专利名称：新型抗cd98抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及与来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体的CD98具有特异性结合能力的单克隆抗体、以及使用该抗体的肿瘤生长抑制或癌症治疗的药物用途。
背景技术：
癌症(恶性肿瘤)在日本占死亡原因的第一位。其患者数目逐年增加，强烈需求有效性和安全性高的药物或治疗方法的开发。目前的抗癌药常常是特异性杀死癌细胞的能力低，也作用于正常的细胞，引起较多的药物有害反应。近年来，以在癌细胞中高表达的分子(癌相关抗原)为靶的抗癌药物的开发得到进展，在白血病、乳癌、肺癌等中成为有效的治疗手段。与在细胞的细胞膜上表达的癌相关抗原特异性结合的抗体经由抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)或补体依赖性细胞毒活性(CDC)等介导的免疫反应攻击癌细胞，或者抑制癌细胞生长所必须的细胞生长信号传递，对癌症治疗有效。但是，抗体可在治疗中涉及的癌症种类仅限于乳癌、难治性慢性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病等的癌症种类,另外,一种抗体可以应用于多种癌症种类治疗的抗体尚未出现。因此，人们需求可以与多种癌细胞强烈结合、具有抗癌活性的抗体的获得。⑶98 (4F2)是已知在多种癌细胞中高表达的、含有529个氨基酸残基、约80kDa的II型跨膜糖蛋白链。CD98通过二硫键与具有氨基酸转运活性的约40kDa的蛋白质形成异源二聚体，在细胞膜上表达。作为可能与⑶98结合的氨基酸转运蛋白已知有6种。⑶98鉴定为淋巴细胞的活化抗原，与细胞生长信号传递、整联蛋白的活化、细胞融合等很多生物学功能有关(Haynes B. F.等人.，J. Immunol.，(1981)，126，1409 1414 ;Lindsten T.等人 ，Mol. Cell Biol.，(1988)，8，3820 3826 ;Teixeira S.等人 ，Eur. J. Biochem.，(1991)，202,819 826 ;L. A. Diaz Jr.等人.，J Biol Regul Homeost Agents, (1998) 12, 25 32)。癌细胞为了确保生长的优势而具有各种机理。例如，癌细胞为了比周围细胞优先摄入生长所必要的必需氨基酸而过量表达中性氨基酸转运蛋白即是其中一种。近年来，在癌细胞中特异性高表达的氨基酸转运蛋白一L型氨基酸转运蛋白I(LATl)已得到克隆(Kanai 等人 ，J. Biol. Chem. (1998)，273，23629 23632)。LATl 与 CD98 形成复合体，钠离子非依赖性地转运亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等具有大型的支链的中性氨基酸。还已知LATl在除脑、胎盘、骨髓、睾丸之外的几乎所有正常组织中虽然表达低或未见表达，但在结肠直肠癌、胃癌、乳癌、胰腺癌、肾癌、喉头癌、食道癌、肺癌等人恶性肿瘤组织中与⑶98 —起表达允进(Yanagida等人 ，Biochem. Biophys. Acta,(2001)，1514，291 302)。如果降低LATl的表达、抑制氨基酸的摄入，则可以抑制肿瘤的生长，这在癌症移植小鼠模型中有报道(日本特开2000-157286号公报)，可以认为抑制LATl的活性有望作为癌症的治疗方法。关于人⑶98的抗体，报道的有通过将人⑶98表达细胞株免疫小鼠等非人哺乳 动物而制备的小鼠单克隆抗体(上述文献Haynes等人，Masuko T.等人.，Cancer Res.,(1986)，46，1478 1484，以及 Freidman AW 等人.，Cell. Immunol.，(1994)，154,253 263)。但是，这些抗⑶98抗体是否抑制LATl的氨基酸摄取则尚未所知。并且，LATl的细胞内区域的抗体虽已获得，但是可以与活细胞膜上的LATl结合的抗体尚未见报道。因此，如果可以获得与在癌细胞膜上表达的CD98或LATl结合、抑制LATl的氨基酸摄取的抗体，则可以得到广范围的癌症的优异的治疗药物。
发明内容
本发明人等成功地获得了与CD98具有特异性结合能力的抗体，该CD98来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基转运活性的蛋白质形成复合体。该抗体具有抑制癌细胞生长的作用，因此利用该性质，可用作药物组合物的有效成分，更具体地说，可用作肿瘤的预防或治疗药的有效成分。本发明基于上述发现完成。本发明的目的在于提供与CD98具有特异性结合能力的人抗体及其功能性片段，其中，该CD98来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体。本发明的目的还在于提供以上述本发明的人抗体及其功能性片段作为有效成分的药物组合物或肿瘤的预防或治疗药。本发明的人抗体及其功能性片段的特征在于与CD98具有特异性结合能力，其中，该CD98来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体。本发明的药物组合物或肿瘤的预防或治疗药含有上述本发明的人抗体或其功能性片段作为有效成分。附图简述图I是表示人抗⑶98单克隆抗体与表达人⑶98/人LATl的CT26细胞株的结合性的图。图2A是表示人抗⑶98单克隆抗体与表达人⑶98的L929细胞株的结合性的图。图2B是表示人抗⑶98单克隆抗体与表达人⑶98的L929细胞株的结合性的图。图3是表示人抗⑶98单克隆抗体与经衣霉素处理的K562人细胞株的结合性的图。图4A是表示人抗⑶98单克隆抗体与表达各种小鼠、人嵌合体⑶98的L929细胞株的结合性的图。图4B是表示人抗⑶98单克隆抗体与表达各种小鼠、人嵌合体⑶98的L929细胞株的结合性的图。图5是表示人抗CD98单克隆抗体对抑制T24人膀胱癌细胞株的氨基酸摄取的活性的图。图6A是表示人抗CD98单克隆抗体与人末梢血T细胞、B细胞、单核细胞的结合性的图。图6B是表示人抗CD98单克隆抗体与人末梢血T细胞、B细胞、单核细胞的结合性的图。图7是表示人抗⑶98单克隆抗体与PHA活化人末梢血T细胞、B细胞的结合性的图。图8是表示人抗CD98单克隆抗体与人主动脉内皮细胞(HAEC)和人结肠直肠癌细胞株(DLD-I)的结合性的图。图9A是表示人抗CD98单克隆抗体与各种癌细胞株的结合性的图。图9B是表示人抗CD98单克隆抗体与各种癌细胞株的结合性的图。图IOA是表示人抗CD98单克隆抗体与各种癌细胞株的结合性的图。图IOB是表示人抗CD98单克隆抗体与各种癌细胞株的结合性的图。
图11是表示将人抗CD98单克隆抗体K3、3-69_6、C2IgGl给予移植了肿瘤细胞的裸小鼠时各小鼠中的肿瘤块的大小的图。图12是表示对具有生长至90mm3的肿瘤的担癌小鼠以100 U g/小鼠个体隔日给予三次人抗CD98单克隆抗体C2IgGl时测定肿瘤大小的结果的图。图13是表示人抗CD98单克隆抗体K3、C2IgGl与猴细胞株C0S-7的交叉反应性的图。图14是表示在移植了伯基特淋巴瘤细胞株Ramos的担癌小鼠中，在肿瘤生长至30 140mm3之后分别以IOOmg/小鼠个体、以3次/周给予人抗⑶98单克隆抗体C2IgGl和利妥昔单抗时测定肿瘤大小的结果的图。图15是表示通过HPLC测定的、人抗⑶98单克隆抗体C2IgGlNS氨基酸修饰抗体的纯化后的聚集物含有率的图。图16A是表示人抗CD98单克隆抗体K3和C2IgGl、以及C2IgGl的各氨基酸修饰抗体与强制表达人⑶98或人LATl的L929细胞的结合性的图。图16B是表示人抗CD98单克隆抗体K3和C2IgGl、C2IgGl的各氨基酸修饰抗体与人结肠直肠癌细胞株(DLD-I)、伯基特淋巴瘤细胞株(Ramos)、人结肠直肠癌细胞株(Colo205)和人主动脉内皮细胞(HAEC)的结合性的图。发明的具体说明 微牛物的保藏本发明提供的含有编码人抗体可变区的核酸序列的质粒载体C2IgGl/pCR4和K3/pCR4分别以FERM BP-10551 (用于识别的标记为C2IgGl/pCR4)和FERM BP_10552(用于识别的标记为K3/pCR4)于2006年3月14日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东I 丁目I番I中央第6)。
定义本说明书或附图中，用于标记氨基酸而使用的单一英文字母分别表示以下的氨基酸。(G)甘氨酸、(A)丙氨酸、(V)缬氨酸、(L)亮氨酸、(I)异亮氨酸、(S)丝氨酸、(T)苏氨酸、⑶天冬氨酸、(E)谷氨酸、(N)天冬酰胺、(Q)谷氨酰胺、⑷赖氨酸、(R)精氨酸、(C)半胱氨酸、(M)甲硫氨酸、(F)苯丙氨酸、(Y)酪氨酸、(W)色氨酸、(H)组氨酸、(P)脯氨酸。用于标记DNA的单一英文字母的含义分别如下。(A)腺嘌呤、(C)胞嘧唆、(G)鸟嘌呤、(T)胸腺嘧啶。CD98及其单克隆抗体与本发明的人单克隆抗体及其功能性片段(如无特别说明，以下在本说明书中简称为“本发明的抗体”)具有特异性结合能力的CD98，如上所述，是含有529个氨基酸残基的II型跨膜糖蛋白链，与具有氨基酸转运活性的蛋白质在细胞膜上形成异源二聚体。其中，具有氨基酸转运活性的蛋白质的优选具体例子有LAT1。根据本发明的优选方案，CD98为人CD98。人CD98的蛋白质的一级结构是公知的(SEQ ID NO. 66 ；GenBank/EMBL/DDBJ accession No. AB018010)，人 LATl 的蛋白质也是公知的(SEQ ID NO. 68 ；GenBank/EMBL/DDBJ accession No. AB018009)。本发明的抗体与来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体的CD98具有特异性结合能力，而不与人正常细胞例如正常人血管内皮细胞、正常人末梢血单核细胞和淋巴细胞结合。具有结合能力的癌细胞的例子有构成结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、脑肿瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、白血病、T细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部扁平上皮细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛癌、咽癌、喉癌、胸膜肿瘤、男性细胞瘤、子宫内膜增生症、子宫内膜异位症、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质细胞瘤、横纹肌瘤、胶质母细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌瘤、甲状腺肉瘤或肾母细胞瘤等的癌细胞，更具体地说，例如有结肠直肠癌细胞株(DLD-l、Colo205、SW480、SW620、LOVO, LS180和HT29)、肺癌细胞株(H226)、前列腺癌细胞株(DU145)、黑素瘤细胞株(G361、SKMEL28和CRL1579)、非霍奇金淋巴瘤细胞株(Ramos)、膀胱癌细胞株(T24)、乳腺癌细胞株(MCF和MDA-MB-231)、胰腺癌细胞株(HS766T)、多发性骨髓瘤细胞株(頂9)、成红细胞白血病细胞株(K562)。本发明的抗体与上述各种各样的癌细胞具有结合能力，因此有利。本发明的抗体与癌细胞的特异性结合能力使得本发明的抗体的有效性高。S卩，如后所述，本发明的优选方案的抗体显著抑制氨基酸摄入到经由LATl介导的细胞内，因此只与癌细胞结合，较为有利，还可以将本发明的抗体与其它药物结合，有利地用作将药物传递至癌细胞的靶向药物。本发明的抗体具有抗肿瘤活性。本发明的优选方案的抗体具有显著抑制氨基酸摄入到经由LATl介导的细胞内的性质。因此,本发明的抗体的抗肿瘤活性除通过ADCC和⑶C的使用免疫系统进行特异性毒性之外，通过抑制上述氨基酸的摄取也可带来该活性。根据本发明的具体方案，本发明的抗体显著抑制膀胱癌细胞株T24细胞的氨基酸摄入。根据本发明的优选方案，本发明的抗体具有后述(a) SEQ ID NO. 29和31、(b) SEQID NO. 41和47、以及(c)SEQ ID NO. 43和47中的任意一对序列作为重链可变区和轻链可变区。并且，根据另一方案，本发明的抗体具有含在质粒载体K3/pCR4(FERM BP-10552)或C2IgGl/pCR4(FERM BP-10551)中的、由来自载体pCR4的序列以外的序列编码的序列作为可变区。该方案的抗体可变区的氨基酸序列是由从上述任意的质粒载体中得到的、不含有来自载体PCR4的序列的BglII-BsiWI片段(轻链可变区)和SlI-NheI片段(重链可变区)所编码。本发明的抗体的功能性片段是指与本发明的抗体特异性结合的抗原可特异性结合的抗体的片段。更具体地说，有F (ab，)2、Fab’、Fab、Fv、二硫键抗体(disulphide-linkedFV, dsFV)、单链 FV (Single-Chain FV, scFV)以及它们的聚合物等(D. J. King.,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies. ,1998, T. J. International、Ltd)。上述抗体片段可通过常用方法例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶进行抗体分子的消化或通过公知的遗传工程方法获得。本发明中，“人抗体”是指作为来自人的抗体基因的表达产物的抗体。如后所述，人抗体可通过对具有导入人抗体基因座、生产来自人的抗体的能力的转基因动物给予抗原获得。该转基因动物例如有小鼠，可生产人抗体的小鼠的制备方法例如如国际公开W002/43478号公报中所记载。本发明的抗体也包含下述单克隆抗体由具有在构成抗体的重链和/或轻链的各氨基酸序列中有一或多个氨基酸缺失、置换或附加所得到的氨基酸序列的重链和/或轻链形成。上述氨基酸的部分修饰(缺失、置换、插入、附加)可通过将编码该氨基酸序列的核苷酸序列部分修饰而导入到本发明的抗体的氨基酸序列中。该核苷酸序列的部分修饰可采用已知的位点特异性诱变法、按照常规方法导入(Proc Natl Acsd Sci USA.，1984，8 卷，15662 ;Sambrook 等人.，Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989) Secondedition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。根据本发明的优选方案，本发明的抗体是轻链第117号的异亮氨酸被置换为其它氨基酸残基，例如甲硫氨酸、天冬酰胺、亮氨酸或半胱氨酸。上述抗体的优选例子有具有(d)SEQ ID NO. 43 和 77、(e) SEQ ID NO. 43 和 79、(f) SEQ ID NO. 43 和 81、以及(g) SEQ IDNO. 43和83的任意一对序列作为重链可变区和轻链可变区。本发明的抗体也包含具有任意免疫球蛋白类和亚类的抗体，根据本发明的优选方案，是具有人免疫球蛋白类和亚类的抗体，优选的类、亚类有免疫球蛋白G(IgG)，特别是IgGl，优选的轻链是K。本发明的抗体也包含通过本领域技术人员周知的基因工程修饰(例如EP0314161号公报)而变换为不同的亚类的抗体。即，使用编码本发明的抗体可变区的DNA，通过基因工程方法，可获得与原有的亚类不同亚类的抗体。ADCC是指经由在巨噬细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞等的表面表达的Fe受体介导，与抗体的恒定区结合，由此识别细胞，通过活化识别的细胞而诱导的细胞毒活性。而CDC是指通过抗体与抗原结合，由活化的补体系统引发的细胞毒活性，已经了解这些活性根据抗体的亚类不同而活性强弱各异，并且这起因于抗体的恒定区结构的不同(CharlesA.Janeway,等人.Immunobiology,1997, Current Biology Ltd/Garland PublishingInc.)。因此，例如将本发明的抗体的亚类变换为IgG2或IgG4，则可以获得与Fe受体结合度低的抗体。相反，将本发明的抗体的亚类变换为IgGl或IgG3，则可以获得与Fe受体结合度高的抗体。希望得到上述ADCC和⑶C活性时，优选抗体亚类为IgGl。将不同的亚类抗体变换为IgGl时，例如可从抗体生成杂交瘤中只分离可变区，导入到含有人IgGl的恒定区的载体、例如N5KGl_ValLark载体(IDEC Pharmaceuticals,N5KG1 (美国专利6001358))中制备。通过将本发明的抗体恒定区的氨基酸序列进行基因工程修饰、或者与具有上述序列的恒定区序列结合，可以改变与Fe受体的结合度(参照Janeway CA. Jr.和TraversP. (1997), Immunobiology, Third Edition, Current Biology Ltd. /Garland PublishingInc.)，或者可以改变与补体的结合度(参照Mi-Hua Tao，等人 ，1993，J. Exp. Med)。例如，将编码重链恒定部分的EU编号系统(参照Sequences of proteins of immun ologicalinterest, NIH Publication No. 91 3242)的第 331 号脑氨酸(P)的序列 CCC 突变为 T 编码丝氨酸(S)的TCC，将脯氨酸置换为丝氨酸，由此可以改变与补体的结合度。例如，假设本发明的抗体单独没有细胞死亡诱导活性，则优选具有经Fe受体介导的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)或补体依赖性细胞毒活性(CDC)产生的抗肿瘤活性的抗体，如果单独的抗体具有细胞死亡诱导活性，则更优选与Fe受体的结合度低的抗体。考虑免疫抑制药物时，优选只对T细胞和抗原呈递细胞的结合有空间位阻时等、不具有ADCC活性或CDC活性的抗体。ADCC活性或CDC活性可能成为毒性的原因时，优选通过突变Fe区域或变更亚类来避免成为毒性原因的活性的抗体。考虑以上，如果需要，通过对不同的亚类进行基因工程修饰，则可将本发明的抗体制成通过ADCC或CDC特异性伤害癌细胞的抗体。根据本发明的另一优选方案，本发明的抗体优选识别由人CD98的氨基酸序列(SEQ ID NO. 66)中的连续或不连续的至少8个氨基酸残基构成的表位。根据本发明的更优选方案，本发明的抗体优选与人CD98的氨基酸序列中的第371 529号氨基酸的区域的一部分具有结合性，或者与第I 371号氨基酸的区域的一部分具有结合性。根据本发明的另一方案，提供具有与人CD98和猴CD98显示交叉反应的性质的抗体作为本发明的抗体。可以想到上述抗体在人CD98和猴CD98中识别同一或极为类似的表位结构，在对人进行临床实验之前可以以猴作为实验动物进行各种实验，因此具有优势。⑶98抗体的制备本发明的抗体例如可通过以下所述方法制备。将细胞表面大量表达人⑶98/人LATl或其一部分、或为提高抗原的抗原性而与适当的物质(例如牛血清白蛋白等)的缀合物、或人CD98/人LATl的细胞根据需要与免疫刺激剂(弗氏佐剂等)等一起免疫小鼠、兔、山羊、马等非人哺乳动物，或者将整合了人⑶98/人LATl的表达载体给予非人哺乳动物进行免疫致敏。本发明的抗体如下获得从由免疫致敏动物得到的抗体生成细胞和没有自身抗体生成能力的骨髓瘤系细胞(骨髓瘤细胞)中制备杂交瘤，将杂交瘤克隆，选择可生成与免疫中使用的抗原显示特异性亲和性的单克隆抗体的克隆。以下进一步对本发明的抗体的制备方法进行详述，抗体的制备方法并不限于此，例如可以使用脾细胞以外的抗体生成细胞和骨髓瘤细胞。抗原可以将编码⑶98的DNA整合到动物细胞用表达载体中，将该表达载体导入动物细胞，使用获得的转化细胞株本身。
⑶98在很多癌细胞表面上与LATl形成异源二聚体，因此将编码LATl的DNA同样整合到表达载体中，使用⑶98和LATl共表达的转化细胞株作为抗原，由此，有望获得抑制LATl的氨基酸摄入的抗体。动物细胞用表达载体例如可使用pEGF-Nl (Becton Dickinson BioscienceClontech公司制备)等载体，用适当的限制酶使插入位点切断，将用同一酶切断的人CD98或人LATl连接，由此可以制备用于导入目标基因的载体。通过将制备的表达载体例如导入到作为宿主的 L929 细胞(American Type Culture Collection No. CCL-1)中，可以制备高表达人⑶98和人LATl的细胞。将基因导入宿主的方法是公知的，例如有任意的方法(例如使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法、磷酸钙法、脂转染法等)。这样制备的转化细胞可以作为制备⑶98抗体的免疫原。还可以将表达载体本身作为免疫原。人CD98可根据公知的核苷酸序列或氨基酸序列，除基因重组技术之外，还可适当使用化学合成法、细胞培养方法等的技术领域中已知的方法制备。可以以这样得到的人CD98蛋白质作为抗原制备CD98抗体。人CD98的部分序列可按照在后述的技术领域中已知的方法，通过基因重组技术或化学合成法制备，还可以使用蛋白分解酶等将人CD98适当切断来制备。上述得到的抗原如下进行免疫。即，将制备的抗原与用于提高抗原性的适当的物质(例如牛血清白蛋白等)、以及根据需要与免疫刺激剂(弗氏完全或不完全佐剂等)一起混合，对小鼠、兔、山羊、马等非人哺乳动物进行免疫。优选保持未重新排序的人抗体基因，使用通过免疫致敏、生成对该免疫原为特异性的人抗体的非人动物，则本发明的抗体也可以是人抗体。此时，生成人抗体的动物例如有富塚等人的文献[Tomizuka等人.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA，2000，97卷722]中记载的生成人抗体的转基因小鼠。分泌单克隆抗体的杂交瘤的制备可按照Kohler和Milstein的方法(Nature,1975，256卷495 497)以及与其相近的方法进行。即，将从如上所述的免疫致敏的动物中获得的脾脏、淋巴结、骨髓或扁桃体等、优选淋巴结或脾脏中所含的抗体生成细胞，和优选来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等哺乳动物的没有自身抗体生成能力的骨髓瘤细胞通过细胞融合来制备。细胞融合例如可在聚乙二醇(例如分子量1500 6000)等高浓度的聚合物溶液中、在通常约30 40°C下，将抗体生成细胞和骨髓瘤细胞混合、进行约I 10分钟。生成单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选可如下进行将杂交瘤例如在微量滴定板中培养，例如采用ELISA等酶联免疫测定法、放射免疫、荧光抗体法等免疫学方法测定在可见到生长的孔中的培养上清对免疫抗原的反应性。由杂交瘤制备单克隆抗体时，可以将杂交瘤进行体外培养，由培养上清中分离。还可以在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔等腹水中等进行体内培养，从腹水中分离。还可以从杂交瘤等的抗体生成细胞中克隆编码单克隆抗体的基因，整合到适当的载体中，将其导入到宿 主(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等哺乳类细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)中，采用基因重组技术制备重组抗体(P.J. Delves. ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIALTECHNIQUES.，1997,WILEY,P. Shepherd和C. Dean. ,Monoclonal Antibodies. ,2000,OXFORDUNIVERSITY PRESS，J. W. Goding，Monoclonal Antibodies !principles and practice.,1993，ACADEMIC PRESS)。还可以采用转基因动物制备技术，制备目标抗体基因整合到内源性基因中所得的转基因的牛、山羊、绵羊或猪，从该转基因动物的乳汁中可大量获得来自该抗体基因的单克隆抗体。将杂交瘤在体外培养时，配合培养的细胞种类的特性、实验研究的目的和培养方法等各种条件，可以使杂交瘤生长、维持和保存，使用在培养上清中用于生成单克隆抗体的已知的营养培养基或由已知的基础培养基诱导制备的所有营养培养基来实施。生成的单克隆抗 体可通过将本领域所周知的方法例如蛋白A柱的层析、离子交换层析、疏水层析、硫酸铵盐析法、凝胶过滤、亲和层析等适当组合来制备。抗体的药物用途本发明的抗体，首先，由于与来自该癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质形成复合体的CD98的特异性结合能力，因此通过与治疗用药物缀合，可以形成可用于向癌细胞送达药物或在可用于导弹疗法等的治疗目的复合体。对与抗体缀合的治疗用药物的例子没有特别限定，例如有碘(m碘mI，125碘=125I)、钇(9° 钇=90Y)、铟(m 铟=111In)、锝(99m 锝99mTc)铟等放射核素(J. ff. Goding.Monoclonal Antibodies !principles and practice. , 1993,ACADEMIC PRESS),绿胺杆菌毒素(Pseudomonal toxin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、蓖麻毒素(Ricin)等细菌毒素，以及甲氨喋呤(Methopterin)、丝裂霉素(mitomycin)、加利车霉素(calicheamicin)等化学疗法药物(D. J. King. , Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.,1998,T. J. International Ltd,M. L. Grossbard. ,Monoclonal Antibody-Based Therapy ofCancer. , 1998, Marcel Dekker Inc)等,更优选诱导自由基生成的硒化合物。抗体与治疗用药物的结合可以是共价或非共价键(例如离子键)的任意形式。例如，利用抗体分子中的反应性基团(例如氨基、羧基、羟基等)或配位性基团，根据需要使反应性的基团结合或者变换为反应性基团，然后使具有可在可与该反应性基团反应形成络合物的官能团(为细菌毒素、化学疗法药物时)或该配位性基团之间形成络合物的离子性基团(为放射性核素时)的治疗用药物与抗体接触，可得到本发明的复合体。或者在形成复合体时可利用生物素-亲和素系统。治疗用药物为蛋白质或肽时，可通过基因工程的方法，以抗体与上述蛋白质或与肽融合的蛋白质的形式生产。另外，由于本发明的抗体具有抗肿瘤活性，因此可以将该本身作为抗肿瘤药物使用。可进一步用作药物组合物、尤其是用作肿瘤的预防或治疗药的有效成分。因此，本发明的抗体或药物组合物可适用具有起因于表达人⑶98/人LATl的细胞的可能性的各种疾病或症状的治疗或预防。该疾病或症状例如有各种恶性肿瘤，肿瘤的例子有结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、脑肿瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、白血病、T细胞淋巴瘤、胃癌、胰腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、头颈部扁平上皮细胞癌、皮肤癌、尿道癌、前列腺癌、绒毛癌、咽癌、喉癌、胸膜肿瘤、男性细胞瘤、子宫内膜增生症、子宫内膜异位症、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质细胞瘤、横纹肌瘤、胶质母细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌瘤、甲状腺肉瘤或肾母细胞瘤等，适用本发明的抗体时的肿瘤不限于一种，可以是多种肿瘤并发。另外，本发明的人单克隆抗体可适用于罹患了原发性局部癌的患者的寿命延长。另外，对于表达⑶98的免疫活性细胞可以选择性地使本发明的药物组合物与其作用。‘含有本发明的抗体或与治疗用药物结合的抗体的药物优选以药物组合物的形式提供。上述药物组合物含有治疗上有效量的治疗用药物，可以制成口服、非口服给药用的各种形式的制剂。这里，治疗上有效量是指对于给予的症状或给予的计划是可以获得治疗效果的量。本发明的组合物除抗体之外，可以含有生理学上可接受的制剂上的添加物，例如稀释剂、防腐剂、溶解剂、乳化剂、佐剂、抗氧化剂、等渗剂、赋形剂和载体的一种或多种。还可以制成与其它抗体或抗生素等其它药物的混合物。适当的载体中可以含有生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水葡萄糖液、以及缓冲生理盐水，但并不限于此。也可以含有该领域中周知的氨基酸、糖类、表面活性剂等稳定剂，防止与表面吸附的防吸附剂。制剂的形式可以根据治疗目的、治疗计划选择包含冻干制剂(这种情况下，可以通过添加上述缓冲水溶液重构后使用)、缓释制剂、肠溶性制剂、注射剂或输液剂等的制剂。给药途径可适当确定，例如可以是口服途径、以及包含静脉内、肌内、皮下和腹腔内注射或配药的非肠道途径。或者也可以是使本发明的组合物与患者的患部直接接触的方法。给药量根据使用动物的试验、临床实验的实施来适当确定，但通常应考虑患者的状态或严重程度、年龄、体重、性别等。通常在口服给药时，成人每天约为0. Olmg lOOOmg，可将其一次或分多次给药。非口服给药时，可以通过皮下注射、肌肉注射或静脉注射每次给药约 0. Olmg lOOOmg。本发明也包含使用本发明的抗体或药物组合物进行上述疾病的预防或治疗的方法，本发明还包含本发明的抗体在上述疾病的预防或治疗药的制备中的应用。根据本发明的优选方案，本发明的抗体可以以溶解于水或除此之外的药理学可接受的溶液而得到的无菌性溶液或悬浮液的安瓿剂的形式使用。还可以将无菌粉末制剂(优选将本发明的分子冷冻干燥)填充到安瓿瓶中，在使用时用药理学可接受的溶液稀释。实施例以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例记载的方案的限定。实施例I :人CD98或人LATl表汰载体的制备以保有人 CD98(hCD98，GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018010 ；SEQ IDNO. 65)和人 LATl(hLATl，GenBank/EMBL/DDBJaccession no. ABO18009 ;SEQ ID NO. 67)的DNA的质粒载体pcDNA3. l_hCD98和pcDNA3. 1-hLATl为模板，进行聚合酶链反应(PCR)。为了在全长人⑶98cDNA的5'末端附加EcoRI序列、在其3'末端附加NocI序列和终止密码予，使用引物 5，-CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA-3，(SEQID NO. 59)和5’-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAGCAG-3’ (SEQ ID NO. 60)，以 KOD-PlusDNA聚合酶(东洋纺公司制备)和 hCD98cDNA (约 20ng)为模板，进行94°C 15秒、55°C 30秒和68°C I分30秒的30个循环的PCR反应。将经修饰的h⑶98序列以EcoRI-NotI片段的形式分离，然后连接到用相同的酶切断的pTracer-EF/Bsd载体(Invitrogen公司制备)上。以所得质粒为模板，使用CD98v2U(5’ -AGT CTCTTG CAA TCG GCT AAG AAG AAG AGC ATC CGT GTC ATT CTG-3’ (SEQ ID NO. 61))引物和CD98v2L(5’-CAG MT GAC ACG GAT GCT CTT CTT CTT AGC CGA TTG CM GAG ACT-3’ (SEQ IDNO. 62))引物，将hCD98DNA的第591和第594号(SEQ ID NO. 65中的第702号和第705号)的A变为G。由所得质粒制备ECoRI-hCD98-NotI片段，与用相同的酶切断的pEF6myC-His/Dsd(Invitrogen)载体连接。将所得质粒命名为pEF6/hO)98。同样，为了在全长人LATIcDNA的5'末 端附加EcoRI序列、在其3'末端附加Kpnl序列，使用引物 5’ -CCG GAA TTC CCA CCA TGG CGG GTG CGG GCC CGA AGC GGC-3’ (SEQID NO. 63)和 5’ -CGG GGT ACC GTC TCC TGG GGG ACC ACC TGC ATG AGC TTC-3’ (SEQ IDNO. 64)，以 KOD-Plus DNA 聚合酶和 hLATlcDNA (约 20ng)为模板，进行 94°C 15 秒、55°C 30秒和68 °C I分30秒的30个循环的PCR反应。将经修饰的hLATl序列以EcoRI-KpnI片段的形式分离，然后连接到用相同的酶切断的pEGFP-NKClontech公司制备)载体上。再将所得质粒以EcoRI-NotI片段的形式分离，然后连接到用相同的酶切断的pEFlV5His/Neo (Invitrogen公司制备)载体上。将所得质粒命名为pEFl/hLATl-EGFP。实施例2 :hCD98/hLATl表汰细朐的制各hCD98/hLATl表达细胞的制备是使用Invitrogen公司制备的脂转染试剂和Plus试剂，将实施例I中制备的表达载体pEF6/hCD98和pEF I/hLATl-EGFP (hLATl-E)导入到 Colon26 (CT26)细胞和 L929 细胞(American Type Culture Collection No. CCL-1)中。基因导入按照手册说明书的方法进行。导入了基因的细胞使用细胞培养板(6孔板，BectonDickinson公司制备)、在37°C、5% C02下培养24小时后，如果为CT26细胞株，则用含有5 u g/mL杀稻瘟素和500 u g/mL G418的培养基，如果为L929细胞株，则用含有5 y g/mL杀稻瘟素和lmg/mL G418的培养基进一步培养三天。接着，用RPE荧光标记小鼠抗人CD98 抗体(Becton Dickinson 公司制备，Ca. No. 556076)的 FACS Vantage 分离 hLATl-E 和⑶98阳性细胞。用同样的方法制备表达h⑶98的L929细胞或表达hLATl_E的L929细胞。实施例3 :生成人抗体的小鼠的制备免疫中使用的小鼠对于内源性Ig重链和K轻链的破坏两者均具有同型接合体的遗传背景，并且同时保有含有人Ig重链基因座的14号染色体片段(SC20)和人IgK链转基因(kCo5)。该小鼠是通过具有人Ig重链基因座的系统A的小鼠和具有人IgK链转基因的系统B的小鼠的交配来制备。系统A对于内源性Ig重链和K轻链的破坏两者为同型接合体，是保有可进行子代传递的14号染色体片段(SC20)的小鼠系统，例如记载于富塚的报告(Tomi zuka.等人 ，Proc Natl Acad Sci USA，2000，97 卷722)中。另外，系统 B 是对于内源性Ig重链和K轻链的破坏两者为同型接合体，是保有人IgK链转基因(kCo5)的小鼠系统(转基因小鼠)，例如记载于Fishwild的报告(Nat Biotechnol. ,1996,14卷845)。系统A的雄性小鼠和系统B的雌性小鼠、或系统A的雌性小鼠与系统B的雄性小鼠交配得到的子代小鼠用富塚的报告(Tomizuka等人.，Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97卷722)的方法进行分析，筛选在血清中同时检测出人Ig重链和K轻链的个体(生成人抗体的小鼠)(Ishida和 Lonberg, IBC&apos ;s Ilth Antibody Engineering,Abstract,2000 ；Ishida, I.等人 ，Cloning&Stem Cells 4，85 96 (2002))，用于以下的免疫实验。免疫实验也使用了使上述小鼠的遗传背景改变的小鼠等(石田功(2002)实验医学20，6846851)。实施例4 :人单克隆抗体的制备人单 克隆抗体的制备是按照单克隆抗体实验操作入门(安东民卫等人著作，讲谈社发行1991)等记载的一般方法进行。作为免疫原的h⑶98/hLATl，使用实施例2制备的表达h⑶98/hLATl_E的CT26细胞和确认有h⑶98表达的人结肠直肠癌细胞株Colo205细胞。被免疫动物使用实施例3中制备的生产人免疫球蛋白的生成人抗体的小鼠。使用表达hCD98/hLATl-E的CT26细胞时，将5X IO6个细胞与IRBI佐剂(Corixa公司制备)混合，在腹腔内初次免疫。自初次免疫后的第7、24天，腹腔内追加免疫5X IO6个细胞/小鼠。并且在获得下述的脾脏细胞之前3天时同样地腹腔内追加免疫5X IO6个细胞/小鼠。使用Colo205细胞时，腹腔内初次免疫5X106个细胞。自初次免疫后的第14天，腹腔内追加免疫5X IO6个细胞/小鼠，3天后获得以下所述的脾脏细胞。由免疫的小鼠中外科取得脾脏，将回收的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0 (ATCCNo. CRL1581)按照5 I混合，使用聚乙二醇1500 (Roche公司制备)作为融合剂，进行细胞融合，制备大量杂交瘤。杂交瘤的选择通过在含有10%胎牛血清(FCS)和次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的含HAT的DMEM培养基(Gibco公司制备)中培养、进行。再使用含有HT的DMEM培养基，通过极限稀释法进行单一克隆。培养是在96孔微量滴定板(Becton Dickinson公司制备)中进行。生成目标人单克隆抗体的杂交瘤的选择(筛选)以及各杂交瘤所生成的人单克隆抗体的特征可通过后述的荧光活化细胞分选仪(FACS)测定来进行。生成人单克隆抗体的杂交瘤的筛选如下进行。即，通过下述FACS分析，获得200个以上生成具有人免疫球蛋白U链(hlgiO、Y链(hlgY)和人免疫球蛋白轻链K (hlgK)、且与表达h⑶98/hLATl-E的CT26细胞具有特异性反应性的人单克隆抗体的杂交瘤。需要说明的是，本说明书的实施例中，在表示结果的表或图中，用符号对生成人单克隆抗体的杂交瘤克隆进行命名。以下的杂交瘤克隆表示单一克隆4-35-14(C2)、4-32-9 (K3)，7-95-8，10-60-7，3-69-6，5-80-1 (以上克隆，免疫原是表达 hCD98/hLATl_E 的CT26细胞)，1-40-1 (所述克隆，免疫原是Colo205细胞)。实施例5 :各单克降抗体的亚类的鉴定通过FACS分析，对实施例4中获得的各单克隆抗体的亚类进行鉴定。将2X IO6/mL的Colo205细胞悬浮于含有ImM EDTA、0. 1% NaN3>5% FCS的PBS的SB (染色缓冲液)中。将细胞悬浮液分注在96孔圆底板中(Becton Dickinson公司制备,50 y L/孔)。再加A50UL实施例4培养的杂交瘤的培养上清，进行搅拌，在冰点温度下反应30分钟，然后离心(2000rpm, 4°C，2分钟)，除去上清。将沉淀物(pellet)用100 u L/孔的SB清洗一次，然后将FITC荧光标记兔抗人Igii F(ab' )2抗体(Dako Cytomation公司制备)用SB稀释为50倍，或者将RPE荧光标记山羊抗人IgYF(ab' )2抗体(SuthernBiotech公司制备)用SB稀释为200倍，或者将RPE荧光标记兔抗人Ig K F(ab' )2抗体(Dako Cytomation公司制备)用SB稀释为200倍，加入，在冰点温度下反应30分钟。用SB清洗一次，然后悬浮于300 V- L SB中，通过FACS(FACSCan,Becton Dickinson公司制备)测定表不抗体结合的突光强度。所得抗体的一部分结果如表I所不。C2是重链为ii链、轻链为K链，K3、3-69_6、7-95-8、10-60-7、1-40-1和5-80-1均是重链为y链、轻链为k链。[表I]各抗体的亚类
权利要求
1.人单克隆抗体或其功能性片段，其具有SEQID NO :41和47 —对序列作为重链可变区和轻链可变区。
2.人单克隆抗体或其功能性片段，其中所述抗体具有SEQ ID NO 41 的 Vh；SEQ ID NO -Al 的 \ ； 人K轻链恒定区；和 人重链恒定区，其中IgG的Y链和IgM的μ链的位于CHl恒定区的共通序列GCL序列朝向可变区一侧方向上相邻的26个氨基酸为μ链中的相应氨基酸，而GCL序列恒定区一侧的全部氨基酸为Y链中的相应氨基酸。
3.权利要求2所述的人单克隆抗体或其功能性片段，其中Vh和位于CHl恒定区的共通序列GCL序列朝向可变区一侧方向上相邻的26个氨基酸由SEQ ID NO 45表示。
4.权利要求1-3中任一项所述的人单克隆抗体或其功能性片段，其中所述功能性片段选自抗体的Fab、Fab’、(Fab/ ) 2、Fv、scFv、sdFv以及它们的组合。
5.缀合物，该缀合物包含 权利要求1-4中任一项所述的人单克隆抗体或其功能性片段；和 异源结构域，其含有药物或可检测的部分。
6.权利要求5的缀合物，其中所述可检测的部分为标志物。
7.缀合物，该缀合物包含 权利要求1-4中任一项所述的人单克隆抗体或其功能性片段；和 异源结构域，其含有结合蛋白。
8.缀合物，该缀合物包含 权利要求1-4中任一项所述的人单克隆抗体或其功能性片段；和 异源结构域，其含有酶。
9.缀合物，该缀合物包含 权利要求1-4中任一项所述的人单克隆抗体或其功能性片段；和 异源结构域，其含有毒素或免疫调节剂。
10.细胞，该细胞表达权利要求1-4中任一项所述的人单克隆抗体或其功能性片段。
11.抗体的制备方法，该方法包含将含有下述(a)和(b)中任意一对序列或其简并核苷酸序列的表达载体导入宿主；培养该宿主；由培养物获得该抗体(a)SEQ ID NO :40 和 46，和(d)SEQ ID NO :44 和 46。
12.权利要求11所述的制备方法，其中，宿主选自大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。
全文摘要
本发明公开了与来自癌细胞的细胞膜、且与具有氨基酸转运活性的蛋白质(例如，LAT1)形成复合体的CD98具有特异性结合能力的人抗体或其功能性片段。该抗体与在癌细胞表面与LAT1形成二聚体的CD98结合，使用ADCC或CDC的免疫系统对表达CD98的癌细胞特异性攻击，并且抑制经LAT1介导的癌细胞对氨基酸的摄取，由此抑制其增殖。本发明继而提供含有该抗体或其抗体片段的、作用于多种癌症、或对癌为特异性的、没有副作用的癌症的预防或治疗药。
文档编号C12N15/63GK102659947SQ20121013567
公开日2012年9月12日 申请日期2007年4月5日 优先权日2006年4月6日
发明者吉野哲也, 片冈之郎, 田原知幸, 远藤仁, 金井好克, 长谷川和正 申请人:协和发酵麒麟株式会社