专利名称：一种利用琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸的方法。
背景技术：
丁二酸(succinic acid)又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1，4_ 丁二醇、四氢呋喃、Y-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转 化可再生资源(葡萄糖、木糖等)，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillumsucciniciproducens'ActinobaciIlus succinogenes^Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。芭蕉芋(Canna edulis Ker.)，又称蕉藕、姜芋等，为蕉科、美人蕉属中的一种单子叶块根植物，主要分布于我国南方的云南、贵州、四川、广西、海南等省区。芭蕉芋的主要成分为淀粉，其含量高达17%_18%，亩产为2 500-5 500 kg。芭蕉芋干片化学组成为淀粉66. 0%,灰分 2. 80 %，粗纤维 2. 65%,脂肪 0. 28%，蛋白质 3. 63 %，单宁 0. 19 %，水分 17. 10%。由于芭蕉芋适口性较差，传统上仅用作饲料，尚未得到很好的开发利用。发酵是一种复杂的生化过程，受很多因素的影响，如菌体自身的生产性能、培养基的配比、种子的质量、发酵条件和发酵过程控制等都与目的产物的产出有密切的关系。在工业生产中，为了最大限度的发挥菌体的生产能力，应该提供最优的生产培养基和培养条件。因此，探索菌株高产特性充分表达的最优培养条件是发酵生产的基础和关键。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种利用琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸的方法，以芭蕉芋糖衆为主要原料，利用琥拍酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes) CICC11014发酵生产丁二酸，通过对菌株培养基的研究，确定了菌株最适的发酵培养基优化后发酵培养基芭蕉芋糖浆(以总糖计)89. 66 g/L, CSL 38. 55 g/L, Na2HPO4 Iffi2O 2. 23 g/L,KH2PO4 *3H20 2. 23 g/L,MgCO3 60 g/L, pH 6. 5，115°C湿热灭菌 20 min。此最优培养基条件下发酵可以提高糖的转化率，使丁二酸的产量达到70 g/L。I. 一种利用琥珀酸放线杆菌CICC11014发酵产丁二酸的方法，其特征在于用芭蕉芋糖浆做碳源，将培养基装于100 mL厌氧瓶中(装液体积50 mL)，接种量5%，充入100%C02。每个实验做3个平行样，取平均值并计算误差。2.步骤I所述的芭蕉芋糖浆的制备取芭蕉芋块茎(产地中国四川省)，切片、烘干后在粉碎机上打碎，加水浸泡2 h;调pH 6. 7，加高温淀粉酶(无锡赛德酶制剂厂)20U/g干粉，105°C液化20-40 min;再降温至60°C，调pH 4. 5，加入糖化酶300 U/g干粉，糖化8-12 h，再经过过滤得芭蕉芋糖浆，糖浆含总糖15%-20% ( w/w)。3.步骤I所述的种子培养基葡萄糖10 g/L，酵母膏15 g/L, Na2HPO4 *12H20 I g/LjKH2PO4 *3H20 I g/L，121°C湿热灭菌20 min 后冷却，并加入5%膜滤后的 I mol/L NaHCO3,以缓冲培养时种子液的pH变化。4 步骤I所述的初始发酵培养基芭蕉芋糖浆(以总糖计)65 g/L，玉米浆(CSL，固形物含量 55%) 20 g /L，Na2HPO4 Iffi2O I g /L，KH2PO4 3H20 I g /L，MgCO3 60 g/L, pH 值 6. 5，115°C湿热灭菌 20 min。5.步骤4所述的具体培养基优化方法是，进行碳源实验时，除总糖按照实验浓度夕卜，其他成分与初始发酵培养基相同；氮源实验时，除氮源按照实验浓度外，碳源按照最优浓度外，其他成分与初始发酵培养基相同；CSL实验时，除碳源浓度和氮源浓度按照最优浓度外，其他成分与初始发酵培养基相同；磷酸盐实验时，除磷酸盐浓度(2种磷酸盐浓度总和)按照实验浓度外，碳源、氮源和CSL浓度按照最优浓度，其他成分与初始发酵培养基相同。6.步骤5所述的方法，其特征在于最佳碳源浓度为80 g/L。7.步骤5所述的最佳氮源为CSL。8.步骤6所述的最优CSL浓度为30 g/L。9.步骤5所述的最佳磷酸盐浓度为6 g/L。
图I不同碳源浓度对发酵生产丁二酸的影响。图2不同氮源对芭蕉芋糖浆发酵生产丁二酸的影响。图3不同CSL浓度对芭蕉芋糖浆发酵生产丁二酸的影响。图4不同磷酸盐浓度对芭蕉芋糖浆发酵生产丁二酸的影响。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本专利所用的菌株为琥珀酸放线杆菌CICC11014，购自于ATCC，编号为55618。实施例I
本实施例说明不同碳源浓度对发酵生产丁二酸的影响，分别以葡萄糖和芭蕉芋糖浆为不同碳源，按照总糖浓度20 g/L, 40 g/L, 60 g/L, 80 g/L和100 g/L配制发酵培养基，比较A. succinogenes CICC11014对色蕉芋糖衆和葡萄糖的利用情况,实验结果如图I所示。图I结果表明，A 利用色蕉芋糖衆作为碳源的效果要明显好于葡萄糖。使用葡萄糖做碳源时，以初始发酵培养基含60 g/L总糖时丁二酸产量为最高，达到36. 45 g/L;而使用芭蕉芋糖浆做碳源时，以初始发酵培养基含80 g/L总糖时丁二酸产量为最高，达到52. 14 g/L。实施例2
本实施例说明不同氮源对芭蕉芋糖浆发酵生产丁二酸的影响，其中发酵培养基中各有机或无机氮源的添加量以相同的氮元素含量为基准，分别为NH4C1 4.5 g/L, KNO3 8 g/L,酵母膏12. 5 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米浆(CSL) 20 g/L (固形物含量55%)，胰酪胨大豆胨蛋白(TSB) 15 g/L，牛肉膏12 g/L，空白(不加入任何氮源)。
由图2可以看出，当不加入任何外加氮源时，利用芭蕉芋糖浆发酵能够产生13.69 g/L的丁二酸；而在相同条件下使用葡萄糖发酵时则几乎不产生丁二酸(数据未列出)。这种现象说明，在芭蕉芋糖浆中除了含有丰富的碳源外，还含有一些能够被Asuccinogenes利用的氮源营养物质,从而促进了菌体的生长和产酸。该菌对无机氮源的同化作用较差，几乎不能利用无机氮源。当发酵培养基中外加入各有机氮源时，以CSL( 20 g/L)的产丁二酸量为最高(62.32 g /L)。虽然酵母膏的产酸量与CSL基本相当，但由于酵母膏的价格较高，考虑到今后工业化生产成本，在以后的实验中均采用CSL作为发酵培养基的氮源添加物。实施例3
本实施例说明不同CSL浓度对芭蕉芋糖浆发酵生产丁二酸的影响，使CSL浓度分别为10 g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L，发酵后测定丁二酸含量。由图2可知，CSL浓度为30 g/L时，丁二酸产量最高为68. 42 g/L。实施例4
本实施例说明不同磷酸盐浓度对芭蕉芋糖浆发酵生产丁二酸的影响，在上面其他最优条件下，在初始发酵培养基中分别添加磷酸盐浓度分别为0 g/L, I. 5 g/L, 6 g/L, 10. 5 g/L，15 g/L，发酵后测定丁二酸含量。图4可以看出，磷酸盐浓度为6 g/L时丁二酸产量最高为70 g/L。
权利要求
1.一种利用琥珀酸放线杆菌CICC11014发酵产丁二酸的方法，其特征在于用芭蕉芋糖浆做碳源，将培养基装于100 mL厌氧瓶中，接种量5%，充入100% CO2 ;每个实验做3个平行样，取平均值并计算误差。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于芭蕉芋糖浆的制备取芭蕉芋块茎，切片、烘干后在粉碎机上打碎，加水浸泡2 h;调pH 6. 7，加高温淀粉酶20 U/g干粉，105°C液化20-40 min;再降温至60°C，调pH 4. 5，加入糖化酶300 U/g干粉，糖化8-12 h，再经过过滤得芭蕉芋糖浆，糖浆含总糖15%_20% ( w/w)。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于种子培养基葡萄糖10g/L，酵母膏15 g/L, Na2HPO4 12H20 I g/L, KH2PO4 3H20 I g/L，121°C湿热灭菌 20 min 后冷却，并加入 5%膜滤后的I mol/L NaHCO3，以缓冲培养时种子液的pH变化。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于初始发酵培养基芭蕉芋糖浆(以总糖计)65 g/L，玉米浆(CSL，固形物含量 55%) 20 g /L，Na2HPO4 12H20 I g /L，KH2PO4 3H20I g /L，MgCO3 60 g /L, pH 值 6. 5，115°C湿热灭菌 20 min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于进行碳源实验时，除总糖按照实验浓度外，其他成分与初始发酵培养基相同；氮源实验时，除氮源按照实验浓度外，碳源按照最优浓度外，其他成分与初始发酵培养基相同；CSL实验时，除碳源浓度和氮源浓度按照最优浓度夕卜，其他成分与初始发酵培养基相同；磷酸盐实验时，除磷酸盐浓度(2种磷酸盐浓度总和)按照实验浓度外，碳源、氮源和CSL浓度按照最优浓度，其他成分与初始发酵培养基相同。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于碳源浓度为80g/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于为CSL实验。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于CSL浓度为30g/L。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于磷酸盐浓度为6g/L。
全文摘要
本发明提供了一种利用琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸的方法，以芭蕉芋糖浆为主要原料，利用琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)CICC11014发酵生产丁二酸，通过对菌株培养基的研究，确定了菌株最适的发酵培养基优化后发酵培养基:芭蕉芋糖浆(以总糖计)89.66g/L，CSL38.55g/L，Na2HPO4·12H2O2.23g/L，KH2PO4·3H2O2.23g/L，MgCO360g/L，pH6.5，115℃湿热灭菌20min。此最优培养基条件下发酵可以提高糖的转化率，使丁二酸的产量达到70g/L。
文档编号C12R1/01GK102643873SQ20121013506
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者张斌 申请人:苏州百趣食品有限公司