猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪血清检测技术领域，尤其是一种猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检 测方法。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种呼吸道传染病，以急性出血性纤维素性胸膜炎和慢性 纤维素性坏死性肺炎为特征。该病自1957年在英国发现以来，已在世界范围内广泛流行， 成为国际上公认的危害现代猪业的五大疫病之一。该病虽在我国发现较晚，但对养殖业危 害较为严重，已成为我国病猪业中呼吸道病的三大常发病之一。
[0003] 猪胸膜肺炎放线杆菌的现有检测方法很多，大致可以分为三大类，即病原学诊断 方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学诊断方法需要细菌分离、培养和鉴定， 周期较长；血清学诊断方法包括补体结合反应、荧光抗体、间接血液凝集试验和酶联免疫吸 附试验（ELISA)等，血清学诊断方法的缺点是只能检测动物体内胸膜肺炎放线杆菌的抗体 而无法检测病原；分子生物学诊断方法主要包括反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)与荧光 核酸探针，分子生物学方法比前两种方法快速、灵敏，但需要使用特殊的仪器，如PCR仪，而 荧光探针的制备比较昂贵，不适于基层应用。
[0004] 但是，有时通过上述检测方法单一使用进行检测时，经常检测结果不稳定，有时会 出现误差，这也给猪的养殖及防病、抗病带来了极大的不便。
[0005] 通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种方法简便、检测结果准备、 灵敏度高的猪血清中胸膜肺炎放线杆菌的检测方法。
[0007] 本发明实现目的的技术方案是：
[0008] -种猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，步骤如下：
[0009] ⑴随机抽取规模场的仔猪及育肥猪血清样品；
[0010] ⑵间接血凝试验检测待检猪血清中的猪胸膜肺炎放线杆菌抗体
[0011] ①将猪胸膜肺炎放线杆菌间接血凝试剂盒中的阴阳性对照、抗原恢复室温；
[0012] ②在V型110度板上进行微量间接血凝试验，200倍倍比稀释血清，做阴阳性对照， 加样处理好后放入36~38°C恒温箱中静置1. 5h后观察判断结果，猪血清中检测到猪胸膜 肺炎放线杆菌，检测结果即为阳性；
[0013] ⑶猪胸膜肺炎ELISA试剂盒检测待检猪胸膜肺炎放线杆菌抗体；
[0014] ①将试剂盒取出，盒内试剂恢复室温并充分摇匀；
[0015] ②将200倍稀释后的样本和对照加入板孔中，每孔51uL，阴阳性对照均为双份；
[0016] ③盖上膜，36~38°C维持55~65min ;
[0017] ④去膜，用260uL的洗液清洗5次，最后一次在吸水纸上将平板拍干；
[0018] ⑤每孔加5 luL酶标抗体；
[0019] ⑥重复步骤③；
[0020] ⑦重复步骤④；
[0021 ] ⑧加入51uL底物溶液，轻摇2. 5秒；
[0022] ⑨将平板放入黑暗中在23°C作用20min ;
[0023] ⑩加入51uL终止液，轻摇2. 5s，12min内在405nm下读数并记录结果，判定标准根 据试剂盒使用说明书判定，猪血清中检测到猪胸膜肺炎放线杆菌，检测结果即为阳性；
[0024] ⑷步骤⑴及步骤⑵的检测结果均为阳性，则猪血清中检测到猪胸膜肺炎放线杆 菌。
[0025] 而且，所述步骤⑴中猪胸膜肺炎放线杆菌间接血凝试剂盒购自兰州兽医研究所。
[0026] 而且，所述步骤⑵中猪胸膜肺炎ELISA试剂盒购自法国LSI公司。
[0027] 本发明的优点和积极效果是：
[0028] 本发明检测方法采用APP间接血凝试验与APP ELISA试验的联合使用，使得猪胸 膜肺炎放线杆菌的检测结果更为准确、可靠、快速、灵敏，检测结果稳定，不会出现误差，而 且检测方法成本低廉，方法简单，适于基层应用，给猪的养殖及防病、抗病带来了极大的便 利，同时也大大节约了养殖户的生产成本，提高了养殖户的经济效益。
【具体实施方式】
[0029] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0030] 本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂及试剂盒， 如无特殊说明，均为市售产品。
[0031] 本发明检测方法的总体思路是：对随机抽取规模场的仔猪及育肥猪血清样品，首 先对采集的血清样品进行IHA (间接血凝试验）方法检测，然后对采集的血清样品进行APP ELISA试验复检，统计实验室检测结果，分析确定猪传染性胸膜肺炎的情况。
[0032] -、检测前的准备
[0033] 1、猪血清材料采集地点：石家庄地区。
[0034] 2、猪血清材料采集对象：我市54家未接种过传染性胸膜肺炎疫苗的规模性猪场， 随机抽仔猪和育肥猪血清样品，详见表1 :
[0035] 表1猪传染性胸膜肺炎血液样本采集分布
[0036]
[0037] 3、APP间接血凝试剂盒购自兰州兽医研究所。
[0038] 4、APP ELISA试验试剂盒购自法国LSI公司。
[0039] 二、对上述猪血清中猪胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，步骤如下：
[0040] ⑴间接血凝试验（IHA)检测待检猪血清中的APP抗体
[0041] ①将APP间接血凝试剂盒中的阴阳性对照、抗原恢复室温；
[0042] ②在V型110度板上进行微量间接血凝试验，200倍倍比稀释血清，做阴阳性对照， 加样处理好后放入37°C恒温箱中静置1. 5h后观察判断结果；
[0043] ③判定标准根据兰州兽医研究所《猪传染性胸膜肺炎间接血凝试验诊断抗原说明 书》。
[0044] ⑵猪胸膜肺炎ELISA试剂盒（APP-Ab)检测待检APP抗体；
[0045] ①将试剂盒取出，盒内试剂恢复室温并充分摇匀；
[0046] ②将200倍稀释后的样本和对照加入板孔中，每孔51uL，阴阳性对照均为双份；
[0047] ③盖上膜，37°C维持60min ;
[0048] ④去膜，用300uL的洗液清洗5次，最后一次在吸