表达载 体中，获得维生素 D3-25羟化酶毕赤酵母工程菌，然后对维生素 D3-25羟化酶毕赤酵母工程菌 诱导培养，分离出表达的目标产物D3-25羟化酶，最后利用该D3-25羟化酶羟化维生素 D3使其 转变成25-OH-D3。
[0024]上述一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株的构建方法，具体如下：
[0025] 一、维生素 D3-25羟化酶毕赤酵母工程菌的构建
[0026]提取动物肝脏的全基因组，扩增维生素 D3-25-羟化酶基因，并将其连接至PMD18-T 载体上，酶切测序鉴定是否正确；
[0027]将鉴定正确的基因导入至毕赤酵母表达载体上，再次通过菌落PCR、酶切和测序鉴 定；
[0028]将重组质粒转入至毕赤酵母细胞使其表达，用West-Blot的方法检测VD3-25-羟化 酶表达情况。
[0029] 1.目的基因片段的获取
[0030] 本实验中选用的菌株为毕赤酵母X33,质粒为pPICZaA，维生素 D3-25羟化酶基因来 源于鼠胚胎干细胞，维生素 D3-25羟化酶基因本身的大小为1521bp。
[0031] 为了能够使鼠维生素 D3-25羟化酶在毕赤酵母中更好的表达，本实验对维生素 D3- 25羟化酶基因做了毕赤酵母的密码子的优化。由于在做优化时，基因后面的终止密码子没 有去掉，所以又设计引物PCR进行扩增以去除终止密码子并在基因3'端加上EK酶切位点。使 用优化好的基因作为模板，通过PCR获得DNA片段，然后将目的基因插入酵母表达载体pPICZ aA分泌信号下游得到重组质粒。
[0032] 经毕赤酵母密码子优化后的D3-25羟化酶基因：
[0033] actcaggctgttaagttggcttccagagttttccacagaatccacttgccattgcagttggacgcttca
[0034] ttgggttccagaggttctgagtctgttttgagatccttgtccgacattccaggtccatccactttgtctttcttggc tgagttgttctgtaagggtggtttgtccagattgcacgagttgcaagttcatggtgctgctagatacggtccaattt ggtctggttccttcggtactttgagaactgtttacgttgctgacccaactttggttgagcagttgttgagacaagag tcccactgtccagagagatgttctttctcttcttgggctgaacacagaagaagacaccagagagcttgtggtttgtt gactgctgatggtgaagagtggcagagattgagatctttgttggctcctttgttgttgagaccacaggctgctgctg gttacgctggtactttggataacgttgttagagacttggttagaagattgagaagacagagaggtagaggttccggt ttgccaggtttggttttggatgttgctggtgagttctacaagttcggtttggagtccatcggtgctgttttgttggg ttcaagattgggttgtttggaggctgaagttccaccagacactgagactttcattcacgctgttggttccgttttcg tttctactttgttgacaatggctatgccaaactggttgcaccacttgattccaggaccatgggctagattgtgtaga gactgggatcagatgttcgctttcgctcaaagacacgttgagttgagagaaggtgaggctgctatgagaaaccaggg taagcctgaagaagatatgccatctggtcatcacttgactcactttttgttcagagaaaaggtttccgttcagtcca tcgttggaaacgttacagagttgttgttggctggtgttgacactgtttccaacactttgtcctggactttgtacgag ttgtccagacacccagacgttcaaactgctttgcactccgaaatcactgctggtactagaggttcttgtgctcatcc acatggtactgctttgtcccagttgcctttgttgaaggctgttatcaaagaggttttgagattgtacccagttgttc caggtaactccagagttccagacagagacatcagagttggtaactacgttattccacaggacactttggtttctttg tgtcactacgctacttccagagatccaactcaattcccagacccaaactccttcaacccagctagatggttgggtga aggtcctactccacatccatttgcttcattgccattcggtttcggtaagagatcctgtatcggaagaagattggctg aattggagttgcagatggctttgtctcagatcttgacacacttcgaggtttt
[0035] gccagaaccaggtgctttgccaatcaagccaatgactagaacagttttggttcctgagagatccatcaacttgcagt tcgttgacaga
[0036] (1)引物序列：
[0037] ①上游引物PKF，带有一个信号肽Kex2 signal cleavage的切割位点：
[0038] 5,ccg(保护喊基）ctcgag(Xho I)cgg(保护喊基）aaaaga(Kex2signal cleavage) actcaggctgttaagttggcttcc 3'
[0039] ②下游引物 PRIPrimer:
[0040] 5 'gc (保护碱基）tctaga(Xba I )gc (保护碱基）1:1^81^31^31^31：(3^1(酶切位点） tctgtcaacgaactgcaagttg 3'
[0041 ] (2)PCR 扩增体系：
[0042]模板 0.5 μ-L PKF 1pL PR1 Primer 1 μ!>
[0043] Taq Mix 25 μL dd H,0 22.5 aL 一 Γ Total 50 μ L
[0044] (3)PCR 扩增程序:94°C 变性，5111丨11;941€458;601€458 ;72°(：，458，共30个循环;721€ 10min〇
[0045] PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳鉴定纯度和分子量的大小。
[0046] (4)PCR产物的回收、纯化：
[0047]①柱平衡步骤向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500yL的平衡液BL，12， OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中；
[0048] ②估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混 匀；
[0049] ③将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置 211^11，12,000印111离心30-60此(3，倒掉收集管中的废液，将吸附柱082放入收集管中。吸附柱 容积为800yL，若样品体积大于800yL可分批加入；
[0050] ④向吸附柱CB2中加入600yL漂洗液PW，12,000rmp离心30-60sec，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
[0051]⑤重复操作步骤④；
[0052]⑥将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱 CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；
[0053]⑦将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50yL洗 脱缓冲液EB，室温放置2min，12，OOOrpm离心2min收集DNA溶液。洗脱液的体积不应少于30μ L，体积过少会影响回收的效率。溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12，OOOrpm离 心2min，将DNA溶液收集到离心管中。保存于-20°C备用。
[0054] 2.克隆载体的构建及鉴定
[0055] (1)对回收的质粒进行PCR，回收PCR反应产物，然后用Xho I和Xba I对回收的PCR 产物进行双酶切。琼脂糖凝胶电泳后目的基因双酶切产物，确定连接体系比例后，加入 T4DNA连接酶，4 °C反应过夜。将连接产物转化感受态DH5a，LLB+Zeoc in，平板筛选。挑选阳性 克隆，提取质粒DNA，Xho I和Xba I双酶切，PCR验证后送测序。
[0056] Xho I和Xba I双酶切反应体系： kf 50 μΙ 2 x Tango 14 科乙
[0057] 2 V Xball 4 μL. Xhoi 2 μL Total 70 μL,
[0058] (2)pPICZaA及维生素 D3-25羟化酶重组质粒的线性化
[0059] 有三种线性化酶(Sac I，Pme I和BstX I)可供选择，用软件查维生素 D3-25羟化酶 基因序列后，发现维生素 D3-25羟化酶基因中有Pme I和BstX I位点，所以选用Sac I使质粒 线性化。
[0060] 线性化反应体系如下： kf: 50 |iL Sac I: 2
[0061 ] Sac I Buffer: .8 μΙ. dd H20: 20. pL Total: 8.0 jiL
[0062] 37°C水浴2h，琼脂糖凝胶电泳（1%)检测。回收线性化的表达载体，回收方法同前 面的步骤；回收线性化质粒后，用1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇-20°C过夜沉 淀后12000rpm，10min，重悬于10μLTE缓冲液。
[0063] (3)维生素 D3-25羟化酶重组质粒转化毕赤酵母感受态细胞X33 [0064]接种毕赤酵母感受态细胞X33到YH)平板上，30°C培养2-3天。用YNB基本培养基和 含有His的补充培养液做分离纯化挑选在补充培养基生长而基本培养基不生长的单菌落划 YPD平板，4°C保存。在制作毕赤酵母感受态细胞时，从平板上挑取单菌落于5mL YH)液体培 养基，30°C，200rmp振荡过夜，即可再接种用于感受态细胞的制作。
[0065] ①接种lmL毕赤酵母于YH)培养基中30°C过夜；
[0066] ②接种〇.2mL过夜培养物于100mL YPD中，培养至0D600 = 1.3-1.5;
[0067] ③4°C，400rmp离心2min，收集菌体；
[0068] ④用100mL预冷的无菌水重悬菌体，4°C、400rmp离心2min。并且重复一次；
[0069] ⑤用20mL预冷的1M山梨醇混悬4 °C收集菌体；
[0070] ⑥用500yL山梨醇再次混悬；
[0071]⑦加入线性化的质粒到80yL的酵母悬液中放入电转杯中在冰上放置5min;
[0072] ⑧1500V，25yF，200Q电击5sc，之后迅速转移到冷的山梨醇中；
[0073]⑨从电转杯中取出转化物于15mL试管30 °C培养1 -2小时；
[0074] ⑩涂布50-200yL产物到加有博来霉素(Zeocin)Yro平板中30°C培养。
[0075] (4)PCR鉴定酵母转化子
[0076]用灭菌的牙签直接挑单菌落作为模板，混入PCR体系中，进行PCR扩增。PCR结果证 明，线性化的pPICZaA-kf确实转入到了毕赤酵母X33中，PCR得到的片段大小与目的基因理 论值相符，随机挑取的10个克隆确实为重组子。
[0077]二、维生素 D3-25羟化酶毕赤酵母工程菌的培养
[0078]毕赤酵母的常规培养使用YH)培养基，但诱导表达使用BMGY和BMMY培养基。
[0079] 1.维生素 D3-25羟化酶毕赤酵母工程菌的诱导表达实验
[0080] (1)挑选一单菌落，置于装有25ml BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250- 300rpm培养至0D600 = 2-6(~16-18h);
[0081 ] (2)室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使0D600 = 1.0左右 (约 100 ~200ml);
[0082] (3)将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30 °C/250-300rpm的摇床上继续生长；
[0083] (4)每24h向培养基中添加100 %甲醇至终浓度为0 · 5~1 · 0 % ;
[0084] (5)按时间点分别取菌液样品，取样量为lml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2 ~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般 取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h;
[0085] (6)对分泌表达，分离样品的上清液;对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样 品用液氮或干冰速冻后，于_80°C保存备用；
[0086] (7)可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
[0087] 实验过程：
[0088] 1)取KF、KSF两组不同的毕赤酵母培养上清，每支lml原液共取8支，使用100%的硫 酸铵饱和溶液冰上缓慢加入毕赤酵母培养上清中，边搅拌边加入，配比为硫酸铵终浓度为 分别为40%，50%，60%，70%的混合液；
[0089] 2)冰上沉淀混合液4h，18，000 X g离心30min，弃上清，使用50μ1 PBS重悬沉淀，加 入 10μ1 6 XProtein Loading Buffer混勾，以上样品沸水浴 10min，12000rpm离心5min; [0090] 3)取 10μ1 上清点样至 10%SDS-PAGE 胶，200V 恒压电泳 50min;
[0091 ] 4)考马斯亮蓝染液染胶，脱色，观察结果；
[0092] 5)取变性后的蛋白样品1 ΟμL点样进行SDS-PAGE电泳，胶浓度为10 %，200V恒压电 泳45min;
[0093] 6)转膜：200mA 恒流 120min;
[0094] 7)5%脱脂牛奶封闭lh;
[0095] 8)加入Anti-His Mouse Monoclonal Antibody(HT501) -抗孵育lh，抗体稀释比 例为 1:5000;
[0096] 9)TBST振荡洗涤10min，重复3次；
[0097] 10)加入Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，HRP Conjugate(HS201)-抗孵育lh，抗体稀 释比例为1:5000;
[0098] 11) TBST振荡洗涤10min，重复3次；
[0099] 12)ECL 发光液孵育 lmin;
[0100] 13)X-光片曝光30s，显影、压片。
[0101] 实验结果：
[0102] (1)如图1所示，SDS-PAGE电泳结果显示：
[0103]沉淀浓缩样品中有多条条带，其中58kD左右存在条带，符合预期目标蛋白大小，可 进行下游Western Blot实验检测。
[0104] (2)如图2所示，Western Blot结果显示：
[0105] KF组及KSF组酵母菌体对照58kD均存在His标签蛋白，但杂带较多，而浓缩上清无 目的条带，同时阳性对照蛋白强烈曝光，抗体及实验条件正常。
[0106] 实验结论：
[0107] 在本实验中同时检测培养上清和菌体，来看维生素 D3-25羟化酶的表达情况，通过 SDS-PSGE和Western Blot结果证明，以及PH诱导的SDS-PSGE分析，如图3所示，维生素 D3-25 羟化酶在培养上清中没有检测到，而是表达在菌体中。
[0108] 2.毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制
[0109] (1)各种母液的配制
[0110] 10*YNB (含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基)4°(：保存。348酵母 基础氮源培养基(无硫酸铵)+l〇〇g硫酸铵，溶于l〇〇〇ml水中，过滤除菌。
[0111] 500*B(0.02%生物素 Biotin)4°C保存保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水 中，过滤除菌。
[0112] 10*GY(10%Glycerol甘油)保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高 压灭菌或过滤除菌。
[0113] 1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0)，将lmol/L的K2HP04溶液 132ml与lmol/L的KH2P04溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾 调节pH。
[0114] (2)酵母用培养基:YPD [0115] yeast extract 1%
[0116] peptone 2%
[0117] dextrose(glucose)2%
[0118] sorbitol 1M
[0119] +agar 2%
[0120] 不管是液体YPDS培养基，还是YPDS+Zeocin培养基，都必须存放4°C条件下，有效期 1~2周。
[0121] (3)酵母诱导表达培养基:BMGY/BMMY( 1L)
[0122] l%yeast extract
[0123] 2 %peptone
[0124] lOOmM potassium phosphate,pH 6.0
[0125] 1.34%YNB
[0126] 4x l〇-5%biotin
[0127] l%glycerol or 0.5%methanol
[0128]①溶解lOg yeast extract，20g peptone在700ml水中，高压灭菌。
[0129] ②待冷却至室温后加入以下已高压过的母液：
[0130] 100ml 1M potassium phosphate buffer,pH 6.0
[0131] 100ml 1OX YNB
[0132] 2ml 500X B
[0133] 100ml 1〇X GY
[0134] ③对BMMY来说，添加总量为lOOmL的灭菌水及0.5%甲醇代替甘油。
【主权项】
1. 一株表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株，其特征在于:该菌株为巴斯德毕赤酵 母X33，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M2015396。2. 根据权利要求1所述的一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株，其特征在于:该 菌株是先将编码维生素 D3-25羟化酶的基因进行克隆，并将其重组到能够稳定分泌维生素 D3-25-羟化酶的毕赤酵母菌株载体中，获得维生素 D3-25羟化酶毕赤酵母工程菌，然后对维 生素 D3-25羟化酶毕赤酵母工程菌诱导培养，分离出表达的目标产物D3-25羟化酶，最后利用 该D 3-25羟化酶羟化维生素 D3使其转变成25-OH-D3。3. 根据权利要求2所述的一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株的构建方法，其 特征在于:包括如下步骤： (1) 设计合成25-羟化酶保守端碱基序列； (2) 提取动物肝脏的全基因组，扩增维生素 D3-25-羟化酶基因； (3) 将维生素 D3-25-羟化酶基因连接至PMD18-T载体上，酶切测序鉴定是否正确； (4) 将鉴定正确的维生素 D3-25-羟化酶基因导入至毕赤酵母菌株的表达载体上，再次通 过菌落PCR、酶切和测序鉴定； (5) 将重组质粒转入至毕赤酵母细胞，并用G418筛选高拷贝的转化子； (6) 用终浓度为0.5 %的甲醇对维生素 D3-25-羟化酶进行诱导表达； (7) 用West-Blot的方法检测维生素 D3-25-羟化酶表达情况。4. 根据权利要求3所述的一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株的构建方法，其 特征在于:所述毕赤酵母菌株选用毕赤酵母X33。5. 根据权利要求3所述的一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株的构建方法，其 特征在于:所述重组质粒为pPICZaA。6. 根据权利要求3所述的一种表达维生素 D3-25羟化酶的基因工程菌株的构建方法，其 特征在于:所述维生素 D3-25羟化酶基因来源于鼠胚胎干细胞。
【文档编号】C12N15/81GK105838631SQ201511016192
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月30日
【发明人】周学章, 高蔚丰, 朱秀春
【申请人】宁夏大学, 宁夏智弘生物科技有限公司