专利名称：山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于动物检验检测技术领域，涉及对山羊接触传染性胸膜肺炎抗体快速准确诊断领域，具体说是一种山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条，本发明还包含有该试纸条的制备方法。
背景技术：
山羊接触传染性胸膜肺炎(contagious caprine plueropneumonia CCPP)是由山羊支原体山羊月市炎亚禾中(i^Fco/^asma capricolum subsp. ca/7ri/7/7<9tt 9/7ia<9 Mccp)弓|起的一种高度接触性传染性疾病。国际兽医局(OIE)将其列为羊的B类传染病。截止目前，世界上有苏丹、印度、巴基斯坦、土耳其、叙利亚、肯尼亚、埃塞俄比亚等40多个国家报道该病的发生(0IE，2008)。我国于1935年在内蒙古百灵庙地区曾流行过山羊的“烂肺病”。后来又在山西、河北、山东、湖北、云南、江西、新疆以及内蒙等地均有本病的发生(邱明亮，1950 ； 房晓文，1958 ；吴光先，1963 ；李天华，1985)。近年来，随着我国山羊养殖业的发展，在贵州、福建、山东、内蒙古等地陆续报道有疑似CCPP的发生(潘淑惠，2002 ；2007，辛九庆；余松青，2009 ；德淑凤，2010)。据资料记载此病感染山羊发病率为19% 90%，死亡率约为 40% 100%。目前，CCPP是影响中亚、北非、中东等国家和地区山羊养殖业的重要疾病之一， 所以该病的早期诊断和早期预防治疗尤为重要。Mccp由于在体外培养时对营养要求苛刻，生长缓慢，所以Mccp的分离鉴定比较困难。PCR等病原检测方法，需要特殊的设备和技术，所以在基层不易使用。建立一种敏感、 特异的快速血清学诊断方法亟待解决的问题。目前，国际上主要有4种Mccp的血清抗体检测方法，分别为补体结合试验(Complement fixation test CFT)、间接血凝试验(Indirect haemagglutination test IHAT)^ ! ^: ^ (Latex agglutination test IJVT)禾口竞争酶链免疫吸附试验。上述诊断方法在防制Mccp起到了一定的有效作用，但其仍存在
不足之处Φ补体结合试验用补体结合试验测定Mccp感染，此试验是国际贸易指定试
验。这项试验虽然特异性较高，但敏感性较差，其主要的缺点是需要有高水平的技术经验者
操作(Sharew，Staak，&Thiaucourt，2005)；②间接血凝试验IHA试验已用于由Mccp
引起的CCPP的临床诊断和群体发病情况调查(Cho，Ruhnke &Langford，1976)。 本试验最常用新鲜的或戊二醛处理的红细胞，前者较敏感，重复性较差，而且每次试验都要用抗原
致敏红细胞；后者比较实用但敏感性低。 乳胶凝集试验LA试验用Mccp产生并存在于
培养物上清液中的CPS致敏乳胶颗粒，已用于玻片凝集试验(Ruranginra，McGuire, Kibor &Chema, 1987 ;Houshaymi, Tekleghiorghis, ffilsmore, Miles, &Nicholas,2002)。 Rurangirwa,Kouyate和Niang( 1990)使用CPS作为抗原致敏乳胶颗粒，用来检测Mccp引起的CCPP。在肯尼亚，这种乳胶凝集试验已经作为常规检测Mccp抗体的方法。但敏感性相对ELISA和金标诊断方法较差。④竞争酶联免疫吸附试验此方法虽然能有效的用于Mccp
感染后长期抗体检测(Thiaucourt, Bolske, Libeau, LeGoff, &Lefevre, 1994 ；Sharew, 2005 )，但其敏感性太过，往往引起假阳性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足之处，提供一种山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条及其制备方法。本发明的技术问题通过下述技术方案解决
一种山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条，由PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、 金标垫、样品垫5部分组成，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上左端喷有抗山羊支原体山羊肺炎亚种IgG作为质控线，右端喷有山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原作为检测线；所述的金标垫上喷有胶体金标记山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原。所述金标垫上喷的胶体金标记山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种纯化的多糖抗原。所述检测线喷有的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种纯化的多糖抗原。所述山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条由以下步骤制备而成
a、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
b、胶体金标记的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原制备首先将a步制备的胶体金用0. lmol/L KCO3调整pH值为6. (Γ7. O ；然后用目测法确定胶体金与待标记多糖抗原应标记的最佳量，得到最佳标记量为广3. %ig/100ml，在胶体金溶液中按广3. 4mg/100ml加入山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，静置30min ；将上述胶体金经2500r/min离心30min，除去沉淀物，得上清液；将上清液经lOOOOr/min离心30min，弃去上清收集沉淀物，将沉淀物悬浮于1/10倍初始胶体金体积的金胶缓冲液中，置4°C保存；
c、组装抗体检测试纸条。本发明将纯化的IgG和多糖抗原点样于硝酸纤维素膜上，分别作为质控线和检测线，将多糖抗原吸附于玻璃纤维制成金标垫，从而组装成胶体金试纸条。根据检测线和质控线是否出现色带来确定血清中是否存在山羊接触传染性胸膜肺炎抗体。用本发明的试纸条检测，简便、快速、准确，适用于基层、流调、隔离检疫和快速检测，便于及时淘汰感染羊，减少经济损失，有效控制该病的发生。目前国内外尚无将胶体金诊断试纸应用到检测Mccp引起的CCPP感染方面的报道。本发明用胶体金标记的多糖抗原，最佳标记量为广3.%ig/100ml ；用多糖抗原包被硝酸纤维膜，建立了检测山羊接触传染性胸膜肺炎抗体的胶体金免疫层析法，用建立的抗体检测试纸条在5 10分钟即可获得结果，用山羊支原体山羊肺炎亚种标准阳性和阴性血清进行5次重复试验，结果一致；用制备的试纸条对27份山羊接触传染性胸膜肺炎临床血清样品进行检测，初步结果与间接血凝试验进行比较，阳性符合率为90. 6% ；对绵羊肺炎支原体阳性血清、山羊支原体山羊肺炎亚种阳性血清进行检测，结果均为阴性，结果表明本发明的试纸条具有很好的特异性。本发明的优点具体表现在以下几方面①检测快捷迅速，大大缩短检测时间；②敏感性高、特异性强；③安全简便，不需任何仪器和设备。免疫胶体金检测方法不需任何仪器和设备，只需制备好的试纸条或试剂盒即可，由于胶体金本身具有颜色，比ELISA省略了加显示剂和终止液的步骤，大大简化了操作，更适合于野外临床的现场应用。因为没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与，所以也不会污染环境， 具有放射性同位素或酶标等检测方法所无法比拟的安全性。
图1为本发明试纸条结构示意图； 图2为试纸条阴性结果示意图； 图3为试纸条阳性结果示意图。
具体实施例方式如图所示一种山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条，由五个部分组成PVC 衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫。PVC衬板1设在最底部，衬板1上部中段设有硝酸纤维素膜2，硝酸纤维素膜2上部左端贴有吸收垫3，硝酸纤维素膜2上部右端设有金标垫4，金标垫4的上部右端设有样品垫5。所述的试纸条组装操作按如下步骤进行
1)硝酸纤维素膜(2)黏附于PVC背衬底板上，*^ 33mm;
2)黏附吸收垫(3)，长25mm，并与硝酸纤维素膜(2)重叠2mm;
3 ) 5mm长的金标垫(4 )与硝酸纤维素膜(2 )右端重叠2mm ；
4)样品垫(5)长20mm，与金标垫(4 )右端重叠2mm;
5)用切条机将组装好的试纸切割成4mm宽的条形带，密封干燥保存。实施例1
1、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。2、胶体金标记的多糖抗原制备首先将步骤1制备好的胶体金用O.lmol/L KCO3 调整PH值为6.0 ；然后用目测法确定胶体金与待标记多糖抗原应标记的最佳量，得到最佳标记量为lmg/100ml，在胶体金溶液中按lmg/100ml加入山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，静置30min ；将上述胶体金经2500r/min离心30min，除去沉淀物，得上清液；将上清液经lOOOOr/min离心30min，弃去上清收集沉淀物，将沉淀物悬浮于1/10倍初始胶体金体积的金胶缓冲液中，置4°C保存；金胶缓冲液为含5%。蔗糖、1%BSA、0. 5%o PEG20000、 0. 5%o Tween-20 的磷酸盐缓冲液，浓度 0. 02mol/L、pH7. 4。3、抗体检测试纸条的组装
3. 1制备含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜用0. 15M的磷酸盐缓冲液pH7. 2分别将山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种IgG浓度调至2. Omg/ml 和1. 8mg/ml工作浓度，分别按0. 90ml/cm设置喷膜，将上述两种抗体喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控线与检测线，37°C烘干或室温自然干燥后，置于封闭液中浸泡lOmin，取出后室温自然干燥，保存备用；上述封闭液为含2. 5%犊牛血清，0.5%。Tween-20的磷酸盐缓冲液， 浓度 0. 02mol/L、pH7. 4。3.2制备胶体金垫取玻璃纤维纸，按27ml /cm将胶体金标记的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用。3. 3试纸条的组装在PVC背衬板1上由上至下分别将样品垫5、胶体金垫4，包括检测线7、质控线6的硝酸纤维素膜2以及吸收垫3按顺序装配，切割成4mm宽的条状，即制成山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条。
实施例2
1、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
2、胶体金标记的多糖抗原制备首先将1步制备的胶体金用0.lmol/L KCO3调整pH 值为7. 0 ；然后用目测法确定胶体金与待标记多糖抗原应标记的最佳量，得到最佳标记量为3. %ig/100ml，在胶体金溶液中按3. 4mg/100ml加入山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原， 静置30min ；将上述胶体金经2500r/min离心30min，除去沉淀物，得上清液；将上清液经 10000r/min离心30min，弃去上清收集沉淀物，将沉淀物悬浮于1/10倍初始胶体金体积的金胶缓冲液中，置4°C保存；金胶缓冲液为含15%。蔗糖、1%BSA、1%。PEG20000、1%。Tween-20 的磷酸盐缓冲液，浓度0. 02mol/L、ρΗ7· 4。3、抗体检测试纸条的组装
3、1制备含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜用0. 15Μ的磷酸盐缓冲液ρΗ7. 2分别将山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种IgG浓度调至2. 4mg/ml 和2. 0mg/ml工作浓度，分别按0. 90ml/cm设置喷膜，将上述两种抗体喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控线与检测线，37°C烘干或室温自然干燥后，置于封闭液中浸泡lOmin，取出后室温自然干燥，保存备用；上述封闭液为含5%犊牛血清，1%。Tween-20的磷酸盐缓冲液，浓度 0. 02mol/L、pH7. 4。3.2制备胶体金垫取玻璃纤维纸，按27ml /cm将胶体金标记的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用。3. 3试纸条的组装同实施例1。
权利要求
1.一种山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条，由PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫五部分组成，其特征在于所述的硝酸纤维素膜(2)上左端喷有抗山羊支原体山羊肺炎亚种抗体IgG作为质控线(6)，右端喷有山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原作为检测线(7)；所述的金标垫(4)上喷有胶体金标记山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原。
2.根据权利要求1所述的山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条，其特征在于所述金标垫(4)上喷的胶体金标记山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种纯化的多糖抗原。
3.根据权利1要求所述的山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条，其特征在于所述检测线(7)喷有的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种纯化的多糖抗原。
4.一种制备如权利要求1所述山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条的方法，其特征在于由以下步骤制备而成胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；胶体金标记的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原制备首先将a步制备的胶体金用 0. lmol/L KCO3调整pH值为6. (Γ7. 0 ；然后用目测法确定胶体金与待标记多糖抗原应标记的最佳量，得到最佳标记量为广3. %ig/100ml，在胶体金溶液中按广3. 4mg/100ml加入山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，静置30min ；将上述胶体金经2500r/min离心30min，除去沉淀物，得上清液；将上清液经lOOOOr/min离心30min，弃去上清收集沉淀物，将沉淀物悬浮于1/10倍初始胶体金体积的金胶缓冲液中，置4°C保存；c、组装抗体检测试纸条。
全文摘要
一种山羊接触传染性胸膜肺炎抗体检测试纸条，由PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫组成。硝酸纤维素膜上左端喷有抗山羊支原体山羊肺炎亚种IgG作为质控线，右端喷有山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原作为检测线；金标垫上喷有胶体金标记山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原。制备工艺为a胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；b胶体金标记的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原制备；c组装抗体检测试纸条。本发明根据检测线和质控线是否出现色带来确定血清中是否存在山羊接触传染性胸膜肺炎抗体。本试纸条检测简便、快速、准确，适用于基层、流调、隔离检疫和快速检测，便于及时淘汰感染羊，控制病情发生，减少经济损失。
文档编号G01N33/531GK102445535SQ201110297510
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者储岳峰, 贺英, 赵萍, 逯忠新, 高珊, 高鹏程 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所