专利名称：一种同时富集五种食源性病原菌的培养基及制备方法
技术领域：
本发明属于食源性病原菌的前增菌培养基，具体涉及一种同时对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和志贺氏菌复合增菌的培养基及其制备方法。
背景技术：
食源性疾病是全球最普遍的公共卫生问题。世界卫生大会2006年通过了关于食品安全的决议，该决议认为食源性疾病严重影响了世界人民的健康和幸福，并对个人、家庭、社区、工商企业和国家都造成了严重的经济损失[I]。其中，食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一，食物中毒暴发时，识别食源性病原菌至关重要[2]。肠炎沙门氏菌，大肠杆菌0157，金黄色葡萄球菌，单核增生李斯特杆菌，志贺氏菌等已成为涉及到食源性疾病中最常见的细菌因子[3]。这些病原菌总是与受欢迎的食物如 家禽产品、即食肉、乳品、和果蔬息息相关，有较高的发病率和死亡率，近年来爆发的几起食物中毒事件都涉及到它们[4]。在欧洲开展的调查鉴定出肉类是污染沙门氏菌、单核细胞增生李斯特杆菌、大肠杆菌0157的主要媒介[5]。金黄色葡萄球菌产生肠毒素也是公众关注的一个主要健康问题，金黄色葡萄球菌能在高盐环境中生长，高蛋白质食品中污染金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件时有发生[6]。志贺氏菌是人类细菌性痢疾的病原菌，主要通过动物性食品传播[7]。以上五种致病菌是目前我国保证多类食品安全的必检项目[8]。检测食源性病原菌的传统方法是培养法，但操作繁琐，费时耗力，难以满足当今经济全球化食品快速流通的检测需要。另外，随着科学技术的发展和人们食品安全意识的增强，食品中需要检测的食源性病原菌种类也逐渐增多。因此，关于多种病原菌的同时、快速检测技术的研究已日渐深入[9-12]。先进的多重检测技术减少了处理大量样品所需的空间、时间和劳力，从而节约了检测单个病原菌的成本；而且，多重检测技术也是合理的，因为许多食品，如牛奶和乳品[13]、肉和家禽[14]以及水果和蔬菜[15]，往往是多种病原菌的携带者；另外，多重检测技术可以减轻食品工业和管理部门承担的检测高风险食品(易受病原菌污染的食品)的负担。然而，在运用这些技术时必须考虑到影响检测的两个重要因素第一，食品是经过加工、深加工、冷冻、包装、储藏等过程得到的，食品中的致病菌随着环境的改变，会受到损伤，活力下降。该情况下，应用PCR、基因芯片等分子生物学方法检测时准确率下降，为了防止带有致病菌食品的漏检，食品在检测前需要进行增菌。第二，许多现代检测方法的检测限都在IO2 104CfU/ml范围。低灵敏度意味着，当食品受污染程度低时，在运用免疫学和分子生物学技术检测目标菌之前必需进行增菌[16]。可见，共增菌培养处理对于现代检测技术是必不可少的，该步骤的运用不仅能够增加样品中目标病原菌的浓度，还能修复受到生理压迫或损伤的细胞。通常，一种病原菌需要用一种或多种特殊的培养基来进行富集。如果同时检测多种病原菌就需要应用多种培养基分别进行富集，使检测过程复杂繁琐。采用共增菌培养基进行同时富集则可简化操作。国内外现有研究中，涉及共增菌培养基技术的研究主要包括沙门氏菌和志贺氏菌的共增技术[17];沙门氏菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的共增技术(BSB) [18];沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特杆菌的共增技术(SSL) [19];沙门氏菌、大肠杆菌及单增李斯特杆菌的共增技术(SEL) [20];沙门氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌的共增技术(SVV) [21]；能同时富集多种病原细菌的培养基包括通用预增菌培养肉汤(UPB) [22，23]、蛋白缓冲水(BPW)、胰酶大豆肉汤(TS B)和营养肉汤(NB) [7，23]等。迄今为止，未见关于同时富集沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特杆菌、大肠杆菌和志贺氏菌的共增菌培养技术的报道。为了满足背景微生物复杂情况时对特定目标病原菌进行性共增菌的要求，研究开发能同时富集五种病原菌的共增菌培养基，对实现同时检测多种病原菌具有重要的意义，是快速检测技术的重要前期技术平台。
发明内容
本发明旨在提供可以同时支持沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和志贺氏菌五种食源性病原菌同时生长的培养基，将常规检测方法中的前增菌步骤和选择性增菌步骤合二为一，用于同一平台检测多个病原菌，可以提高检测效率，节约检测成本。本培养基中含有十二水磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的缓冲体系，针对食品样品复杂的酸碱性环境，可防止增菌过程中PH值剧烈变化，有利于目标病原菌的快速增殖和生长。本培养基抑制剂包括胆盐、亚碲酸钾和氯化锂。低浓度的胆盐不影响沙门氏菌和志贺氏菌的生长，对其它三种菌的生长存在略微的抑制作用。亚碲酸钾对五种目标菌的生长都起到了抑制作用，抑制效果与浓度密切关联。氯化锂对革兰氏阴性菌的抑制作用强于对革兰氏阳性菌，三种抑制剂的适量添加可有效协调阳性菌与阴性菌的共同生长状态，同时也起到一定抑制背景微生物的生长的作用。五种菌对氯化钠的耐受性能较好，加入较高浓度的氯化钠，也可抑制其它部分非目标微生物的生长。本培养基中的促进剂葡萄糖、甘露醇和丙酮酸钠对五种菌的生长都起到了理想的促进作用。七叶苷对单增李斯特菌的生长表现出明显的促进作用，而对另外四种菌的生长影响不大。由于单增李斯特菌在五种菌共同生长时处于竞争弱势，因此，适量的七叶苷可以保证单增李斯特菌与其它四种菌处于协调一致的生长状态。本发明的制备方法是
(1)将蛋白胨、氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、胆盐、氯化锂、葡萄糖、甘露醇、丙酮酸钠和七叶苷加入到990mL蒸馏水中，加热至溶解，冷却至室温后，调节pH值至7. 1-7. 3 ；
(2)混匀，121°C灭菌20min ；
(3)称取亚碲酸钾0.Img加入到IOmL已灭菌的蒸馏水中，得到亚碲酸钾溶液，分装存于4-6 °C下备用；
(4)在无菌条件下，加入(3)配制的亚碲酸钾溶液10mL。本发明具有的优点
(I)SSSLE能够达到五种目标病原菌的各自选择性增菌培养基的增菌效果，可以提高检测效率，节约成本，简化操作程序。(2)与其它通用培养基相比，SSSLE能对五种目标菌同时富集并协调生长，最终获得相对一致的细胞生物量，具有最佳的增菌效果，能更好地满足现代快速检测技术的需求。本发明的培养物可以直接用于目标菌的分离培养及分子生物学检测实验。
图I:人工污染五种目标菌的样品经复合增菌培养基增菌后的PCR检测图，单增李斯特(hlyA)、志贺氏菌(ipaH)、沙门氏菌(invA)、金黄色葡萄球菌(16S)和大肠杆菌(uidA)o
图2 :猪肉样品经复合增菌培养基增菌后，检测出沙门氏菌(invA)和大肠杆菌(uidA)o图3:牛肉样品经复合增菌培养基增菌后，检测出单增李斯特菌(hlyA)、志贺氏菌(ipaH)、金黄色葡萄球菌(16S)、大肠杆菌(uidA)。图4 :鸡肉样品经复合增菌培养基增菌后，检测出金黄色葡萄球菌(16S)和志贺氏菌(ipaH)o
具体实施例方式为更好理解本发明，以下将结合实施例对本发明做详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例I:
将蛋白胨10. 0g、十二水磷酸氢二钠9. 0g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠10. 0g、葡萄糖
3.0g、七叶苷I. 0g、胆盐0. lg、氯化锂I. 0g、甘露醇2. Og和丙酮酸钠2. 5g,蒸懼水加至990mL，加热至溶解，冷却至室温后，矫正pH值至7. 1-7. 3 ;混匀，121°C灭菌20min ;称取亚碲酸钾0. IOmg加入到IOmL已灭菌的蒸馏水中，得到亚碲酸钾溶液；在无菌条件下，加入配制的亚碲酸钾溶液；分装存于4-6°C下备用。将制备的用于复合增菌的培养基分别接入稀释到10_4的沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和志贺氏菌五种目标菌的菌液0. 5mL，37°C培养24h。用紫外可见分光光度计测定540nm下的OD值。同时将菌液接入每种目标病原菌各自的选择性增菌培养基中做对照。表I目标菌单独在培养基中的生长情况
权利要求
1.一种用于同时富集沙门氏菌)、大肠杆菌CfocAericAia co7i)、金黄色葡萄球菌(Ste/成r/ococc^s atfre^s)、单增李斯特菌(Zisteria monocytogenes)和志贺氏菌CSXi职77a)五种食源性病原菌的培养基，其配方为蛋白胨5.(T20.0 g，氯化钠5.0 15.0 g，十二水磷酸氢二钠5. (Tl5. 0 g，磷酸二氢钾0.5 3.0 g，胆盐0.05 0.2 g，亚締酸钾0. 05 0. 15 mg,氯化锂0. 5 1. 5 g，葡萄糖l.(T5. 0 g,甘露醇1.0 6. 0 g，丙酮酸钠I. 0 5. 0 g,七叶苷 0. 5 I. 5 g,蒸馏水 1000 mL, pH7. 1-7. 5。
2.根据权利要求I所述的培养基，其特征在于蛋白胨10.0 g，氯化钠10. 0 g，十二水磷酸氢二钠9.0 g，磷酸二氢钾I. 5 g，胆盐0.1 g，亚碲酸钾0.1 mg，氯化锂1.0 g，葡萄糖3.0 g，甘露醇2. 0 g，丙酮酸钠2. 5 g，七叶苷I. 0 g，蒸馏水1000 mL, pH7. 1-7. 3。
3.权利要求I所述用于沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和志贺氏菌的培养基的制备方法，其特征在于按照如下步骤 (1)按照权利要求I所述的配方，将蛋白胨、氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、胆盐、氯化锂、葡萄糖、甘露醇、丙酮酸钠和七叶苷加入到990 mL蒸馏水中，加热至溶解，冷却至室温后，调节pH值至7. 1-7. 3 ； (2)混匀，121°C灭菌20 min ； (3)按权利要求I称取亚碲酸钾加入到10mL已灭菌的蒸馏水中，得到亚碲酸钾溶液，分装存于4-6°C下备用； (4)在无菌条件下，加入步骤(3)中配制的亚碲酸钾溶液10mL。
全文摘要
本发明涉及用于沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和志贺氏菌五种食源性病原菌同时复合增菌的培养基及制备方法。食源性病原菌是引起食物中毒的重要原因，快速准确地检测食源性致病菌对预防和控制食品安全事件的发生具有重要的现实意义。本培养基特征如下蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钠9.0g，磷酸二氢钾1.5g，胆盐0.1g，亚碲酸钾0.1mg，氯化锂1.0g，葡萄糖3.0g，甘露醇2.0g，丙酮酸钠2.5g，七叶苷1.0g，蒸馏水1000mL，pH7.1-7.5。本培养基能够同时富集五种目标病原菌，可用于目标菌的分离及鉴定，也可用于多个致病菌在同一检测平台的分子检测，为食品中五种病原菌快速检测方法提供了技术支撑，并且满足了对五种食源性病原菌同时检测的需要。
文档编号C12N1/20GK102660474SQ201210136370
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月5日 优先权日2012年5月5日
发明者唐俊妮, 李海红, 王琼, 赵燕英, 陈娟, 顾怀颖 申请人:唐俊妮, 西南民族大学