专利名称：斜带石斑鱼补体c3基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种rC3B蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用；还涉及一种补体C3蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用。
背景技术：
补体第三组分(C3)是补体系统的核心，它是1912年Ritg用蛇毒处理血清时发现的。在补体各成分中，补体C3的血清含量最高。补体C3蛋白具有特殊的结构，是一种β 2糖蛋白，由α、β两条肽链组成，两肽链间以二硫键相连，分子量为195KDa，其中α链为115KDa，由998个氨基酸残基组成，N末端和C末端均为丝氨酸；β链为75KDa，由669个氨基酸组成，N末端为丝氨酸，C末端为丙氨酸。两链间氢键、疏水键及二硫键相互连接，其 中二硫键散在于α链的92-93位氨基酸及β链的11-656位氨基酸之间。C3的激活与灭活酶的作用部位主要在α链，β链则与稳定必要的分子构象有关。在α链的半胱氨酸和谷氨酸残基之间有一个分子内硫酯键，此键不稳定，尤其是对蛋白质和碳水化合物中的亲核基团敏感，如羟基(一 0Η)和氨基(一順2)。C3当被C3转化酶裂解为C3a和C3b时，C3b分子内硫酯键变得更加不稳定，可被附近的羟基或氨基激活，断裂为酰基和巯基。酰基具有较强的亲电性，可与相应膜表面的亲核基团形成酯键或酰氨键，由此C3b结合于相应的膜表面，此结合部位为C3b的不稳定结合部位，借此部位，C3b除可结合于细胞膜表面外，还可结合于相应的免疫复合物、脂多糖、酵母多糖及多糖等。在功能上，C3亦居于中心地位，它既是3条激活途径的交汇，又是C3b依赖性阳性反馈环路的基础；同时C3裂解片段及其结合蛋白复杂而多样。C3分子上存在着众多与其他分子的结合位点，C3通过其上的系列受体位点与补体其它成分、病原体、血细胞等发生广泛的作用，从而在机体的免疫防御和免疫病理中发挥重要作用。rC3B是C3上与单核细胞、巨噬细胞表面补体受体的结合位点，也就是补体III型受体(CR3，⑶Ilb /⑶18 )结合位。C3裂解片段通过该结合位点与大量存在于单核细胞、中性粒细胞等上的C R 3结合，从而促进机体对血液中病原体的吞噬和清除，提高鱼类抗病性，增强鱼类自身的免疫力。石斑鱼类隶属S卢形目iPerciformes),鯧科{Serranidae),石斑鱼亚科(Bpinephelinae),石斑鱼属(Bpinephelus),为暖水性礁栖鱼类,广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域。石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类之一，其肉质鲜美，营养丰富，为餐桌中的上等佳肴，被港澳地区推为我国的四大名鱼之一，深受各地消费者的喜爱，经济价值巨大。但是，当前气候灾害和环境污染导致的高致病率和高死亡率，一直是石斑鱼人工养殖过程中难以解决的问题。市场上还没有一种能够有效增强石斑鱼免疫力的饲料添加剂。酵母是最简单的真核生物，以其作为宿主表达外源蛋白有很大的优势生长繁殖快，易培养，操作简单；能对表达的外源蛋白进行翻译后加工修饰，如糖基化、乙酰化等；安全性高，无致病性。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能将甲醇作为代谢的唯一碳源和能源。毕赤酵母表达系统有很多优点在科研及生产中广泛应用使用强的可诱导启动子-AOXl基因启动子；外源基因以单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定性好；重组蛋白以高水平分泌到几乎无蛋白的培养基中，利用表达蛋白的纯化；容易进行高密度发酵，适合于产业化生产。
发明内容
本发明的一个目 的在于提供一种石斑鱼rC3B蛋白。本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼rC3B蛋白的基因。本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼rC3B蛋白的前体蛋白，即石斑鱼补体C3蛋白。本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼补体C3蛋白的基因。本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼补体C3蛋白基因及功能片段rC3B的克隆载体。本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼补体C3蛋白基因及功能片段rC3B的表达载体。本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼补体C3功能片段rC3B重组蛋白及其制备方法。本发明的另一目的在于提供石斑鱼rC3B蛋白和/或C3蛋白在制备提高鱼类免疫力制剂中的应用。本发明所采取的技术方案是
石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,或者是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。编码上述石斑鱼rC3B蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。石斑鱼补体C3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或者是SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。编码上述石斑鱼补体C3蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。生产石斑鱼rC3B蛋白或石斑鱼补体C3蛋白的方法，包括将上述表达载体导入宿主细胞中，表达得到rC3B蛋白或C3蛋白。本发明的有益效果如下
1.本发明首次获得了石斑鱼的补体C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂或饲料添加剂，为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础；
2.将石斑鱼rC3B核苷酸序列在毕赤酵母重组株表达，可以大量生产石斑鱼rC3B重组蛋白，大大降低了生产成本，具有很高的经济价值；
3.本发明所提供的石斑鱼rC3B重组蛋白，经实验证明具有提高石斑鱼免疫力等功能，可以应用于制备鱼类尤其是石斑鱼免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用前景。
图I是斜带石斑鱼补体C3基因5’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；图2是斜带石斑鱼补体C3基因3’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析 图3是C3基因ORF的PCR扩增产物的电泳鉴定图。图4是斜带石斑鱼补体C3功能片段rC3B的PCR扩增产物的凝胶电泳分析 图5是克隆载体pMD18-T-rC3B双酶切(McoRI ,XbaI)验证 图6是表达载体pPICZaA-rC3B双酶切(McoRUXbaD验证 图7是重组株pPICZaA-rC3B-X-33表达产物rC3B重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图； 图8是重组株pPICZaA-rC3B-X-33表达产物rC3B重组蛋白的western_blot鉴定图； 图9是pPICZaA-rC3B毕赤酵母表达载体构建示意 图10是石斑鱼rC3B的氨基酸序列和人类rC3B氨基酸序列的对比图；
图11是rC3B抗原表位预测分析；
图12是重组株pPICZaA-rC3B-X-33高密度发酵产物rC3B重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析图(M :蛋白分子量标准；1 pPICZaA- rC3B -X-33发酵产物；NC :阴性对照pPICZ α Α-33发酵产物);
图13是在低温应激中的，Α，B, C三组鱼血细胞数目随应激时间的变化情况(*表示与对照组相比有显著性差异，P <0.0 = 5)；
图14是在低温应激中A、B、C三组鱼血细胞呼吸爆发水平随应激时间的变化情况(*表示与对照组相比有显著性差异，P < O. 05);
图15是在低温应激中A、B、C三组鱼血细胞凋亡情况随应激时间的变化情况(*表示与对照组相比有显著性差异，P < O. 05)。
具体实施例方式通过抑制性消减杂交技术获得斜带石斑鱼补体C3基因中间片段
通过抑制性消减杂交技术(SSH)构建了石斑鱼低温文库，测序得到一些功能基因，其中包含与石斑鱼补体C3高度同源的片段。该补体C3基因中间片段长度为396bp (SEQ IDNO. 5)。斜带石斑鱼补体C3基因5’端片段的合成
操作按照 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech,CA, USA) Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的补体C3中间片段的序列设计了两条下游引物C351和C352以进行嵌套PCR。第一条下游引物C351为5’ - CTTTCGGCCTTGGCGGGTTTG(SEQ ID NO. 6)，第二条下游引物 C352 为5’ -ACGGAAACAACACGTCCTCTACG(SEQ ID NO. 7)。第一次PCR以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经降落PCR方法扩增原补体C3中间片段的序列第298位至5’端的核苷酸序列，反应条件为94°C预变性5分钟；(I) 94°C变性30秒，72 0C退火30秒，共5循环，72 °C延伸2分钟；(2 )94 V变性30秒，70 V退火30秒，共5循环，72°C延伸2分钟；最后94°C变性30秒68°C退火30秒，共30循环，72°C延伸2分钟。第二次PCR以第一次PCR产物为模板，经PCR方法扩增原补体C3中间片段的序列第150位至5’端的核苷酸序列，反应条件为94°C预变性5分钟；(I) 94°C变性30秒，72°C退火30秒，共5循环，72°C延伸2分钟；(2) 94°C变性30秒，70°C退火30秒，共5循环，72°C延伸2分钟；最后94°C变性30秒68°C退火30秒，共30循环，72°C延伸2分钟。第一次PCR在琼脂糖凝胶上未能检测出条带，第二次PCR扩增产物的电泳鉴定图见图1，其中M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。将1804bp的扩增产物连接到pMD18-T载体上得到重组质粒pMD18-T-C3-5’-1804。将重组质粒pMD18-T-C3-5’-1804用pMD18_T的一对通用引物进行序列测定，其序列如SEQID NO. 14所示。测序结果与Genebank的序列进行比较,结果表明克隆的1804bp产物是斜带石斑鱼补体C3基因5’端基因。斜带石斑鱼补体C3基因3’端片段的合成
操作按 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech,CA, USA) Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的补体C3中间片 段的序列设计了两条上游引物C331和C332以进行嵌套PCR。第一条上游引物C331 为5’ -GTGGAAATCAGCGTACGGCAGA(SEQ ID NO. 8)，第二条上游引物 C332 为5’ -ACCCGCTCAAGCGTCCGAAAG(SEQ ID NO. 9)。第一次PCR以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，引物为C331，经PCR方法扩增补体C3中间片段的序列第120位至3’poly A端的核苷酸序列，反应条件为94°C预变性5分钟；(1)94°C变性30秒，72°C退火30秒，共5循环，72°C延伸2分钟；(2)94°C变性30秒，70°C退火30秒，共5循环，72°C延伸2分钟；最后94°C变性30秒68°C退火30秒，共30循环，72°C延伸2分钟。第二次PCR以第一次PCR产物为模板，经PCR方法扩增，反应条件为94°C预变性5分钟；(I) 94°C变性30秒，72°C退火30秒，共5循环，72°C延伸2分钟；(2) 94°C变性30秒，70°C退火30秒，共5循环，72°C延伸2分钟；最后94°C变性30秒68°C退火30秒，共30循环，72°C延伸2分钟。第一次PCR在琼脂糖凝胶上未能检测出条带，第二次PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2，其中M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。将3332bp的扩增产物连接到pMD18-T载体上得到重组质粒pMD18-T-C3-3’-3210。将重组质粒pMD18-T-C3-3’-3332用pMD18_T的一对通用引物进行序列测定，其序列如SEQID NO. 15所示。测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的3332bp产物是斜带石斑鱼补体C3的3’端基因。斜带石斑鱼补体C3基因全长序列的拼接
将已经测序的补体C3中间片段、5’RACE片段和3’RACE片段进行拼接，得到斜带石斑鱼补体C3基因的ORF全长，即补石斑鱼补体C3 cDNA全序列(SEQ ID NO. I)的第I一4974bp,总长为4974bp，并推测出其氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)。根据拼接得到的C3基因ORF全长设计引物C3qF5’-CTTCAGGGTTTAGGACGATGTG(SEQ ID NO. 10)，C3qA5’ -CCAGTGGGTCTTCTGGTGAGTG(SEQ ID NO. 11)。扩增的长度为5120bpo 以 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经PCR方法扩增石斑鱼的补体C3功能片段rC3B序列，PCR反应条件为94°C预变性3分钟；下边为40个循环94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸5分钟；最后72°C延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图3，其中M为分子量标准；NC为阴性对照；1为PCR扩增产物。PCR产物送去华大基因公司测序，测序结果和拼接结果一致。
生物信息学方法分析斜带石斑鱼活性区段C3补体受体III结合区rC3B序列 经文献调研，得到了人类补体C3功能片段的序列。使用clustalx和GeneDoc两个序
列分析软件，将石斑鱼补体C3基因氨基酸序列和人类补体C3氨基酸序列进行序列比对，发现人类的补体C3功能片段rC3B序列和石斑鱼的补体C3功能片段rC3B同源性较高(图10)。另外。通过DNAstar软件分析了石斑鱼的补体C3基因的抗原表位(图11)。进一步的确定了包含最多结合位点的活性区段石斑鱼C3补体受体III结合区rC3B(C3蛋的1331—1430 AA)。最后,使用RNAstructure 4. 6软件分析了该功能片段的RNA 二级机构,发现没有复杂的二级结构。斜带石斑鱼功能片段rC3B序列基因的合成
根据分析好的斜带石斑鱼功能片段rC3B的cDNA序列(SEQ ID NO. 3)，设计合成两段引物，上游引物是在该片段第I位碱基起的19个碱基前加上现的限制酶切位点以及保护碱基5’- CCGGAATTCATGGAAGCAACGGTGAAAA(SEQ ID NO. 12)，共 28bp ;下游引物是在该 片段第284位碱基起的前17个碱基加上油a/的限制酶切位点、保护碱基、6Xhis终止密码子 5’ -TGCAGATCTTTAATGATTGAGATAGATGATGTCTTTCTGACAGGACTG-3’ (SEQ ID NO. 13)，共48bp。以 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经PCR方法扩增石斑鱼的补体C3功能片段rC3B序列，PCR反应条件为94°C预变性3分钟；下边为40个循环94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30分钟；最后72°C延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图4，其中M: marker,NC为阴性对照，I : PCR扩增产物。从图4可见PCR扩增了一段长约350bp的序列。含斜带石斑鱼功能片段rC3B序列的克隆载体
将实施例6所获得目的基因片段分离纯化，然后与pMDlS-T (TAKARA)载体按照该试剂盒提供的体系4°C连接过夜(约16h)，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，经Amp+抗性和蓝白斑筛选出阳性克隆，通过质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经过双酶切验证以及测序验证，证明斜带石斑鱼功能片段rC3B序列克隆到载体中，命名为pMD18-T-rC3B，克隆载体转化大肠杆菌DH5 α所得到的重组菌株命名为pMD18-T-rC3B_DH5 α。使用EcoRI、XbaI对克隆载体pMD18-T-rC3B进行双酶切，酶切图谱见图5，其中M: marker, NC为pMD18_T_rC3B，I pMD18-T-rC3B 的及、XbaI 双酶切产物。含斜带石斑鱼功能片段rC3B序列的表达载体pPICZaA- rC3B的构建
克隆载体pMD18-T-rC3B用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切后，酶切产物用
E.Z. N. A. Gel Extraction Kit回收,进行琼脂糖凝胶电泳,分离纯化约350bp的斜带石斑鱼功能片段rC3B序列；
载体质粒pPICZaA经限制性内切酶及和油a/双酶切后分离纯化3. 6kb的大片段，与约350bp的斜带石斑鱼功能片段rC3B的基因片段按1:3混合，用T4连接酶16°C连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用低盐LB平板筛选具Zeocin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约4. O kb的重组质粒，用限制性内切酶及和油a/双酶切重组质粒，得到约350bp和3. 6kb的两个片段，大小分别与斜带石斑鱼功能片段rC3B的基因片段和表达载体pPICZaA大小相同，证明斜带石斑鱼功能片段rC3B的基因片段已克隆入毕赤酵母表达载体PPICZaA中，重组质粒命名为pPICZaA-rC3B。质粒构建流程图见图9。使用EcoRI、XbaI对表达载体PPICZaA_rC3B进行双酶切，酶切分析图见图6，其中M:marker, NC为pPICZ a A双酶切产物，I pPICZaA-rC3B双酶切产物。能高效表达斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白的毕赤酵母重组株pPICZaA- rC3B-X-33构建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect Pichia Expression Kit 说明书制备毕赤酵母X-33感受态细胞，重组质粒pPICZaA- rC3B用fee/线形化后凝胶回收，用标准方法电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，在含Zeocin 400 μ g/ml的YPDS平板上28°C进行培养。约3d后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达斜带石斑鱼功能片段rC3B重组蛋白的毕赤酵母重组株pPICZaA- rC3B _X_33。利用毕赤酵母基因工程菌pPICZaA- rC3B _X_33生产重组斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白
分别挑取各种工程菌的单克隆，接种于BMGY中，28°C，200rpm培养0D600至2_6，换培养基BMMY稀释0D600至I. 0，每24h向培养基中补加O. 5%甲醇，培养48h_72h后2000rpm， 4°C收集上清。取Iml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加5X电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑TriCine-SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒PPICZaA转化X-33后长出的单克隆培养后的上清蛋白。结果见图7，其中:M :蛋白分子量标准；1、2、3、4、5、6、7、8 :重组株pPICZaA- rC3B -X-33表达产物；NC为阴性对照，显示pPICZaA- rC3B _X_33在12Kd和17Kd之间出现一条新的蛋白条带，而阴性对照不出现此带。从图中看出，第四个菌株的表达量最高。石斑鱼rC3B蛋白抗原活性鉴定实验
将重组斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠源his单克隆抗体(Novagen), 二抗为羊抗鼠IgG-HRP(鼎国公司)。结果见图8，其中:M :蛋白分子量标准；1、2、3、4、5、6、7、8 :重组株pPICZaA- rC3B -X-33表达产物Western blot鉴定图谱；NC为阴性对照，显示鼠源his单克隆抗体能识别我们用毕赤酵母表达的重组斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白，证明得到的蛋白是重组斜带石斑鱼功能片段rC3B蛋白。动物实验
一、毕赤酵母基因工程菌PPICZaA- rC3B _X_33的高密度发酵
发酵过程参照 invitrogen 公司的 Pichia Fermentation Process Guidelines,具体步骤如下
I.分别挑取筛选好的单克隆菌株pPICZ a A-rC3B-X-33与pPICZ α Α_33，pPICZ α Α-33菌株作为空载对照。加入200ml MGY液体培养基到IL的锥形瓶中，30°C，200rpm振荡培养至 0D600=2-6 (约 16-24hours)。2. 组装好发酵罐，加入3L含有4%甘油的发酵基础培养基(配方见PichiaFermentation Process Guidelines),然后121°C,15min灭菌，待冷却后，用流加瓶加入氨水，调pH到5。3.在火焰圈保护下，将步骤I中摇好的菌种接种于自动控制发酵罐中。调节通气量，灌压，转速来维持溶氧高于20%。设定发酵温度为29°C，自动流加氨水控制pH 5±0.05。4.当发酵罐中的甘油耗尽后(约接种后20个小时)，用流加瓶流加每升含12mlPTMl (配方见 Pichia Fermentation Process Guideline),设置流加速度为 54.45ml/h，直到细胞湿重为200 g/liter结束(流加大约4个小时)。5.甘油消耗尽后，开始添加每升含12mlPTMl的甲醇，设定流加速度为10.8 ml/h，两个小时，设定流加速度为21.9 ml/h，两个小时后，设定流加速度为32.7 ml/h，保持这个速度直到发酵结束。这个阶段需要60个小时，总共添加约I. 2L的甲醇。此时的细胞湿重约为 290 g/liter ο6.分别取pPICZ a A-rC3B_X_33与pPICZ α Α-33发酵的菌液各Iml，上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加5Χ电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，pPICZ α Α-33发酵的菌液做为阴性对照组，结果见图12。显示pPICZaA- rC3B _X_33在12Kd和17Kd之间出现一条新的蛋白条带，而阴性对照不出现此带。结果说明，pPICZaA- rC3B _X_33菌种发酵产生了高浓度的重组蛋白。7.把发酵液用喷雾干燥器处理，得到粉末，pPICZaA- rC3B -X-33菌种的发酵液粉末做为饲料添加剂，PPICZ αΑ-33菌种的发酵液粉末做为对照，用于下面的饲养实验。二、饲养实验 I实验条件
选取同一批次、体质健康、规格相近的斜带石斑鱼放养在养殖桶中。水温25 30°C,水体盐度28 32%。，pH值8. I 8. 3，溶解氧值大于5. O mg/L,并且水体持续循环。2饲料配置
饲料共分为3种，A为商品料，B为商品料+ lwt% pPICZ α Α-33菌种的发酵液粉末，C为商品料+ lwt%pPICZaA- rC3B _X_33菌种的发酵液粉末。分别将各组粉料搅拌均匀，每天投喂前准确称量，用水稀释后制备成湿颗粒饲料投喂。 3实验鱼饲养
本试验设3个实验组，每组30条鱼。分别投喂A、B、C组饲料。试验鱼平均体重O. 95±0. Olg，长度为3±0. 5cm。养殖水不断充气，水温29土 2°C，水体pH值8. 1-8. 3，盐度28 32%。。上午和下午按照鱼体重的8%左右各投喂一次，雨天少量投喂。每天及时清理残饵，观察记录，饲养时间7周。实验前禁食一天。4应激实验 4. I实验设计
取用饲喂的斜带石斑鱼做温度应激实验，应激温度为14土 0.5°C。实验准备I.OmXO. 5 mX 0.5 m的储物箱3个，在每个储物箱先装满40L的海水，并将装有海水的储物箱置于气候箱中并放入水温计来测定水温，待水温稳定在14±0. 5°C，然后每个储物箱分别放A，B，C三组鱼各30条鱼，将做低温应激实验的储物箱置于气候箱中并放入水温计来测定水温。应激12小时，分别在O小时、3小时、6小时、12小时取样，每组取6尾。4. 2血细胞计数及渗透压的测定
用I mL—次性无菌注射器臀鳍下方尾静脉或尾动脉抽血，取完血后，拔下针头，将血液注入玻璃采血管中，4°C下静置，取血清。血细胞计数板的计数血细胞方法按照WHO手册进行计数，分别计数血细胞3次，取3次结果的平均值为计数结果。4. 2. I血细胞计数的测定原理
血细胞的计数一般使用血球计数板。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池，计数池高O. 1mm。计数池分为9个大方格，每个大格面积为I. Omm.容积为O. Imm3 ( μ I),其中，中央大方格分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域。四角的4个大方格是白细胞计数区域。在计数血细胞时，要计算位于中央的大方格中，其正中及四角5个中方格的总细胞数目，再根据公式细胞数/ml=五个中方格内的细胞个数/5X25X 10000X 稀释倍数。4. 2. 2血细胞计数的测定方法
视待测血细胞的浓度，加抗凝剂适当稀释(一般稀释100倍)，然后取洁净的血球计数板一块，并在计数区内盖上一块盖玻片。将血细胞轻轻吹打混匀，用移液枪吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生。静置片刻后，把血球计数板放在显微镜的载物台上然后观察并计数中央的大方格中，其正中及四角5个中方格的总细胞数目。在计数时，要遵循原则数上 线不数下线，数左线不数右线。测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净。每个血样分别计数血细胞3次，取3次结果的平均值为计数结果。结果显示应激过程中，在14±0. 5°C应激O小时，三种饲料喂养的鱼血细胞数目并没有明显差异，C组略高。应激3小时后，A，B，C三组的血细胞数目均有下降，但是C组的血细胞数目高于A、B组,并且差异显著。应激6小时后，A, B, C三组的血细胞数目进一步下降，但是C组的血细胞数目下降较A、B组少，数目明显高于A、B组，并且差异显著。应激12小时后，A，B，C三组的血细胞数目均有上升，C组的血细胞数目略高于A，B组，没有明显差异(见图13)。4.3呼吸爆发的测定
4.3. I细胞呼吸爆发的测定原理
活性氧(Reactive oxygen species, R0S)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。2, 7-二氯氢化突光素二脂(2，7-dichlorof luorescein diacetate, DCFH-DA)是迄今为止最常用、最灵敏的细胞内活性氧检探针。本身没有荧光的DCFH-DA可穿过细胞膜进入细胞，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。在激发波长502nm，发射波长530nm附近，使用流式细胞仪的FLl通道检测DCF荧光，从而测定细胞内活性氧水平。4. 3. 2血细胞呼吸爆发的测定方法
取200 μ I的血细胞悬液，加入200 μ I PBS缓冲液(MAS抗凝剂进行稀释)，混匀，调整细胞的浓度为I X IO6个/ml左右，使用荧光染料2，7- 二氯氢化荧光素二脂(DCFH-DA)(终浓度10 μ Μ) 25°C下避光染色30min。然后使用200目的筛网过滤将细胞悬液转移到上样管中，使用流式细胞仪进行检测，并用Cellquest软件分析DCF平均荧光强度的变化。结果显示A，B, C三组鱼受到低温14±0. 5°C应激后，应激O小时，三种饲料喂养的鱼血细胞的活性氧(呼吸爆发)并没有明显差异。随着应激时间的延长，血细胞的活性氧(呼吸爆发)水平不断升高，A，B组血细胞的活性氧含量上升明显比C组多，在6小时达到最大值，并且A，B组的活性氧含量明显高于C组。应激12小时后，A，B, C三组的血细胞的活性氧(呼吸爆发)均有下降，但是C组的血细胞的活性氧(呼吸爆发)明显低于A，B组(见图14)。
细胞凋亡测定
4. 4. I血细胞凋亡的测定原理
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点，被检测细胞悬液 用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。血淋巴细胞凋亡的测定原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由膜脂内侧翻向外侧。Annexin V是一种依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。用标记了 FITC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。碘化丙唳(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够细胞膜与细胞核结合呈现红色。将Annexin V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。在双参数流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FIT C— / PI—)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC + / PI +);而右下象限为凋亡细胞，显现(FIT C + / PI —)。4. 4. 2血淋巴细胞凋亡的测定方法
使用Annexin V/PI apoptosis kit,购自联科生物。具体步骤
收集血细胞，用MAS抗凝剂进行稀释，调整血细胞浓度大约为1-5X106 cells/ml，取200 μ I稀释的血细胞，在细胞悬浮液中加入5 μ I Annexin V-FITC和10 μ I PI后轻轻混匀，在黑暗环境下静置5分钟，然后使用200目的筛网过滤将细胞悬液转移到上样管中，使用流式细胞仪进行检测。结果表明Α，B, C三组鱼受到低温14±0. 5°C应激后，应激O小时，三种饲料喂养的鱼血细胞的细胞凋亡数目并没有明显差异。随着应激时间的延长,血细胞的细胞凋亡数目不断增加，A、B组血细胞的细胞凋亡数目增加比C组多，在6小时达到最大值，并且A、B组的细胞凋亡数目明显高于C组。应激12小时后，A、B、C三组的血细胞的细胞凋亡数目均有下降，但是C组的血细胞的细胞凋亡数目明显少于A、B组，并且差异显著(见图15)。以上实验表明实验组C组，食用了含有重组蛋白rC3B的饲料后，在低温应激过程中，其抗应激能力明显优于对照组A、B。由此可见，重组蛋白rC3B可用于制备鱼类免疫制剂或饲料添加剂，提高鱼类尤其是石斑鱼的免疫力。
权利要求
1.石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO: 4所示,或者是SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。
2.编码权利要求I所述石斑鱼rC3B蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:3所示。
4.石斑鱼补体C3蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO :2所示,或者是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。
5.编码权利要求4所述石斑鱼补体C3蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
7.一种克隆载体，含有权利要求2、3、5或6所述的基因。
8.—种表达载体,含有权利要求2、3、5或6所述的基因。
9.生产石斑鱼rC3B蛋白或石斑鱼补体C3蛋白的方法，包括将权利要求8所述表达载体导入宿主细胞中，表达得到rC3B蛋白或C3蛋白。
10.权利要求I或4所述的蛋白在制备提高鱼类免疫力制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了斜带石斑鱼补体C3基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用。石斑鱼rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或者是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。本发明首次获得了石斑鱼的补体C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不仅丰富了石斑鱼的基因库，而且可应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂或饲料添加剂，为石斑鱼的生理免疫研究提供了新的理论与实践基础。
文档编号C12N15/12GK102702339SQ20121013612
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月4日 优先权日2011年5月24日
发明者刘玉凤, 王维娜, 祁增华 申请人:华南师范大学