专利名称：肌腱细胞培养基及其培养方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培养肌腱细胞的方法。特别地，本发明涉及一种使用选择性的培养基培养肌腱细胞以生成充分纯的肌腱细胞培养物的方法。
背景技术：
细胞培养是具有许多应用的技术，但是，有些细胞(例如肌腱细胞、肝细胞、成骨细胞、成肌细胞和心肌细胞)很难培养和/或培养很慢和/或在培养中易于表现出不稳定的表
型和去分化。培养的肌腱细胞尤其可以用于修复损伤的肌腱和韧带。肌腱损伤的一个常见的例子是肩袖撕裂(tear in the rotator cuff tendon)。这通常由过头的行动引起的，并且表现出高的临床发病率。旋转带肌腱(rotator cufftendon)完整性的丧失导致强度测量减弱，运动和功能范围降低。尽管肩袖撕裂的外科修复实现了高水平的功能改善，并且患者的满意度也很高，但是，有些肌腱修复，特别是大的肌腱或收缩肌腱撕裂，不能治愈或者在外科手术后再被撕裂。和初次治疗相比，对旋转带修复失败后的再修复外科手术的成功率极低。肌腱修复的基本原理是防止肌腱细胞的凋亡和在受损的肌腱内再生正常的肌腱细胞，但是这需要发展体外培养的表型稳定的肌腱细胞。但是肌腱或韧带的再生需要大量的肌腱细胞。此外，该肌腱细胞的表型应该与机体内的肌腱细胞的表型尽可能接近。理想情况下，培养的肌腱细胞与需要肌腱修复的受试者的肌腱细胞是自体同源的。目前，没有适当方法来培养一致性程度足够用于修复肌腱或韧带损伤的肌腱细胞。文献中描述的许多方法包括在生长因子(例如类胰岛素生长因子I或II，即IGF-I或IGF-II)的存在下，培养完整的肌腱或者极细碎的肌腱(例如，参见Dahlgren，等 2001，A JVR, 62(10) : 1557-1562 ;Kang 和 Kang, 1999，Yonsei Med. J. , 40(1) :26-29 ；Abrahamsson, 1996, J. Ortho. Res. , 15:256-262 ；Abrahamsson 和 Lohmander, 1996, J.Ortho. Res. , 14:370-376 ；Abrahamsson 等,1991, Ortho. Res. Soc. , 9:495-502 和 503-515 ；以及Anitua等，2005, J. Ortho. Res.，23:281-286)。虽然这些方法显示出促进了“类肌腱”或“衍生自肌腱”细胞的生长，但是已经充分确定的是，肌腱不仅仅含有肌腱细胞。实际上，肌腱中的大多数细胞为与内皮细胞在一起的成纤维细胞、滑膜细胞和一些软骨细胞。因此，已知的用于培养肌腱细胞的方法不能产生纯的肌腱细胞培养物，而是产生含有纤维细胞、内皮细胞和少量肌腱细胞的混合细胞群。众所周知，肌腱细胞是生长很慢的细胞，这样经常使培养过程中存在的其它细胞过度生长。这就意味着现有技术中的培养衍生自肌腱细胞的方法一般不能产生足够用于组织修复过程的肌腱细胞。因此，需要一种能培养足以用于组织修复过程的肌腱细胞的方法。
发明内容
因此，本发明的第一方面提供了一种肌腱细胞培养基，该肌腱细胞培养基含有胰岛素或其功能性衍生物。在一些实施方式中，该培养基含有约O. 00005%重量/体积至O. 1%重量/体积的胰岛素或其功能性衍生物。在其它的实施方式中，该培养基含有约0.0001%重量/体积至0.001%重量/体积的胰岛素或其功能性衍生物。在其它的实施方式中，该培养基含有约O. 0006%重量/体积的胰岛素或其功能性衍生物。第一方面的培养基还可以含有糖皮质激素，例如合成的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中，该糖皮质激素为倍他米松(betamethasone)。该培养基可以含有约O. 00001%重量/体积至O. 1%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中，该培养基含有约O. 0001%重量/体积至O. 001%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在其它的实施方式中，该培养基含有约O. 0002%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。本发明的第二方面提供了一种肌腱细胞培养基，该肌腱细胞培养基含有糖皮质激 素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中，该糖皮质激素为合成的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在其它的实施方式中，该糖皮质激素为倍他米松。该培养基可以含有约O. 00001%重量/体积至O. 1%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中，该培养基含有约0.0001%重量/体积至O. 001%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在其它的实施方式中，该培养基含有约O. 0002%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中，本发明提供了一种肌腱细胞培养基，该肌腱细胞培养基主要由胰岛素或其功能性衍生物组成。在其它的实施方式中，该肌腱细胞培养基主要由胰岛素和糖皮质激素或类糖皮质激素分子组成。本领域技术人员易于理解的是，这些培养基的非必要成分包括血清、抗生素和本领域公知的任何其它常规培养补充物质。因此，第一和第二方面的培养基还可以含有血清，例如胎牛血清(FBS)。该培养基可以含有约15%体积/体积的血清。第一和第二方面的培养基还可以含有抗生素。在一些实施方式中，该抗生素可以选自由氨苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素、两性霉素、制霉菌素、多粘菌素-B、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、四环素、大环内酯、里诺霉素(linomycin)、泰妙菌素(tiamutin)和氯霉素所组成的组中的一种或几种。该培养基可以含有1%体积/体积的抗生素。第一和第二方面的培养基还可以含有L-脯氨酸。在一些实施方式中，第一和第二方面的培养基含有O. 0006%重量/体积的L-脯氨酸。本发明的第三个方面提供了一种培养肌腱细胞的方法，该方法包括在本发明的第一和第二方面的培养基中培育肌腱细胞的步骤。在一些实施方式中，在10%的CO2下培养该肌腱细胞。在其它的实施方式中，该肌腱细胞在2维培养物中。在其它的实施方式中，通过胰蛋白酶和胶原酶从肌腱和/或韧带组织中获得肌腱细胞。在一些实施方式中，本发明的肌腱细胞培养方法产生充分纯的肌腱细胞培养物(例如，所有存在的细胞中至少80%为肌腱细胞，优选为至少90%，更优选为至少95%)。本发明的第四个方面提供了由本发明的第三个方面的方法培养的肌腱细胞在肌腱和/或韧带疾病治疗中的应用。在一些实施方式中，该肌腱疾病为肌腱变性(tendinosis)。在其它的实施方式中，肌腱疾病为肌腱撕裂。本发明的第五个方面提供了由本发明的第三个方面的方法培养的肌腱细胞在肌腱和/或韧带再生中的应用。本发明的第六个方面提供了由本发明的第三个方面的方法培养的肌腱细胞在肌腱和/或韧带重建中的应用。本发明的第七个方面提供了治疗肌腱和/或韧带疾病的方法，该方法包括向动物施用由本发明第三个方面的方法培养的肌腱细胞的步骤。在一些实施方式中，该肌腱疾病为肌腱变性。在其它的实施方式中，该肌腱疾病为肌腱撕裂。本发明的第八个方面提供了再生肌腱和/或韧带的方法，该方法包括向有需要的动物施用由本发明第三个方面的方法培养的肌腱细胞的步骤。 本发明的第九个方面提供了重建肌腱和/或韧带的方法，该方法包括向有需要的动物施用由本发明第三个方面的方法培养的肌腱细胞的步骤。
图I表示了逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的结果，由于检测到了胶原的I和III条带，这表明肌腱细胞在体外保持它们的表型。条带1、3和5为肌腱组织，而条带2、4和6来自体外培养的肌腱细胞。条带I和2代表I型胶原的mRNA。
具体实施例方式在详细描述优选的实施方式之前，应该理解的是，此处所用的术语仅仅是为了描述本发明的特殊的实施方式，而不是为了限定本发明的范围。此处所引用的所有出版物、专利和专利申请，不管在上文还是在下文中，引入它们的全文作为参考。但是，引用此处所提及的出版物仅仅是为了描述和公开该出版物中报道的可能在本发明中使用的方案和试剂。此处不应理解为承认本发明没有权利通过在先发明使这种公开内容的日期提前。除非有另外的说明，本发明的实施将使用本技术领域内的组织离解、细胞生物学和细胞培养的常规技术。这些技术在文献中有描述。例如，参见《细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology))) (Mayer 和Walker 主编，Academic Press, London, 1987);《细胞的分子生物学(Molecular Biology ofthe Cell))) (Alberts 等，Garland Science, New York, 2000) ;Kruse 和 Patterson 主编的《组织培养(Tissue Culture))) (Academic Press, 1977)和《动物细胞培养(Culture OfAnimal Cells)》(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.，1987)。必须注意的是，此处和随附的权利要求中所使用的单数形式“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文明确地表明相反。因而，例如提到的“一个细胞”包括多个细胞，“一个分子”指的是多个分子，等等。除非有相反的定义，此处所用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员所理解的通常意义相同。在下面的描述中，如果没有说明，应当了解的是，细胞培养技术是本领域公知的技术，并且可以采用任何这样的技术。
尽管可以使用与此处描述的材料和方法相似或者等价的材料和方法实施或试验本发明，但是此处描述的是优选的材料和方法。在一种实施方式中，本发明提供了一种肌腱细胞培养基。此处使用的术语“肌腱细胞培养基”和“培养基”可交换使用，并且指的是用于有选择地使肌腱细胞生长的营养液。本发明的培养基含有如上文和下文中所述的特定的成分，还含有其它非必要成分，这些主要取决于该肌腱细胞的动物源或含有肌腱细胞的组织和使用的培养环境，例如，细胞密度和/或最终用途。该肌腱细胞培养基通常含有有机和无机材料的混合物，并且典型地含有如下种类的一种或几种成分中的至少一种I)能源，通常以碳水化合物的形式，例如葡萄糖；2)全部的必需氨基酸，通常，20种氨基酸加上半胱氨酸构成基本的氨基酸组；3)维生素和/或其它以低浓度需要的有机化合物；
·
4)游离的脂肪酸；和5)痕量元素，其中，痕量元素定义为典型地以极低的浓度需要的无机化合物或天然存在的元素，一般以微摩尔级的量使用。该培养基可以选择性地添加如下的任意种类中的一种或多种成分I)激素和其它生长因子，例如转铁蛋白和表皮生长因子；2)盐和缓冲剂，例如钙、镁和磷酸盐；3)核苷和碱基，例如腺苷和胸腺嘧啶核苷、次黄嘌呤；和
4 )蛋白质和组织水解产物。该培养基典型地含有可商购得到的培养基，例如伊格基础培养基(Basal MediaEagle) (BME)、BGJb Medium、布瑞士特氏 BM0C-3 培养基(Brinster，s BM0C_3Medium)、CMRL培养基(CMRL Medium)、不依赖CO2的培养基、杜比科氏改进的伊格培养基(Dulbecco’ sModified Eagle Medium) (D-MEM)、F-10营养素混合物、F-12营养素混合物、格拉斯哥最低极限培养基(Glasgow Minimum Essentia Medium)、改进的Zn++选择性MEM (里克特氏改进)(Improved MEM Zn++0ption (Richter’s Modification))、伊斯蘧伍氏改进培养基(Iscove’s Modified Dulbecco's Medium)、莱波维特氏 L-15 培养基(Leibovitz，sL-15Medium)、麦蔻伊氏 5A 培养基(McCoy’s 5A Medium)(改进的)、MCDB 131 培养基(MCDB131Medium)、培养基 NCTC-109 (Medium NCTC-109)、最低极限培养基(Minimum EssentialMedia) (MEM)、改进的伊格培养基(Modified Eagle Medium) (MEM)、Opti-MEM I 还原的血清培养基(Opli-MEM I Reduced Serum Media)、RPMI 培养基 1640 (RPMIMedium
1640)、维伊冒斯氏MB 752/1培养基(Waymouth，s MB 752/lMedia)、威廉斯培养基E. (Williams Media E.)和培养基 199 (Medium 199)。本发明的肌腱细胞培养基含有胰岛素或胰岛素功能性衍生物。胰岛素是一种激素，天然存在形式的胰岛素由胰脏产生。但是，本发明使用的胰岛素可以是合成的，例如，重组胰岛素，或者是天然胰岛素。胰岛素的“功能性衍生物”是如Chan等,2000, ^Insulin-through theages:Phylogeny of a growth promoting and metabolic regulatory hormone，，(美国动物学家；可以在 http://www.findarticles.eom/p/articles/mi qa3746/is 200004/ain8899929中得到)中所述的分子，该分子具有胰岛素活性，即培养肌腱细胞的能力；该分子包括胰岛素的生物活性片段、胰岛素的变体和胰岛素的衍生物。在一些实施方式中，胰岛素的“功能性衍生物”或胰岛素的片段或胰岛素的变体具有一个或几个被20种标准氨基酸的天然存在或合成的氨基酸同系物取代的氨基酸残基。这样的同系物的例子有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸(butanoic acid)、β -丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羧基脯氨酸、甲状腺氨酸、Y-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等等。可以根据Sehon及其同事(Wie等，同上)的制备与聚乙二醇(PEG)分子共轭的胰岛素的方法，用PEG制备胰岛素的功能性衍生物。此外，可以在胰岛素的化学合成过程中加入PEG。制备胰岛素衍生物或其片段的其它方法包括还原/烷基化(Tarr，Methods of ProteinMicro-characterisation, J. E. Silver ed. , Humana Press, Clifton N. J. 155-194，1986)、酸化(Tarr,同上)、与适当的载体化学I禹合(Mishell和Shiigi, eds, Selected Methods in Cellular Immunology, W H Freeman, San Francisco, Calif. (1980),美国专利No. 4，939，239)、或适度的甲醒水处理(Marsh, 1971，Int. Arch, of Allergy and AppI.Tmmunol · , 41:199-215)。应该注意的是，术语“功能性衍生物”不包括像类胰岛素生长因子I或II这样的分子。可以在向培养基中加入待培养的肌腱细胞之前将胰岛素或功能性衍生物加入到培养基中。可选择地，可以在培养的整个过程中向培养基中加入胰岛素或功能性衍生物，例如，在细胞饲养层存在下培养细胞，该细胞饲养层如由分泌胰岛素或功能性衍生物的β细胞形成的层。此处所用的“片段”是保持胰岛素的功能的胰岛素蛋白的一部分，特别是能够支持培养的肌腱细胞的生长。胰岛素的片段的长度可以为至少约10个氨基酸残基，优选约10-16个氨基酸残基，更优选约10-20个氨基酸残基。胰岛素的“变体”是具有一处或多处取代的胰岛素分子，因此其二级构象保持不变。这样的保守性的取代包括与原有的氨基酸残基具有基本上相同的疏水性、尺寸和电荷的氨基酸。这样的取代为蛋白或肽化学领域的技术人员所公知的。例如，保守性的取代包括用脯氨酸代替甘氨酸或者相反；用丙氨酸或缬氨酸代替甘氨酸或者相反；用异亮氨酸代替亮氨酸或者相反；用组氨酸代替赖氨酸或者相反；用苏氨酸代替半胱氨酸或者相反；用谷氨酰胺代替天冬酰胺或者相反；以及用精氨酸代替谷氨酸或者相反。胰岛素的变体的另一个例子为其中的半胱氨酸残基被取代以使由二硫键导致的二聚作用最小化。优选地，半胱氨酸残基被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或谷氨酸残基取代。此外，胰岛素或胰岛素片段或胰岛素衍生物的氨基酸侧链可以被化学修饰。另一种改性方式是胰岛素的环化。本发明的培养基中的胰岛素或功能性衍生物的量一般为约0. 00005%重量/体积至0. 1%重量/体积。在一些实施方式中，胰岛素或功能性衍生物的含量为约0. 0005%重量/体积至0. 01%重量/体积。在其它的实施方式中，胰岛素或功能性衍生物的含量为约
0.0001%重量/体积至0. 001%重量/体积。在其它的实施方式中，胰岛素或功能性衍生物的含量为约0. 0006%重量/体积。在一些实施方式中，所述培养基含有糖皮质激素或类糖皮质激素分子。糖皮质激素是类固醇激素的一类，其特征在于能够与皮质醇受体结合并引发相似的作用，例如影响代谢或消炎或抑制免疫的作用。糖皮质激素可以为天然存在的激素或合成的药物。适用于本发明的合成的糖皮质激素的例子包括氢化可的松、醋酸可的松(cortisone acetate)、强的松(predisone)、强的松龙、甲基强的松龙、地塞米松、倍他米松、氟轻脱氢皮留醇、氯地米松、醋酸氟氢可的松(fludrocortisone sacetate)、醋酸脱氧皮质酮(DOCA)和醛基甾酮。“类糖皮质激素”分子可以为具有糖皮质激素活性(即具有培养肌腱细胞的能力)的任何分子。适用于本发明的类糖皮质激素分子的例子包括抗肝癌物、鱼藤酮(Youssef等,2003, J. Carcinogenesis 2:2)、利福平(Calleja 等，1998，Nat. Med.，4:92-96)、甘草阜苷(甘草的一种成分)(Kuroyanagi 和 Sato, 1966, Allergy, 15:67-75)、以及醉爺内酯(来自草药睡爺(herb withanthia somnifera)) (Grandhi 等，1994，J.EthnopharmacoI. , 44:131-135)。
在一些实施例中，该糖皮质激素为倍他米松。倍他米松是一种合成的糖皮质激素，其化学式为C22H29FO50本发明的培养基中的糖皮质激素或类糖皮质激素分子的含量一般为约O. 00001%重量/体积至O. 1%重量/体积。在一些实施方式中，糖皮质激素或类糖皮质激素分子的含量为约O. 0001%重量/体积至O. 001%重量/体积。在其它的实施方式中，糖皮质激素或类糖皮质激素分子的含量为约O. 0002%重量/体积至O. 001%重量/体积。该培养基还可以含有血清。该血清可以来自任何动物，但是一般为牛血清。在一些实施方式中，该血清为胎牛血清。该培养基中的血清的含量可以为约1%%体积/体积至30%体积。在一些实施方式中，该培养基中的血清的含量为约5%体积/体积至20%体积/体积。在其它的实施方式中，该培养基中的血清的含量为约10%体积/体积至15%体积/体积。该培养基还可以含有一种或多种抗生素。该抗生素为天然的或合成的物质，能杀灭或抑制微生物的生长。适用于本发明的培养基的抗生素的例子包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素、两性霉素、制霉圃素、多粘圃素-B、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、四环素、大环内酯、里诺霉素(linomycin)、泰妙菌素(tiamutin)和氯霉素。该培养基可以含有约0. 001%体积/体积至5%体积/体积的抗生素。在一些实施方式中，抗生素的含量为约0. 01%体积/体积至0. 05%体积/体积。在其它的实施方式中，抗生素的含量为约1%体积/体积。L-脯氨酸为脯氨酸的L-型立体异构体，是动物蛋白中常见的20种氨基酸之一。只有L-型立体异构体出现在哺乳动物蛋白中。该培养基的pH值可以为待培养的细胞能够生长的任何pH值。在一些实施方式中，该培养基的pH值为约9. O至约3. O。在其它的实施方式中，该pH值为约5. O至8. O。在其它的实施方式中，该PH值为约7. O至7. 5。在其它的实施方式中，该pH值为约7. 2。本发明的培养基可以通过本领域公知的任何方法制备。例如，可以通过将干成分溶解在水中，并调节液体的pH值到适当的值而制备。可以用众多方法中的一种进行灭菌，例如过滤或辐射。然后可以向该培养基中加入任何无菌的流态成分。然后，可以将待培养的肌腱细胞或含有肌腱细胞的组织加入到该培养基中。此处所用的术语“肌腱细胞”指的是在动物的肌腱中可见的纺锤状成纤维样细胞。肌腱细胞一般具有伸长的细胞核和薄的细胞质，常见于肌腱的胶原纤维上。通常可以根据产生I型胶原和表达标记“软骨发生早期特异性转录因子(scleraxis)”鉴定肌腱细胞。可以用各种方法从任何含肌腱细胞的组织中分离肌腱细胞，这些方法为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，可以通过常规方法从活组织检查材料中分离肌腱细胞。例如，可以从需要肌腱治疗或再生的动物的机体的任何肌腱中提取活体组织。这样的肌腱包括但不限于，屈肌腕烧骨(flexor carpi radialis)肌腱和跟骨肌腱。在一些实施方式中，该肌腱细胞或含肌腱细胞组织为“自体同源的细胞或组织”，即来自于待接受治疗的动物机体的肌腱细胞或组织。此处所用的“动物”指的是任何动物，例如人类或对人类有经济价值和/或社会价值的哺乳动物，例如，除人类之外的食肉动物(例如，猫和狗)、猪科动物(猪、大食用猪和野猪)、反刍动物(如畜牛、牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛(bison)和骆驼)、以及马。因为鸟类对人类也具有经济价值，因此，本发明还提供了对鸟类的治疗，包括治疗濒临灭绝的、动物园的和家养的鸟类，特别是驯养的禽类，例如，家禽，如火鸡、小鸡、鸭子、鹅、珍珠鸡等。因此，本发明提供了对家畜的治疗，包括但不限于，驯养的猪科动物(猪和大食用猪)、反刍动 物、马、家禽等等。该术语不表示特殊的年龄。因此，包括成年的和初生的受试者。可以从任何含肌腱细胞的组织中(如，肌腱)获得或分离肌腱细胞。肌腱是动物体内连接肌肉与骨胳的组织。该肌腱可以来自动物的任何解剖部分，可以为旋转带肌腱、冈上肌腱、肩胛下肌腱、胸大肌肌腱、腓骨肌腱、跟肌腱(achille’ s tendon)、前胫肌肌腱(tibialis anterior)、膝关节前交叉韧带、膝关节后交叉韧带、后腿肌腱、外侧韧带(lateral ligament)、内侧韧带(medial ligament)、館骨肌腱(patella tendon)、二头肌腱和三头肌腱。在一些实施方式中，将由活组织检查分离出来的肌腱组织清洗并切碎成外植块，该外植块能够在细胞培养中生长产生自由肌腱细胞。在一些实施方式中，将切碎的组织进行酶消化和/或与能和Ca2+连接或螯合的试剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))作用，细胞和细胞之间的粘接依赖于Ca2+。适用的酶的例子包括胶原酶、胰蛋白酶和蛋白酶中的一种或几种。在一种优选的方法中，在含有2. 5%重量/体积的胰蛋白酶和5. 5%重量/体积的胶原酶的不含苯酚红的标准组织培养基中培养不大于Imm的切碎的肌腱组织，在5%的CO2中37°C下培养至少3小时。在一些实施方式中，在酶消化后，活组织检查材料中的细胞通过将活体组织溶液离心并用细胞生长培养基将得到的沉淀清洗分离。可选择地，然后可以通过过滤将肌腱细胞从该肌腱的其它成分中分离出来，例如使用筛网，如150微米的无菌尼龙筛网。另一种途径是基于一些细胞类型易于强烈地吸附在塑料或玻璃上，从而将它们与吸附不强烈的肌腱的成分分离开。可选择地，可以使用与细胞特异性结合的抗体将细胞从肌腱的其它成分中分离出来，例如，使用与基体结合的或与荧光染料耦合的抗体，然后可以通过具有荧光活性的细胞分选(FACS)技术分离该抗体。然后可以将细胞加入到本发明的培养基中，在适当的条件下孵育。在一些实施方式中，分离后，在5%的CO2气氛中于37°C下将细胞培养约3天至5周。当然，培养细胞的时间周期可以改变。如上所述，本发明的培养基含有胰岛素或功能性衍生物和/或糖皮质激素或类糖皮质激素分子。肌腱细胞一般很难在细胞培养中生长，并且易于变得不稳定和去分化。但是，本发明的发明人发现胰岛素尤其能够使肌腱细胞更稳定地生长，甚至在包括软骨细胞、成纤维细胞等其它细胞的存在下的培养中也能够生长。因此，只要本发明的培养基中存在胰岛素，那么肌腱细胞就可以选择性地生长。如在其它地方所描述的，可以将胰岛素由外界加入到该培养基中。可选择地，可以通过将肌腱细胞和能够向培养基中分泌胰岛素的饲养细胞共同培养来天然地产生胰岛素。因此，在本发明的上下文中，“饲养细胞”或“供食者(feeders)”是能够分泌胰岛素的细胞，这样，共培养的肌腱细胞就能够像本发明要求的那样生长。不管肌腱细胞实际上是在无饲养细胞存在下生长还是在饲养细胞的存在下生长，在一些实施方式中，肌腱细胞达到了需要分离成一个或多个传代培养的细胞密度。每一轮的传代培养称作传代。当将肌腱细胞进行传代培养时，称为将肌腱细胞传代。肌腱细胞的特异性种群有时称作，或者特征在于，其传代的次数。例如，传代了十次的培养的细胞种群被称作PlO培养。初级培养，即 细胞从组织中分离后的首次培养，记作PO。首次传代培养之后，该细胞被称为二级培养(Pl或传代I)。第二次传代培养之后，该细胞成为三级培养(P2或传代2)，依此类推。本领域技术人员可以理解的是，在传代过程中可能有许多种群翻倍；因此培养的种群翻倍数大于传代数。传代期间的细胞的增殖(即种群翻倍数)取决于许多因素，包括但不限于，接种密度、基质、培养基、生长条件和传代间隔。优选地，本发明的方法制备了培养或传代培养的充分纯的肌腱细胞。此处所用的术语“充分纯的”指的是在培养物中，肌腱细胞是主要的细胞，其它污染性细胞(例如成纤维细胞、软骨细胞等等)的数目很少。优选地，培养物中存在的细胞的至少80%为肌腱细胞，更优选为至少90%，最优选为所有细胞中的至少95%为肌腱细胞。当得到充足数量或体积的肌腱细胞后，可以用标准方法将其存库或储存。例如，可以通过在_180°C下深低温保藏将肌腱细胞常规地储存。本发明的肌腱细胞可以在各种条件下深低温保藏,例如本领域公知的条件。重要地，优选情况下，在培养阶段或者传代后或者深低温保藏后对肌腱细胞的表型进行评定。有许多种方法评定进行了细胞培养的细胞的表型。一种方法是评定培养的细胞的形态。例如，肌腱细胞是具有伸长的细胞核和薄的细胞质的纺锤状细胞。对肌腱细胞的表型进行评定的另一种方法是确定该细胞的表达标记是否对该细胞类型具有特异性。例如，肌腱细胞表达转录因子，软骨发生早期特异性转录因子，软骨发生早期特异性转录因子是所有介导肌肉与骨骼连接的连接组织的高度特异性标记。肌腱细胞还表达分化标记,如I型胶原、III型胶原和饰胶蛋白聚糖。本领域技术人员可以理解的是，可以根据肌腱细胞最终用途对本发明的肌腱细胞进行单层或3-维培养。“单层”是只有一层细胞(2-维)。3-维培养指的是具有深度、宽度和高度的培养，例如在基质或支架上培养生长。因此，本发明还关注包括接种到基质或支架上的用于组织修复和/或再生的肌腱细胞的组合物，该肌腱细胞优选为自体同源的肌腱细胞。“接种”指的是使肌腱细胞与支持基质或支架接触，在移植前粘附(用粘合剂或不用粘合剂)在支持基质上一段时间。
在本发明的一些实施方式中，细胞只保持在支持基质的一个表面或边缘，或到特定的深度(如此处所述的)，即，细胞附着在支持基质的一个表面或与支持基质相邻，如美国
发明者郑铭豪 申请人:西澳大利亚大学