专利名称：焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
华法林是常用的香豆素类ロ服抗凝药，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病(如心肌梗死、缺血性发作和血栓栓塞性静脉炎等)以及心脏人工瓣膜置换术和人工血管移植术等术后抗凝治疗。目前临床常以凝血酶原时间(PT)及国际标准化比率(INR)作为其抗凝监测指标。但是华法林有效治疗窗很窄，个体差异大(不同患者所需剂量可相差20倍)，初始剂量很难掌握，如果剂量不足将无法预防血栓栓塞，剂量稍大则会导致出血的危险(引起致命性和严重出血发生率分别为I. 3%和7. 2%)。华法林的临床应用需要经过多次调整剂量方可达到目标INR值(范围在2. (Γ3. O之间最佳)，这个剂量摸索的时间常常需要数周。近年来随着遗传药理学与药物基因组学的快速发展，研究发现影响华法林用药剂量个体差异的主要原因是遗传因素。研究表明影响华法林代谢的代谢酶细胞色素P4502C9 (CYP2C9)和华法林的作用靶点环氧化物还原酶复合体I (VKORCl)这两个
基因单核苷酸多态性(SNP)可解释约50%的华法林用药剂量个体差异，对指导华法林合理应用具有巨大的临床指导意义。细胞色素P450酶系(CYP450S)是ー组结构和功能相关的超家族酶系，约60%的药物是由CYP450S代谢清除的。大量研究表明，CYP450S基因多态性是造成药物代谢个体和种族差异的基础。华法林主要由细胞色素P450酶系代谢，其中CYP2C9酶对华法林的代谢最为重要。华法林有两种构象R和S。其中S-华法林的作用占6(Γ70%，而R-华法林只有3(Γ40%。S-华法林主要由CYP2C9代谢成无活性的代谢产物。CYP2C9基因多态性对华法林用药剂量个体差异有显著影响。CYP2C9基因型包括CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5，其中对华法林代谢影响最重要的是*2和*3基因型。CYP2C9*31075A>C (rsl057910)突变导致CYP2C9酶活性降低，其活性仅为野生型的5 %，这种突变降低了酶活性使其底物的清除率降低，血药浓度升高。因此，需降低临床用药剂量，防止不良反应的发生。在黄种人群中CYP2C9*2的突变率几乎为零，而CYP2C9*3基因型突变率为3% 10%。维生素K在维生素K环氧化物还原酶复合物(VKORC)的作用下由环氧化形式转化为氢醌形式(KH2)，參与维生素K依赖的凝血因子II、VII、IX、X及抗凝蛋白C和S的活化。VKORC亚单位I (VKORCl)是ー种多成分脂蛋白酶系统，位于内质网膜上，是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶。VKORCl是华法林的作用靶点，华法林通过抑制其活性，阻碍维生素K由环氧化物形式转化成氢醌形式，从而阻断上述凝血因子的活化，达到抗凝作用。目前已经有了大量VKORCl基因多态与华法林剂量相关性的研究报道。在亚洲人群中研究结果显示，VKORCI的基因多态对华法林剂量差异的影响达到了 16-30%。其中VKORCl启动子的基因多态性-1639G>A (rs9923231)是影响华法林需求剂量种族差异和个体差异的主要原因。在VK0RC1-1639G>A rs9923231基因多态性中，G和A等位基因的发生频率分别为80. 5%和19. 5% ;而与A等位基因相比，G等位基因增加了近40%的酶活性。VKORCl酶活性的増加，还原性维生素K生成和凝血因子生成也増加，因此需要较高剂量的华法林才能达到抗凝效
果O综上CYP2C9和VKORCl基因多态性是影响华法林需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP2C9和VKORCl基因多态性的试剂盒将为华法林的临床个体化治疗起到积极的推动作用。尽管目前用于检测华法林用药剂量相关的基因多态性的方法比较多，如聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶酶解片段长度多态性(RFLP)、实时荧光定量聚合酶链式反应、核酸序列扩增实验法、基因芯片等，这些方法比较快速、灵敏，但准确度不够，并且交叉污染问题相对比较严重。
焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是ー种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
药物代谢酶CYP2C9和华法林作用靶点VKORCl基因多态性是影响华法林剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床华法林个体化用药治疗的用药基因CYP2C9 (SEQ ID NO. I)和VKORCl (SEQ ID NO. 2)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测华法林个体化用药相关基因SNP。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
一种焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物
(1)扩增引物
VKORCl -1639G>A (rs9923231)上游引物5、AGG GTT CAA GTG GTT CTC GT-3,(SEQ ID NO. 3)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)上游引物5Λ- AGC CAC ATG CCC TAC ACA G -3^(SEQ ID NO. 4)；
VKORCl -1639G>A (rs9923231)下游引物5、GTC AAG CAA GAG AAG ACC TG~3r(SEQ ID NO. 5)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)下游引物:5,- CCC GGT GAT GGT AGA GGT TTA-3, (SEQ ID NO. 6)；
其中，下游引物的5,进行生物素标记；
(2)测序引物
VKORCl -1639G>A (rs9923231)测序引物5、GTG AGC CAC CGC A -3 ^ (SEQ IDNO. 7)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)测序引物5、CAC GAG GTC CAG AGA TA -3^(SEQ ID NO. 8)；
试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。
一种应用上述试剂盒检测华法林用药基因多态性的方法，包括如下步骤
(O DNA提取；
(2)聚合酶链反应
配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 10. Ομ I, dNTP 3. O μ 1，上游引物I. O μ 1，下游引物I. O μ 1，rTaql.Oy 1，水30. Ομ 1，模板4. Ομ I ;按照下面的循环參数设置扩增仪95 0C 5min预变性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 65°C 30S,进行38个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4 °C，得扩增产物；
(3)焦磷酸测序单链样本纯化；
(4)焦磷酸测序及结果分析。 本发明的试剂盒对VKORCl-1639G>A (rs9923231)目标序列和 CYP2C9*3 1075A>C(rsl057910)目标序列进行分析和检测；其中，VKORCl -1639G>A (rs9923231)目标序列包括野生型 GCACCCGGCCAATGG (SEQ ID NO. 9 )和突变型 GCACCTGGCCAATGG (SEQ IDNO. 10)，扩增出的片段长度为290bp ;CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)目标序列包括野生型 CATTGACCTT (SEQ ID NO. 11)和突变型01764011' (SEQ ID NO. 12)，扩增出的片段长为210bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对华法林个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上华法林个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明VKORCl -1639GG (rs9923231)焦磷酸测序结果；
图2为本发明VKORCl -1639GA (rs9923231)焦磷酸测序结果；
图3为本发明VKORCl -1639AA (rs9923231)焦磷酸测序结果；
图4为本发明CYP2C9*3 1075AA (rsl057910)焦磷酸测序结果；
图5为本发明CYP2C9*3 1075AC (rsl057910)焦磷酸测序结果；
图6为本发明CYP2C9*3 1075CC (rsl057910)焦磷酸测序結果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :
VKORCl -1639G>A (rs9923231)上游引物5、AGG GTT CAA GTG GTT CTC GT-3, (SEQID NO. 3)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)上游引物:5,- AGC CAC ATG CCC TAC ACA G -3,(SEQ ID NO. 4)；
VKORCl -1639G>A (rs9923231)下游引物:5,-GTC AAG CAA GAG MG ACC TG-3XSEQID NO. 5)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)下游引物5r- CCC GGT GAT GGT AGA GGT TTA -3,(SEQ ID NO. 6)；
VKORCl -1639G>A (rs9923231)测序引物5、GTG AGC CAC CGC A -3^ (SEQ IDNO. 7)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)测序引物5、CAC GAG GTC CAG AGA TA -3^ (SEQID NO. 8)；
I. DNA提取
I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下
(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加こ醇，并在瓶上相应标识处打勾V ； (2)异丙醇(如无，可用无水こ醇替代)和75%こ醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。 I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本卩隹一性标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6盖上Eppendorf管盖，室温孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室温离心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；
I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管ロ弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；
1.11移取30011しNuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；
I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管ロ弃去上清；
I. 17移取300uL 75%こ醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
I.18 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管ロ弃去上清；
I.20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；
I.21目测沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度測定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入こ醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；1.24保存核酸标本至4°C冰箱；
2.聚合酶链反应
2.1在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物 (1)扩增引物上游引物5r- AGG GTT CAA GTG GTT CTC GT -3,；5^-AGC CAC ATG CCC TAC ACA G-3^ ； 下游引物GTC AAG CAA GAG AAG ACC TG -3^ ；5^-CCC GGT GAT GGT AGA GGT ΤΤΑ-3Λ ；其中，下游引物的5,进行生物素标记； (2)测序引物5r~GTG AGC CAC CGC A -3,； 5r~ CAC GAG GTC CAG AGA TA -3、
2.ー种应用权利要求I所述的试剂盒检测华法林个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤 (O DNA提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 10. 0μ I, dNTP 3. O μ 1，上游引物I. O μ 1，下游引物 I. Ομ I, rTaql. Ομ 1，水 30. Ομ 1，模板4· Ομ I ;循环程序为:95 oC 5min预变性；依次在95°C 30S，52°C 30S，65°C 30S，进行38个循环;72°C保持5min，最终保持在4 °e，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性试剂盒及方法。所述试剂盒对华法林用药相关基因进行分型，包括VKORC1-1639G>A(rs9923231)和CYP2C9*31075A>C(rs1057910)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.3—8所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量VKORC1-1639G>A和CYP2C9*31075A>C的检测，从而达到对华法林用药实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102676666SQ20121013535
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏