用于培养酵母菌细胞的种子培养基及其用图
【专利摘要】本申请涉及一种用于培养酵母菌细胞的种子培养基及其用途。本发明公开一种用于培养能够通过消耗葡萄糖以及木糖来产生乙醇的酵母菌细胞的种子培养基，其主要是由糖蜜、玉米浸液及水所构成，其中以该种子培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有范围落在1.0至6.0％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有范围落在4.0至8.0％(v/v)的浓度，且该糖蜜的浓度低于该玉米浸液的浓度。该种子培养基可被用于制备酵母菌细胞的种子培养物，而该种子培养物可被用于制备乙醇。DSM 2550820111220
【专利说明】
用于培养酵母菌细胞的种子培养基及其用途
技术领域
[0001] 本发明设及一种用于培养能够通过消耗葡萄糖W及木糖来产生乙醇的酵母菌细 胞的种子培养基（seed medium),特别是设及一种基本上是由糖蜜（molasses)、玉米浸液 (corn steep liquor) W及水所构成的种子培养基，可被用于培养酵母菌细胞，使该酵母菌 细胞于逆境环境下，能可有效利用生物质并代谢生成乙醇。
【背景技术】
[0002] 纤维素生物质（cellulosic biomass)是一种经由工业与农林业运作而可被大量 地生产的可再生能量资源（renew油Ie energy resources)。利用化学方法或生物学方法 来将纤维素生物质转换成生物质能化iomass energy)[也就是纤维素酒精（cellulosic ethanol)]已被广泛地研究与探讨。相较于化学方法，生物学方法因为对于生态环境较为友 善并且能源需求较低而特别受到重视。
[0003] 在利用纤维素生物质来生成乙醇的过程中，需先制备纤维素水解液（cellulosic hy化olysate)，该纤维素水解液除了含有还原糖（reducing sugars)外，通常还伴随有于制 备过程中因半纤维素化emicellulose)与还原糖的降解所产生的发酵抑制物[例如醋酸、 慷醒（furfural)、径甲慷醒 Oiy化oxymethyl furfural, HMF) W及酪类化合物（phenolic compounds)等]。
[0004] 先前已有许多研究掲示，通过对酿酒酵母菌进行基因修饰来提高乙醇产量的技术 手段。但是由于纤维素水解液中所含有的发酵抑制物会抑制酿酒酵母菌的生长与发酵，而 使得还原糖的利用率无法获得有效提升，甚至会被降低，进而影响乙醇的产量。例如，在 E. Casey et al. (2010), FEMS Yeast Research, 10:385-393 中，E. Casey 等人发现，在含有 葡萄糖与木糖（xylose)的YEP发酵培养基中，醋酸的存在会显著降低乙醇生产速率，且会 降低葡萄糖与木糖的消耗率，其中又W对木糖消耗的抑制作用最为显著。为解决此问题， E. Casey等人掲示醋酸的抑制作用可通过在发酵培养的期间持续地添加氨水来减低。惟此 举却会增加发酵培养基的抑值，进而增加菌体污染的风险，并且在发酵培养的期间持续地 添加碱液更会进一步提高发酵制程所需的成本。因此，发展出新的发酵技术来减低发酵抑 制物（特别是醋酸）所造成的不利影响，进而提高木糖的利用率W及提升乙醇的产量，已成 为一个重要的研发课题。 阳0化]许多食品工业的副产物由于富含许多可供微生物生长所需的营养源（nutrient source)，因而具有可供再利用的价值，已有许多文献掲示可用来培养微生物并且由之生产 有价值的产物。糖蜜（molasses)是制糖工业的一种副产物，主要含有大量的糖（包括薦糖、 葡萄糖W及果糖等）W及水，可被用来做为培养基的碳源，W及食品或饲料的添加剂。糖 蜜可依照来源而被区分为薦糖蜜（cane molasses)(总糖含量为大约48-54% )、甜菜糖蜜 化eet molasses)(总糖含量为大约48-52% )、相橘糖蜜（citrus molasses)(总糖含量为 大约40-4S% ) W及玉米糖蜜korn molasses)[又被称为淀粉糖蜜（starch molasses), 总糖含量为大约50% ]等。另外，玉米浸液（corn Ste巧liquor)则是玉米湿磨（corn wet-milling)工业的一种副产物，主要含有大约47%的蛋白质，可被用来做为培养基的氮 源。
[0006] 由于糖蜜W及玉米浸液所含有的成分可被酵母菌吸收代谢，进而可用于支持其生 长W及发酵活性，目前已有许多文献掲示，使用含有糖蜜和/或玉米浸液的培养基来进行 酵母菌的培养，可提升酵母菌细胞数的增长，进而提升发酵产物的产量。例如，在Samuel Amartey and Thomas W. Jeffries(1994), Biotechnology letters. , 16:211-214中，Samuel A.等人掲示将树干毕赤酵母菌（Pichia stipitis)CBS 6054培养于只含有30g/L的玉米浸 液的培养基中而得到一接种源，接着将该接种源接种至相同的培养基中来进行发酵反应。 结果发现，与含有复杂成分的培养基相较下，使用只含有30g/L的玉米浸液的培养基来进 行发酵反应可些微地提高树干毕赤酵母菌CBS 6054的生长速率，而少量地提高木糖利用 率W及酒精产量。
[0007] 在 Kim Y. H. et al. (2007)，J. Ind.化g. Chem.，13:153-158 中，Kim Y. H.等人为 了生产大量的P-葡聚糖（P-glucan)(它是细胞壁组成中最主要的多醋），将酿酒酵母菌 JUL3培养于由葡糖糖、酵母萃取物W及蛋白腺所构成的种子培养基（seed medium)中而得 到一接种源，接着将该接种源接种至含有不同浓度的糖蜜与玉米浸液的培养基中来进行培 养。而实验结果只掲示使用含有6.4% (v/v)的糖蜜W及17% (v/v)的玉米浸液的培养基 可增加酿酒酵母菌JUL3于培养物中的细胞质量。
[0008] 在 VU V.H. and Kim K. (2009)，J. Microbiol. Biotechnol., 19:1603-1611 中，VU V. H.等人为了提高酿酒酵母菌KV-25的培养的细胞密度，将酿酒酵母菌KV-25培养于YPD 培养基中而得到一接种源，接着将该接种源接种至含有不同浓度的糖蜜与玉米浸液的培 养基中来进行培养，结果发现：糖蜜与玉米浸液的最适化浓度分别为10.25% (v/v) W及 16. 87% (v/v)，并且使用被接种W该接种源的含有该最适化浓度的糖蜜与玉米浸液的培养 基来进行批次培养可获得36. 5g/L的细胞质量。
[0009] 然而，运些先前研究需在培养的过程中使用大量的糖蜜和/或玉米浸液而提高所 需的成本，不敷产业上的实际应用，且只掲示使用糖蜜和/或玉米浸液作为酵母菌的营养 源进行培养可提高细胞质量，并未掲示对酵母菌于纤维素水解液中的影响，更未掲示可改 善酵母菌于含有醋酸的纤维素水解液中的木糖利用量，进而提升乙醇产率。
【发明内容】
[0010] 于是，在第一个方面，本发明提供一种用于培养能够通过消耗葡萄糖W及木糖来 产生乙醇的酵母菌细胞的种子培养基，其主要是由糖蜜、玉米浸液及水所构成，其中W该种 子培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有范围落在1. 0至6. 0% (v/v)的浓度，该玉米浸 液具有范围落在4.0至8.0% (v/v)的浓度，且该糖蜜的浓度低于该玉米浸液的浓度。
[0011] 在第二个方面，本发明提供一种用于制备酵母菌细胞的种子培养物（seed culture)的方法，其包括：将酵母菌细胞，特别是能够通过消耗葡萄糖W及木糖来产生乙 醇的酵母菌细胞，培养于如上所述的种子培养基中，从而在该种子培养基中制备该酵母菌 细胞的种子培养物，供之后发酵接种用。
[0012] 在第=个方面，本发明提供一种W生物质制备乙醇的方法，其包括：
[0013] 将能够通过消耗葡萄糖W及木糖来产生乙醇的酵母菌细胞培养于如上所述的种 子培养基中，从而在该种子培养基中制备该酵母菌细胞的种子培养物；W及
[0014] 接种该种子培养物于该生物质中进行发酵；
[0015] 其中，该生物质包含葡萄糖、木糖，及醋酸。
【附图说明】
[0016] 下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所W本发明在上述W及其他目 的与特征，可通过参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显， 附图中：
[0017] 图1显示在含有醋酸的发酵培养基中进行发酵反应的情况下，不同处理条件所得 酿酒酵母菌种子培养物对发酵制程的乙醇产量影响的比较图；W及
[0018] 图2显示在含有醋酸的发酵培养基中进行发酵反应的情况下，不同处理条件所得 酿酒酵母菌种子培养物对发酵制程的乙醇产量影响的比较图。
【具体实施方式】
[0019] 纤维素生物质含有大量的纤维素、半纤维素及木质素等成分，运些成分会互相缠 绕包覆而形成复杂且坚初的网状结构，运会使得在利用纤维素生物质来生产乙醇的过程中 受到限制。因此，该纤维素生物质通常会先经过适当的前处理（pretreatment)后，再W酶 进行分解处理将之水解成还原糖（诸如葡萄糖与木糖等）。然而，纤维素生物质在经过上述 前处理后，会伴随产生发酵抑制物（例如，醋酸、慷醒W及径甲慷醒等），进而影响酵母菌发 酵产制乙醇的能力。
[0020] 为了减低作为发酵抑制物的醋酸所造成的不利影响，W提高木糖的利用率W及 乙醇的产量，
【申请人】经戮力研究结果发现，W含有糖蜜与玉米浸液的种子培养基进行种子 培养所得的可共发酵葡萄糖与木糖的酵母菌的接种用种子培养物，可有效地提升其对醋酸 的抗性，也就是经本发明技术处理所制备的该种子培养物，可于存在有醋酸的发酵条件下， 有效改善其木糖利用量，进而提升乙醇产率。
[0021] 于是，依据本发明所提出的一种用于培养能够通过消耗葡萄糖W及木糖来产生乙 醇的酵母菌细胞的种子培养基，其主要是由糖蜜、玉米浸液及水所构成，其中W该种子培养 基的总体积为计算基础，该糖蜜具有范围落在1. 0至6. 0% (v/v)的浓度，该玉米浸液具有 范围落在4.0至8.0% (v/v)的浓度，且该糖蜜的浓度低于该玉米浸液的浓度。
[0022] 如本文中所用的，术语"糖蜜"意指在精制来自于植物的糖的过程中在移去糖膏 (masse州ite)中的薦糖结晶（sucrose crystal)后所得到的残余的糖浆（syrup),并且是 本技术领域中所熟习之物。适用于本发明中的糖蜜种类没有特别限制，可包括各种商业上 可购得的产品。较佳地，该糖蜜选自于下列所构成的群组：薦糖蜜、甜菜糖蜜、相橘糖蜜、玉 米糖蜜，W及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该糖蜜是薦糖蜜。
[0023] 依据本发明，W该种子培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有范围落在3. 0至 4.0% (v/v)的浓度。在本发明的一个较佳具体例中，W该种子培养基的总体积为计算基 础，该糖蜜具有为3.0% (v/v)的浓度。
[0024] 如本文中所用的，术语"玉米浸液"意指在玉米湿磨制程中通过稀酸浸泡玉米所得 到的浸溃液的浓缩液，并且是本技术领域中熟习之物。适用于本发明的玉米浸液种类没有 特别限制，可包括各种商业上可购得的产品。
[0025] 依据本发明，W该种子培养基的总体积为计算基础，该玉米浸液具有范围落在5. 0 至7.0% (v/v)的浓度。在本发明的一个较佳具体例中，W该种子培养基的总体积为计算基 础，该玉米浸液具有为6.0% (v/v)的浓度。
[00%] 如本文中所用的，术语"水"包括，但不限于：去离子水、逆渗透水、蒸馈水W及二次 水（d地2〇)。在本发明的一个较佳具体例中，该水是去离子水。
[0027] 本发明也提供一种用于制备酵母菌细胞的种子培养物的方法，其包括：将能够通 过消耗葡萄糖W及木糖来产生乙醇的酵母菌细胞培养于如上所述的种子培养基中，从而在 该种子培养基中制备该酵母菌细胞的种子培养物。
[0028] 如此处所用的，术语"酵母菌细胞"意欲涵盖所有能够通过消耗葡萄糖W及木糖来 产生乙醇的酵母菌菌株，适用于本发明的酵母菌细胞包括，但不限于，源自于下列的细胞： 酵母菌属物种（Saccharomyces spp.)、毕赤酵母菌属物种（Pichia spp.) W及假丝酵母菌 属物种（Candida spp.)。
[00巧]依据本发明，该酵母菌细胞是重组型酿酒酵母菌（recombinant Saccharomyces cerevisiae)。较佳地，该重组型酿酒酵母菌的基因组DNA中，包括编码木糖还原酶（xylose re化ctase, XR)的基因、编码木酬糖激酶（xylulose kinase, XK)的基因，W及编码木糖醇 脱氨酶（巧Iitol dehy化Ogenase, XDH)的基因。更佳地，在该重组型酿酒酵母菌的基因组 DNA中的fpsl基因[其编码甘油信道蛋白（glycerin passage protein)] W及甜d2基因 [其编码甘油-3-憐酸脱氨酶-2 (glycerol 3-phosphate dehy化ogenase-2, GPD2)]被删 除、破坏，或失效。
[0030] 如本文中所用的，术语"删除（delete)"意指通过删除基因的全部或部分的编码区 域。
[003U 如本文中所用的，术语"破坏（disrupt)"意指在基因中进行核巧酸的删除、插入 (insertion)或突变（mutation),而使得该基因无法表达产生活性酶（active enzyme),或 使该基因表达产生具有被严重降低活性（severely re化ced activity)的酶。 阳03引如本文中所用的，术语"使失效（dis油Ie)"意指基因或其所编码的蛋白质被去活 化（inactive),进而失去原有的活性或功能。
[0033] 在本发明的一个较佳具体例中，该酵母菌细胞是通过将株W寄存编号BCRC 920077被寄存于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中屯、（FI畑I的BCRC)的酿酒 酵母菌[也W寄存编号DSM 25508被寄存于德国微生物菌种寄存中屯、值eutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZeHkulturen, DSMZ)]的基因组 DNA 中的 fpsl 基因与甜d2 基 因进行删除或破坏而制得。
[0034] 在本发明的另一个较佳具体例中，该酵母菌细胞是树干毕赤酵母菌（Pichia stipitis)。
[0035] 依据本发明，该培养步骤是在好氧条件（aerobic condition)下被进行。
[0036] 本发明也提供一种W生物质制备乙醇的方法，其包括：
[0037] 将能够通过消耗葡萄糖W及木糖来产生乙醇的酵母菌细胞培养于如上所述的种 子培养基中，从而在该种子培养基中制备该酵母菌细胞的种子培养物；W及
[0038] 接种该种子培养物于该生物质中进行发酵；
[0039] 其中，该生物质包含葡萄糖、木糖，及醋酸。
[0040] 依据本发明，该酵母菌细胞及其培养步骤是如上面所描述者。
[0041] 依据本发明，该生物质是包含有葡萄糖、木糖，及醋酸的混合糖液。
[0042] 依据本发明，该生物质是包含有葡萄糖、木糖，及醋酸的纤维素水解液。
[0043] 依据本发明，该纤维素水解液是通过对纤维素生物质依序地进行前处理及水解处 理而被制得。 W44] 如本文中所用的，术语"纤维素水解液"与"木质纤维素水解液"和"生物 质水解液化iomass hy化olysate)"是可被交替地使用，并且意指由生物质的糖化 (saccharification)所产生的产物。
[0045] 依据本发明，在该生物质中的醋酸具有范围落在4至lOg/L的浓度。较佳地，在该 生物质中的醋酸具有范围落在5至8. 5g/L的浓度。更佳地，在该生物质中的醋酸具有范围 落在6至8g/L的浓度。
[0046] 依据本发明，该发酵步骤是在实质上没有糖蜜W及玉米浸液的条件下被进行。 阳047] 如本文中所用的，术语"实质上没有（substantially化ee of)"意指被具体指明 的成分缺少有意义的数量。较佳地，该发酵步骤是在完全没有该成分的条件下被进行，或者 该成分的数量对于该发酵步骤不具有可测量的影响（measurable effect)。
[0048] 依据本发明，该发酵步骤是在范围落在5. 0至6. 5的抑值的条件下被进行。较 佳地，该发酵步骤是在范围落在5. 0至5. 5的抑值的条件下被进行。
[0049] 依据本发明，该发酵步骤是在厌氧条件（anaerobic condition)下被进行。
[0050] 本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，该等实施例只是供例 示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。 阳〇5U <实施例〉
[0052] 一般实验材料：
[0053] 1.制备Afpsl A甜d2双突变的酿酒酵母菌（Afpsl A甜d2 double mutant Of Saccharomyces cerevisiae)： 阳054] 在下面实验中所使用的酿酒酵母菌菌株是A巧si A甜d2双突变的酿酒酵母菌， 其大体上是依据 Zhang A et al. (2007)(同上述）W及 Hubmann G.et al. (2011)(同上 述）当中所述的方法而被制备。简言之，首先，依据Zhang A et al. (2007)(同上述）当中 所述的方法，将可共发酵五碳糖与六碳糖的酿酒酵母菌BCRC 920077 [得自于
【申请人】先前 专利案TW 1450963(对应申请案CN103695329A)，也W寄存编号DSM 25508被寄存于DSMZ] 的巧Sl基因敲除，继而将所得到的A巧Sl突变菌株进一步依据化bmann G.et al. (2011) (同上述）当中所掲示的方法来进行甜d2基因的敲除，借此而得到A巧Si A甜d2双突变的 酿酒酵母菌菌株（下面简称"经双突变的酿酒酵母菌"）。
[0055] 2.在下面实施例中，用于配制种子培养基的薦糖蜜W及玉米浸液分别是购自于 丰年丰和企业股份有限公司（Fonen And FonHer E；nte;rp;rise Co. ,LTD) W及台湾糖业股 份有限公司CTaiwan Sugar Co巧oration),其中薦糖蜜含有435g/L的薦糖、36. 5g/L的葡 萄糖W及86g/L的果糖，而玉米浸液含有60. 88% (w/w)的水、17. 67% (w/w)的粗蛋白质、 6. 49% (w/w)的粗灰分W及177. 94ppm的二氧化硫。
[0056] 3.下列实验材料是购自于景明化工股份有限公司巧cho化emical Co. , LTD):葡 萄糖W及木糖。
[0057] 4.下列实验材料是购自于SHOWA :尿素。
[0058] 5.下列实验材料是购自于Scharlau :醋酸。
[0059] 6.在下面实施例中所使用的YPD培养基具有如下面表1所示的配方。 W60] 表LYTO培养基的配方
阳06"
[00( 扣下 面言 阳Oi 阳Oi
[00( 、TCC 583 阳Oi 阳Oi
[0068] 一般实验方法：
[0069] 1.高效能液相层析化i曲 performance liquid C虹omatography, HPLC)分析： W70] 在下面的实施例中，被用来进行HPLC分析的待测样品中所含有的成分 及其浓度（g/U是参考美国国家再生能源实验室（化tional Renew油Ie化ergy L油oratory, NREL)所颁布的有关标准生物质分析的实验室分析程序（1油oratory anal}ftical procedures, LAPs)，并通过使用配备有一个折射率侦测器（refractive index detector, RI detector)的高效能液相层析仪值IONEX叫timate 3000)来进行测定，其 中所使用的管柱W及操作条件如下：分析管柱为Aminex HPX-87H管柱度ioRad);流动 相：5mM硫酸（配于水中）；流速被控制为0. 6mL/分钟；样品注射体积为20 y L ;管柱烘箱 (column oven)溫度控制在65°C ;RI溫度控制在45°C。
[0071] 此外，为供比对，使用不同浓度的葡萄糖（1. 25-24g/L)、木糖（1. 25-24g/L)、醋酸 (0. 25-6g/L) W及乙醇（；0. 938-20g/L)来分别作为校正标准品（controlstandard)并进行 相同的分析。
[0072] 实施例1.在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的玉米浸液与3%的薦糖 蜜的种子培养基所制得的经双突变的酿酒酵母菌的种子培养物对于发酵制程的乙醇产率 的影响
[0073] 于本实施例中，依据上面"一般实验材料"的第1项"制备A巧Sl A甜d2双突变的 酿酒酵母菌"所得到的经双突变的酿酒酵母菌被拿来作为试验菌株。
[0074] 实验方法：
[00巧]首先，将该经双突变的酿酒酵母菌菌株分成6组，其中包括5个实验组（也就是实 验组1至5) W及1个对照组。接着，将实验组1至5的菌株分别接种至具有如下面表4中 所示的配方的种子培养基（IOmL)中，W及将对照组的菌株接种至如上面表1中所示的YPD 培养基（IOmL)中。
[0076] 表4.各个实验组的种子培养基的配方
[007引之后，将各组菌株置于恒溫振荡培养箱（30°C、200巧m)内进行培养历时16小时。 接着，将所形成的培养物于15, 700g下进行离屯、历时1分钟，然后收集细胞沉淀物并使用如 上面表2中所示的发酵培养基来充份悬浮菌体，由此所得到的细胞悬浮液被拿来作为经双 突变的酿酒酵母菌的种子培养物。
[00巧]之后，将各组种子培养物分别W 2X IO6细胞/mL的接种量接种于含有IOOmL的 如上面表2中所示的发酵培养基的锥形瓶中，然后于厌氧条件下W及恒溫培养箱（30°C、 200rpm)中进行发酵反应历时72小时。在发酵反应开始之后的第6小时W及第24小时，对 各组添加6N的化OH W使其抑值被维持在5. 5。
[0080] 之后，将所得到的各组发酵培养物于12, 000巧m下予W离屯、历时1分钟，而所得到 的发酵产物（fermentation pro化Ct)是依据上面"一般实验方法"的第1项"高效能液相 层析分析"当中所述的方法来进行乙醇的含量分析。
[0081] 乙醇产率是通过将所测得的乙醇含量W及发酵前发酵培养基中所含有的葡萄糖 含量W及木糖含量代入下列公式（I)而被计算出：
[0082] A= [B/(CX0. 51+DX0. 48)] XlOO (I)
[0083] 其中：A=乙醇产率（％)
[0084] B =所测得的乙醇含量（g/L)
[00化]C =发酵前发酵培养基中所含有的葡萄糖含量（g/L)
[0086] D =发酵前发酵培养基中所含有的木糖含量（g/L)
[0087] 结果：
[0088] 本实验所测得的结果被显示于图1中。从图1可见，与对照组相较下，各实验组的 发酵产物所测得的乙醇产率皆有显著的提高，同时会随着玉米浸液的浓度的增加而更趋于 明显。运个实验结果显示，在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的玉米浸液与3% (v/v)的薦糖蜜的种子培养基所制得的经双突变的酿酒酵母菌的种子培养物，皆能够有效 地提升发酵制程的乙醇产率。
[0089] 实施例2.在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的薦糖蜜与6%的玉米浸 液的种子培养基所制得的经双突变的酿酒酵母菌的种子培养物对于发酵制程的乙醇产率 的影响
[0090] 于本实施例中，使用相同于实施例1所具者的试验菌株。
[0091] 实验方法：
[0092] 首先，将该经双突变的酿酒酵母菌菌株分成7组，其中包括6个实验组（也就是实 验组1至6) W及1个对照组。接着，将实验组1至6的菌株分别接种至具有如下面表5中 所示的配方的种子培养基（IOmL)中，W及将对照组的菌株接种至如上面表1中所示的YPD 培养基（IOmL)中。
[0093] 表5.各个实验组的种子培养基的配方 [00941
[0095] 之后，将各组菌株置于恒溫振荡培养箱（30°C、200rpm)内进行培养历时16小时。 接着，将所形成的培养物于15, 700g下进行离屯、历时1分钟，然后收集细胞沉淀物并使用如 上面表2中所示的发酵培养基来充份悬浮菌体，由此所得到的细胞悬浮液被拿来作为经双 突变的酿酒酵母菌的种子培养物。
[0096] 之后，将各组种子培养物分别W 2X IO6细胞/mL的接种量接种于含有IOOmL的 如上面表2中所示的发酵培养基的锥形瓶中，然后于厌氧条件下W及恒溫培养箱（3(TC、 200rpm)中进行发酵反应历时72小时。在发酵反应开始后的第6小时W及第24小时，对各 组添加6N的化OH W使其抑值被维持在5. 5。
[0097] 之后，将所得到的各组发酵培养物于12, OOOrpm下予W离屯、历时1分钟，而所得到 的发酵产物是依据上面"一般实验方法"的第1项"高效能液相层析分析"当中所述的方法 来进行乙醇的含量分析，并且依据上面实施例1当中所述的计算方式来计算出各组的乙醇 产率。
[0098] 结果：
[0099] 本实验所测得的结果被显示于图2中。从图2可见，与对照组相较下，各实验组的 发酵产物所测得的乙醇产率皆有提高的情形，其中又W实验组3的发酵产物所测得的乙醇 产率最高。运个实验结果显示，在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的薦糖蜜与 6% (v/v)的玉米浸液的种子培养基所制得的经双突变的酿酒酵母菌的种子培养物皆能够 有效地提升发酵制程的乙醇产率，其中化含有3% (v/v)薦糖蜜W及6% (v/v)玉米浸液的 种子培养基的效果最佳。
[0100] 实施例3.不同的抑值的发酵条件下的影响 阳IOU 于本实施例中，使用相同于实施例1所具者的试验菌株，并使用含有醋酸且抑值 为5. 0、5. 5或6. 0的发酵培养基来模拟含有醋酸的生物质（例如，纤维素水解液），而探讨 在此发酵培养基中进行发酵反应的情况下，由含有3% (v/v)的薦糖蜜与6% (v/v)的玉米 浸液的种子培养基所制得的该经双突变的酿酒酵母菌的种子培养物对于发酵制程的葡糖 糖与木糖的利用量W及乙醇产率的影响。 阳102] 实验方法： 阳103] 首先，将该经双突变的酿酒酵母菌菌株分成6组，其中包括3个实验组（也就是实 验组1至3) W及3个对照组（也就是对照组1至3)。接着，将实验组1至3的菌株分别接 种至含有3% (v/v)薦糖蜜化及6% (v/v)玉米浸液的种子培养基（IOmL)中，化及将对照 组1至3的菌株分别接种至如上面表1中所示的YPD培养基（IOmL)中。 阳104] 之后，将各组菌株置于恒溫振荡培养箱（30°C、200rpm)内进行培养历时16小时。 接着，将所形成的培养物于15, 700g下进行离屯、历时1分钟，然后收集细胞沉淀物并使用如 上面表2中所示的发酵培养基来充份悬浮菌体，由此所得到的细胞悬浮液被拿来作为经双 突变的酿酒酵母菌的种子培养物。
[01化]之后，将各组种子培养物分别W 2X IO6细胞/mL的接种量接种于含有IOOmL的 如上面表2中所示的发酵培养基的锥形瓶中，然后于厌氧条件下W及恒溫培养箱（3(TC、 200rpm)中进行发酵反应历时72小时。在发酵反应开始后的第6小时W及第24小时，对各 组添加6N的化OH W使实验组1与对照组1的抑值被维持在5. 0,实验组2与对照组2的 抑值被维持在5. 5, W及实验组3与对照组3的抑值被维持在6. 0。 阳106] 接着，将所得到的各组发酵培养物于12, OOOrpm下予W离屯、历时I分钟，而所得到 的发酵产物是依据上面"一般实验方法"的"高效能液相层析分析"当中所述的方法来进行 乙醇、木糖W及葡萄糖的含量分析，并且依据上面实施例1当中所述的计算方式来计算出 各组的乙醇产率。 阳107] 结果： 阳10引本实验所测得的结果被显示于下面表6中。
[0109] 表6.各组发酵产物所测得的乙醇产率、葡萄糖含量W及木糖含量 阳110]
阳111 ] 从表6可见，无论将由不同的种子培养基所制得的种子培养物接种于pH值被维持 在5. 0、5. 5或6. 0的发酵培养基中来进行发酵培养的情况下，各组发酵产物所测得的剩余 的葡萄糖含量皆为Og/L。另外，就乙醇产率W及木糖含量而言，各个实验组的发酵产物所 测得的乙醇产率皆高于对应的对照组所具者，而各个实验组的发酵产物所测得的剩余的木 糖含量皆低于对应的对照组所具者。特别地，实验组1的发酵产物所测得的乙醇产率是近 似于对照组2所具者，而实验组2的发酵产物所测得的乙醇产率是近似于对照组3所具者。 运个实验结果显示，在存在有醋酸的发酵条件下，无论抑值被维持在5. 0、5. 5或6. 0,由含 有3% (v/v)的薦糖蜜与6% (v/v)的玉米浸液的种子培养基所制得的经双突变的酿酒酵 母菌的种子培养物皆能够有效地提升发酵制程的木糖利用量，进而提升乙醇产率。因此，当 在发酵反应中抑值随着时间而降低时，可节省被用来调整抑值的化OH使用量。
[0112] 实施例4.在存在有醋酸的发酵条件下，由含有3%的薦糖蜜与6%的玉米浸液 的种子培养基所制得的树干毕赤酵母菌（Pichia stipitis)BCRC 21775(对应于ATCC 58376)的种子培养物对于发酵制程的乙醇产率的影响
[0113] 于本实施例中，树干毕赤酵母菌BCRC 21775(对应于ATCC 58376)(购自于台湾的 食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中屯、）被拿来作为试验菌株，并使用含有醋酸 且抑值为6. 0或6. 5的发酵培养基来模拟含有醋酸的生物质（例如，纤维素水解液）。
[0114] 实验方法：
[0115] 首先，将树干毕赤酵母菌BCRC 21775分成4组，其中包括2个实验组（也就是实 验组1与2) W及2个对照组（也就是对照组1与2)。接着，将实验组1与2的菌株分别接 种至含有3% (v/v)薦糖蜜化及6% (v/v)玉米浸液的种子培养基（IOmL)中，化及将对照 组1与2的菌株分别接种至如上面表1中所示的YPD培养基（IOmL)中。
[0116] 之后，将各组菌株置于恒溫振荡培养箱（30°C、200巧m)内进行培养历时16小时。 接着，将所形成的培养物于15, 700g下进行离屯、历时1分钟，然后收集细胞沉淀物并使用如 上面表3中所示的发酵培养基来充份悬浮菌体，由此所得到的细胞悬浮液被拿来作为树干 毕赤酵母菌BCRC 21775的种子培养物。
[0117] 之后，将各组种子培养物分别W 2Xl〇6细胞/mL的接种量接种于含有IOOmL的 如上面表3中所示的发酵培养基的锥形瓶中，然后于厌氧条件下W及恒溫培养箱（3(TC、 200rpm)中进行发酵反应历时72小时。在发酵反应开始后的第6小时W及第24小时，对各 组添加6N的化OH W使实验组1与对照组1的抑值被维持在6. 0, W及实验组2与对照组 2的抑值被维持在6. 5。
[0118] 接着，将所得到的各组发酵培养物于12, 000巧m下予W离屯、历时1分钟，而所得到 的发酵产物是依据上面"一般实验方法"的"高效能液相层析分析"当中所述的方法来进行 乙醇的含量分析。
[0119] 乙醇产率是通过将所测得的乙醇含量W及发酵前发酵培养基中所含有的木糖含 量代入下列公式（II)而被计算出： 阳 120] E = [F/(GX0. 48)] XlOO (H)
[0121] 其中：E=乙醇产率（％) 阳122] F=所测得的乙醇含量（g/L) 阳123] G =发酵前发酵培养基中所含有的木糖含量（g/L) 阳124] 结果：
[01巧]本实验所测得的结果被显示于下面表7中。 阳126] 表7.各组发酵产物所测得的乙醇产率 阳 127]
[0128] 从表7可见，各个实验组的发酵产物所测得的乙醇产率皆高于对应的对照组所具 者。特别地，实验组1的发酵产物所测得的乙醇产率高于对照组2所具者。运个实验结果 显示，在存在有醋酸的发酵条件下，无论抑值被维持在6.0或6.5,由含有3% (v/v)的薦 糖蜜与6% (v/v)的玉米浸液的种子培养基所制得的树干毕赤酵母菌BCRC 21775(对应于 ATCC 58376)的种子培养物皆能够有效地提升发酵制程的乙醇产率。因此，当在发酵反应中 抑值随着时间而降低时，可节省被用来调整抑值的化OH使用量。
[0129] 综合W上的实验结果，可得证：在存在有醋酸的发酵条件下，由含有糖蜜与玉米浸 液的种子培养基所制得的可共发酵葡萄糖与木糖的酵母菌的种子培养物能够有效地提升 发酵制程的木糖利用量，进而提升乙醇产率。
[0130] 于本说明书中被引述的所有专利和文献W其整体被并入本案作为参考数据。若有 所冲突时，本案详细说明（包含界定在内）将占上风。 阳131] 虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精 神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的权利要求书所示 者的限制。本申请中，酿酒酵母菌（saccharomyces cerevisiae)DSM 25508于2011年12 月20日被保藏于地址位于银浩芬斯彻7B D-38124不伦瑞克的德国微生物菌种保藏中屯、 GmbHo
【主权项】
1. 一种用于培养能够通过消耗葡萄糖以及木糖来产生乙醇的酵母菌细胞的种子培养 基，其特征在于，该种子培养基主要是由糖蜜、玉米浸液及水所构成，其中以该种子培养基 的总体积为计算基础，该糖蜜具有范围落在1. 0至6. 0% (v/v)的浓度，该玉米浸液具有范 围落在4.0至8.0% (v/v)的浓度，且该糖蜜的浓度低于该玉米浸液的浓度。2. 根据权利要求1所述的种子培养基，其特征在于，以该种子培养基的总体积为计算 基础，该糖蜜具有范围落在3.0至4.0% (v/v)的浓度。3. 根据权利要求1所述的种子培养基，其特征在于，以该种子培养基的总体积为计算 基础，该玉米浸液具有范围落在5.0至7.0% (v/v)的浓度。4. 根据权利要求1所述的种子培养基，其特征在于，该糖蜜选自于下列所构成的群组： 蔗糖蜜、甜菜糖蜜、柑橘糖蜜、玉米糖蜜，以及它们的组合。5. -种用于制备酵母菌细胞的种子培养物的方法，其特征在于，该方法包括：将能够 通过消耗葡萄糖以及木糖来产生乙醇的酵母菌细胞培养于根据权利要求1至4中任一项所 述的种子培养基中，从而在该种子培养基中制备该酵母菌细胞的种子培养物。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该酵母菌细胞选自于由下列所构成的群 组：重组型酿酒酵母菌以及树干毕赤酵母菌。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该重组型酿酒酵母菌的基因组DNA包括编 码木糖还原酶的基因、编码木酮糖激酶的基因及编码木糖醇脱氢酶的基因。8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在该重组型酿酒酵母菌的基因组DNA中的 fpsl基因及gpd2基因被删除、破坏，或失效。9. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，该培养步骤是在好氧条件下被进行。10. -种以生物质制备乙醇的方法，其特征在于，该方法包括： 将能够通过消耗葡萄糖以及木糖来产生乙醇的酵母菌细胞培养于根据权利要求1至 4中任一项所述的种子培养基中，从而在该种子培养基中制备该酵母菌细胞的种子培养物； 以及 接种该酵母菌细胞的种子培养物于该生物质中进行发酵； 其中，该生物质包含葡萄糖、木糖及醋酸。11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，该酵母菌细胞选自于由下列所构成的 群组：重组型酿酒酵母菌及树干毕赤酵母菌。12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，该重组型酿酒酵母菌的基因组DNA包括 编码木糖还原酶的基因、编码木酮糖激酶的基因及编码木糖醇脱氢酶的基因。13. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在该重组型酿酒酵母菌的基因组DNA中 的fpsl基因及gpd2基因被删除、破坏，或失效。14. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，该培养步骤是在好氧条件下被进行。15. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，该发酵步骤是在实质上没有糖蜜以及 玉米浸液的条件下被进行。16. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，该发酵步骤是在范围落在5. 0至6. 5的 pH值的条件下被进行。17. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，该发酵步骤是在厌氧条件下被进行。18. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在该生物质中的醋酸浓度为4至10g/
【文档编号】C12N1/16GK105838630SQ201510020288
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月15日
【发明人】赵铎骏
【申请人】远东新世纪股份有限公司