一种不含抗性标记的猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途

一种不含抗性标记的猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种不含抗性标记的猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途，还公开了一株用于制备该疫苗的不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型三基因缺失株，属于细菌基因工程【技术领域】。本发明公开的不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型三基因缺失株APPΔclpPΔapxⅡCΔfur，是采用定向同源重组技术将胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus?pleuropeumoniae，APP）中的蛋白酶ClpP、ApxⅡ毒素激活因子ApxⅡC和铁吸收调节蛋白Fur的编码基因灭活得到的菌株，破坏了ClpP、ApxⅡC和Fur蛋白的表达。本发明得到的三基因缺失株比亲本株毒力小，毒力降低100倍以上，对动物安全；免疫猪后可以对APP不同血清型强毒菌株攻击提供良好保护力，保护率均在80%以上，可以作为弱毒活疫苗用于猪传染性胸膜肺炎的免疫预防。
【专利说明】一种不含抗性标记的猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种不含抗性标记的猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其用途，特别涉及由一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌ClpP蛋白酶、Apx II C和Fur三基因缺失株制备得到的猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗及其在防治猪传染性胸膜肺炎中的用途，属于细菌基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种高度传染性、致死性的呼吸道传染病。目前该病已在世界各国广泛流行，造成巨大的经济损失，成为国际公认的危害现代化养猪业的重要传染病之一。随着我国现代养殖业规模化、集约化的发展，本病的发生呈爆发趋势，有的猪场的阳性率已达到70%以上，严重阻碍了我国养猪业的健康发展。
[0003]根据APP表面荚膜(CPS)和脂多糖(LPS)抗原性的不同，可将APP分为15个血清型，血清I型又分为Ia和Ib两个亚型，血清5型又分为5a和5b两个亚型。目前在我国已发现并分离到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多种血清型，主要流行的血清型为1、3、5和7 型。
[0004]Apx毒素是APP最主要的毒力因子。目前在APP所有的15个血清型中共发现了 4 种Apx毒素，分别为Apx 1、Apx I1、Apx III和Apx IV。APP不同的血清型产生不同的Apx毒素，其中血清7型含有Apx II和Apx IV。
[0005]Apx毒素操纵子的典型结构含有完整的CABD基因；其中，A基因编码Apx毒素结构蛋白，开始合成时没有毒素活性，C基因编码Apx毒素激活蛋白，负责对结构蛋白进行乙酰化激活，形成ApxC-ApxA复合体，毒素活性随之产生。B基因和D基因的编码蛋白形成跨膜通道，负责Apx毒素的转运和分泌。Apx I和Apx III操纵子有完整的CABD基因，而Apx II操纵子缺少B基因和D基因，其产物由Apx I的BD基因编码产物负责转运分泌到细胞外。本发明缺失的ApxIIC是ApxIIA毒素的激活蛋白，该基因缺失后ApxII毒素将失去毒性，突变株的毒力大大下降。
[0006]生物被膜(Biofilm)是在生物体内和非生物体表面集聚生长的由细菌及其产生的多糖蛋白复合物所形成的固定细菌群落，它是病原菌持续感染、产生耐药性和免疫逃逸的重要原因之一。APP长期潜伏于猪体内常常引起持续性感染，近年来获得的许多临床分离株具有多重耐药性，并且较普遍地能形成生物被膜，被认为在APP致病过程中发挥重要作用。
[0007]生物被膜的产生是一个高度复杂的、由多种基因调控的动态过程，这些基因涉及到细菌的黏附、新陈代谢、群体感应(quorum sensing)和应激反应(stress response)等。 近年来对病原菌应激反应与感染性疾病的研究发现，ClpP蛋白酶这一应激蛋白是一种十分重要的毒力因子，它是ATP依赖的丝氨酸蛋白酶，调节着细菌对环境各种压力的适应(如热休克、营养缺陷、氧化应激等)，维持细菌的形态和毒力，使其在各种环境下得到保护。研究发现该基因的插入突变或缺失通常会降低细菌对不良因素的承受能力，菌体生长被破坏，存活力下降，并影响生物被膜形成，造成毒力减弱。本发明将ClpP蛋白酶基因缺失，使突变株毒力减弱。
[0008]铁是细菌生长的必需元素，通常由于动物机体内的游离态Fe离子很少，不能满足细菌生长的需求。为了适应体内这种低Fe离子浓度下的生存条件，使得细菌产生了各种机制以摄取足够的铁。其中铁吸收调节蛋白Fur是影响细菌铁吸收的一个重要调控蛋白，调控着许多转铁蛋白的表达，进而影响细菌的生存和致病力，是重要毒力因子。研究还发现该基因的插入突变或缺失通常会降低细菌在宿主动物定殖力。目前虽然仅探索了少数病原菌Fur蛋白的功能，但在揭示致病机理和疫苗研究中已经显示出极为重要的研究价值和疫苗应用前景。本发明将Fur调控蛋白基因缺失，使突变株毒力进一步减弱。
[0009]目前应用的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型感染引起的临床症状并降低死亡率，但不能阻止肺部病变和慢性感染，对异源血清型的感染也不能提供很好的交叉保护，而自然感染或试验感染能够诱导对任何异源血清型的保护。因此，高效的弱毒疫苗的研制开发将是解决当前胸膜肺炎疫苗不足的一种可行方法。
[0010]鉴于上述背景，构建我国流行的APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失株，研究其遗传特性、生长特性、毒力、对动物的安全性和保护效力等生物学特性，为猪传染性胸膜肺炎的防治、其它呼吸道传染病的疫苗研究奠定重要的基础。

【发明内容】

[0011]本发明的目的之一在于获得一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌clpP、apx II C和fur三基因缺失株。
[0012]本发明提供的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株，是将猪胸膜肺炎放线杆菌的ClpP蛋白酶、Apx II毒素激活因子Apx II C和铁吸收调节蛋白Fur的编码基因灭活后得到的缺失突变株。
[0013]在本发明中，优选的，所述猪胸膜肺炎放线杆菌为APP血清7型菌株，更优选为APP血清7型CVCC265株。
[0014]在本发明中，优选的，所述蛋白酶ClpP的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述Apx II毒素激活因子Apx II C的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，所述铁吸收调节蛋白Fur的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015]在本发明中，优选的，所述的基因缺失株为APP Λ clpP Λ apx II CAfur，分类命名为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC N0.7930，保藏时间为2013年7月16日。
[0016]本发明的目的之二在于提供一种构建所述的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株的方法，其特征在于缺失株是通过将DNA片段Δ clpP、Δ apx II C以及Δ fur导入所述猪胸膜肺炎放线杆菌 血清7型菌株经同源重组实现的；
[0017]其中，所述DNA片段Λ clpP从上游至下游依次为上同源臂clpPS和下同源臂clpPX:所述上同源臂clpPS和下同源臂clpPX能与所述猪胸膜肺炎放线杆菌中的ClpP蛋白酶编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组、灭活所述ClpP蛋白酶的编码基因，得到clpP单基因缺失株APP AclpP ；
[0018]其中，所述DNA片段Aapx II C从上游至下游依次为上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX，所述上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX能与所述猪胸膜肺炎放线杆菌中的Apx II C蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组、灭活所述Apx II C蛋白的编码基因，进一步得到clpP和apx II C双基因缺失株APP Λ clpP Λ apx II C ；
[0019]其中，所述DNA片段Λ fur从上游至下游依次为上同源臂furS和下同源臂furX，所述上同源臂furS和下同源臂furX能与所述猪胸膜肺炎放线杆菌中的Fur蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组、灭活所述Fur蛋白的编码基因，更进一步的得到clpP、apx II C 和 fur 三基因缺失株 APP Δ clpP Δ apx II C Δ fur。
[0020]在本发明的具体实施例中，所述ClpP蛋白酶的编码基因如SEQ ID N0.1所示，所述的Apx II C蛋白的编码基因如SEQ ID N0.3所示，所述的Fur蛋白的编码基因如SEQ IDN0.5所示。
[0021]本发明的目的之三在于提供所述的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株在制备猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗中的应用。
[0022]本发明的目的之四在于提供一种猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗，其活性成分为本发明所述的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株。
[0023]在本发明的一个具体实施例中，本发明的一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株是通过以下技术方案来实现的:
[0024]本发明的一种不含抗性标记猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突变菌株APP AclpP Λ apx II C Λ fur，衍生于中国兽药监察所购买的猪胸膜肺炎放线杆菌CVCC265株，将其基因组上的clpP基因缺失了 491bp，灭活clpP基因，使ClpP蛋白酶不表达，获得单基因缺失突变菌株；再将其基因组上的apx II C基因缺失了 270bp，灭活apx II C基因，使Apx II C蛋白不表达，获得双基因缺失突变菌株；随后又将其基因组上的fur基因缺失了 349bp，灭活fur基因，使Fur蛋白不表达，获得三基因缺失突变株。
[0025]本发明的基本构建方法是:
[0026]1、首先以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型(简称APP7，下同)CVCC265株为起始材料，以PCR的方法从CVCC265的基因组中扩增出clpP基因的上同源臂ClpPS和下同源臂ClpPX，采用重叠延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，扩增Λ clpP基因片段，此片段缺失了 clpP基因的491bp的序列片段。而后把这个经改造的AclpP序列克隆至载体PUC18，最终成为同源重组载体(自杀性质粒)pUCAclpP。采用电转化的方法把自杀性质粒pUCAclpP转化到APP7CVCC265株中，由于同源重组载体(自杀性质粒)不能在APP菌中自主复制，因此转入受体菌细胞内的超螺旋的自杀质粒便会被线性化。因自杀质粒上含有受体菌基因的同源序列，它便会插入受菌体CVCC265的染色体中，接着线性化的质粒与clpP基因发生置换，也就是通常所说的单交换同源重组事件的发生。只有置换到CVCC265染色体上被线性化的自杀质粒才能随着染色体的复制而存在。把受体菌涂布在含有筛选标记的TSA平板上，PCR筛选出单交换子。由于单交换是整个载体序列(含筛选药物抗性基因)都置换到染色体上，因此，我们必须进一步筛选目的基因整合到染色体上同时又删除载体序列的双交换子。将获得的同源重组单交换子经液体培养后，涂布于无抗性的TSA平板上，挑取单菌落进行PCR筛选阳性同源重组双交换子，即clpP单基因缺失株APP Δ clpP。
[0027]2、然后，以PCR的方法从CVCC265的基因组中扩增出apx II C基因的上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX,采用重叠延伸PCR方法拼接apx II C基因的上、下同源臂，扩增Aapx II C基因片段，此片段缺失了 apx II C基因的270bp的序列片段。而后把这个经改造的Aapx II C序列克隆至载体pUC18，最终成为同源重组载体(自杀性质粒)PUC Δ apx II C，再按照I的方法，以获得的clpP单基因缺失株APP Δ clpP为起始材料，进一步缺失apx II C基因，获得clpP和apx II C双基因缺失株APP AclpP Δ apx II C。
[0028]3、最后，以PCR的方法从CVCC265的基因组中扩增出fur基因的上同源臂furS和下同源臂furX，采用重叠延伸PCR方法拼接fur基因的上、下同源臂，扩增Λ fur基因片段，此片段缺失了 fur基因的349bp的序列片段。而后把这个经改造的Λ fur序列克隆至载体PUC18，最终成为同源重组载体(自杀性质粒)pUC Λ fur，再按照I的方法，以获得的clpP和apx II C双基因缺失株APP Λ clpP Λ apx II C为起始材料，进一步缺失fur基因，获得clpP、apx II C 和 fur 三基因缺失株 APP Δ clpP Δ apx II C Δ fur。
[0029]本发明提供的所述的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株APP Δ clpP Δ apx II C Λ fur比亲本株CVCC265株毒力下降达100倍以上，对试验小鼠和本动物猪具有良好的安全性。以所述的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株APP AclpP Aapx II C Λ fur免疫动物后，用强毒力的7型和5型菌株进行攻毒，结果表明APP Δ clpP Δ apx II CA fur能对小鼠和猪提供良好的保护效力。
[0030]本发明的主要优点是:
[0031]1、本发明所用的材料为猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型CVCC265株，购自于中国兽药监察所，APP血清7型菌株是目前我国流行并严重导致猪发病的优势血清型。因此，今后以该菌株构建的clpP、apx II C和fur三基因缺失突变菌株为基础研制的疫苗会具有很强的针对性，有广阔的市场应用前景。
[0032]2、本发明猪胸膜肺炎放线`杆菌血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突变菌株不含任何抗性标记，完全符合我国疫苗生物安全要求。
【专利附图】

【附图说明】
[0033]图1为猪胸膜肺炎放线杆菌重组自杀质粒pUC Δ clpP的构建流程图；
[0034]图2为猪胸膜肺炎放线杆菌重组自杀质粒pUC Δ apx II C的构建流程图；
[0035]图3为猪胸膜肺炎放线杆菌重组自杀质粒pUC Δ fur的构建流程图；
[0036]图4为上同源臂clpPS和下同源臂clpPX的PCR扩增结果；
[0037]图中 1:clpPS (1200bp) ;2:clpPX (1249bp) ;M:DL2000DNA Marker
[0038]图5为Λ clpP基因的PCR拼接结果；
[0039]图中 1:八。1?卩基因(244沘？);M:DL15000DNA Marker
[0040]图6为重组自杀质粒pUC Δ clpP的PCR鉴定结果；
[0041]图中 1-3: AclpP;M:DL15000DNA Marker
[0042]图7为APP Λ clpP单交换株的PCR鉴定结果；
[0043]图中1-3:单交换株；M:DL2000DNA Marker
[0044]图8为APP AclpP缺失株的PCR鉴定结果；[0045]图中M:DL2000DNA Marker; 8号为筛选的clpP单基因缺失株
[0046]图9为APP Λ clpP缺失株的遗传稳定性实验结果；
[0047] 图中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0048]图10为上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX的PCR扩增结果；
[0049]图中 1: apx II CS (1412bp) ; 2: apx II CX (1443bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0050]图11为Λ apx II C基因的PCR拼接结果；
[0051]图中 1: Aapx II C 基因(2855bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0052]图12为重组自杀质粒pUC Δ apx II C的PCR鉴定结果；
[0053]图中 1-5: Aapx II C;M:DL5000DNA Marker
[0054]图13为APP Δ clpP Δ apx II C单交换株的PCR鉴定结果；
[0055]图中1-5:单交换株；M:Dl2OOODNA Marker
[0056]图14为APP Δ clpP Δ apx II C双基因缺失株的PCR鉴定结果；
[0057]图中M:DL2000DNA Marker; I号和5号为筛选的clpP和apx II C双基因缺失株
[0058]图15为APP Δ clpP Δ apx II C双基因缺失株的遗传稳定性实验结果；
[0059]图中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0060]图16为上同源臂furS和下同源臂furX的PCR扩增结果；
[0061]图中 1: furS (1387bp) ; 2: furX (1405bp) ;M:DL2000DNA Marker
[0062]图17为Λ fur基因的PCR拼接结果；
[0063]图中 1: Afur 基因(2792bp) ;M:DL5000DNA Marker
[0064]图18为重组自杀质粒pUC Δ fur的PCR鉴定结果；
[0065]图中 1-2: Δ fur; M: DL5000DNA Marker
[0066]图19为APP Δ clpP Δ apx II CA fur单交换株的PCR鉴定结果；
[0067]图中1-4:单交换株；M:Dl2OOODNA Marker
[0068]图20为APP Δ clpP Δ apx II CA fur三基因缺失株的PCR鉴定结果；
[0069]图中M:DL2000DNA Marker; 5号为筛选的cIpP、apx II C和fur三基因缺失株
[0070]图21为APP Δ clpP Δ apx II CA fur三基因缺失株的遗传稳定性实验结果；
[0071]图中1-10:第 1-10 代缺失株；M:DL2000DNA Marker
[0072]图22为APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur三基因缺失株和亲本株攻毒后的肺部病变。【具体实施方式】
[0073]下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0074]本发明实施例中所涉及的材料:
[0075]菌种:APP血清7型CVCC265株购买自中国兽药监察所
[0076]载体和试剂:pUC18质粒、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。
[0077]实施例1APP血清7型clpP单基因缺失突变株的构建
[0078]1.1重组自杀载体pUC Δ clpP的构建[0079]猪胸膜肺炎放线杆菌重组自杀质粒pUC Λ clpP的构建流程图如图1所示。
[0080]1.1.1ClpP蛋白酶基因上、下同源臂的引物设计和PCR扩增
[0081]根据已报道的ΑΡΡ7型ΑΡ76株序列(参照GenBank登录号为CP001091.1的基因序列)设计两对引物，分别扩增clpP基因的上同源臂clpPS和下同源臂clpPX，扩增片段大小分别为1200bp和1249bp，上同源臂clpPS和下同源臂clpPX的PCR扩增结果如图4所示。上同源臂上游引物5’端设计EcoR I酶切位点，下同源臂下游引物5’端设计BamH I酶切位点。上述引物均由北京华大基因公司合成。
[0082]扩增上同源臂的引物序列如下:
[0083]clpSF: 5’ -CGGAATTC (EcoR I ) GGGGCGTTACTGGATGC-3’
[0084]clpSR:5，-CCATCGCTTCCGCCTTTGGAGGTTTGC-3，
[0085]扩增下同源臂的引物序列如下:
[0086]cIpXF: 5 ’ -TCCAAAGGCGGAAGCGATGGAATACGGTC-3，
[0087]clpXR:5，-CGGGATCC(BamH I )TTCTCTGCTTTAAGTGTCGGC-3，
[0088]以APP血清7型CVCC265株基因组DNA为模板分别扩增clpP基因上、下同源臂:PCR扩增反应体系为50μ L，其中模板DNAlOng，上、下游引物各I μ M，dNTP200 μ Μ, 10 X TaqbufferlOy L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反应程序为:95 °C 预变性 5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30个循环，72°C IOmin0 PCR产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收。
[0089]1.1.2重叠延伸PCR方法扩增Λ clpP基因片段
[0090]以上、下同源臂的PCR回收产物为模板，采用重叠延伸PCR方法拼接clpP基因的上、下同源臂，扩增八(:1妒基因片段，引物(31的1?5’端下划线部分的碱基与引物clpXF斜粗体部分的碱基反向互补，引物clpXF5’端下划线部分的碱基与引物clpSR斜粗体部分的碱基反向互补。PCR扩增反应体系为50yL，其中模板DNAlOng，上、下游引物各I μ M，dNTP200yM, IOXTaq bufferlO μ L, Ex Taq DNA聚合酶 2U(TaKaRa)。PCR 反应程序为:95°C预变性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72V 150s, 30 个循环，72°C IOmin0 PCR 产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，然后用EcoR I和BamH I进行酶切，用胶回收试剂盒回收，Λ clpP基因的PCR拼接结果如图5所示。
[0091]1.1.3重组自杀质粒pUCAclpP的构建
[0092]将纯化的Λ clpP基因片段用T4DNA连接酶(TaKaRa)与经EcoR I和BamH I双酶切消化的PUC18载体相连接，16°C连接24h，热激转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，经酶切鉴定的阳性质粒命名为pUC AclpP,对克隆的Λ clpP基因进行PCR及测序鉴定，重组自杀质粒pUC Δ clpP的PCR鉴定结果如图6所示。
[0093]1.2APP血清7型clpP基因缺失突变株的构建
[0094]将构建的重组自杀质粒pUC Δ clpP电转化进入APP血清7型CVCC265，在10ug/mLAmp抗性平板上筛选单交换株阳性菌落，并在clpP上、下同源臂内部设计引物，进行PCR鉴定，野生株能扩增获得858bp片段，缺失株能扩增获得367bp片段，单交换株能同时扩增获得858bp和367bp片段，APP Λ clpP单交换株的PCR鉴定结果如图7所示。上述引物均由北京华大基因公司合成。[0095]引物序列如下:
[0096]clpJDF:5， -CGTGGTGTCGCTTGAAACTC-3，
[0097]clpJDR:5， -AATTAGACCGTATTCCATCGC-3，[0098]将单交换株阳性单菌落在不含Amp抗性的TSB (1%的烟酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的马血清)培养增殖后，涂布于无抗性的TSA平板，挑取单菌落，进行PCR鉴定，野生株能扩增获得858bp片段，缺失株仅能扩增获得367bp片段，APP △ clpP缺失株的PCR鉴定结果如图8所示，该阳性克隆命名为APP Λ clpP。
[0099]将本发明制备的clpP基因缺失突变菌株APP Λ clpP在TSB培养基连续传代10次，用PCR鉴定，若每一代的突变菌株都能扩增出367bp片段，表明本发明的突变菌株是能够稳定遗传的；若扩增出858bp片段，表明本发明的突变菌株是不能稳定遗传的。结果如图9所示，表明本发明制备的clpP基因缺失突变菌株能够稳定遗传。
[0100]实施例2APP血清7型clpP和apx II C双基因缺失突变株的构建
[0101]2.1重组自杀载体pUC Aapx II C的构建
[0102]猪胸膜肺炎放线杆菌重组自杀质粒pUC Δ apx II C的构建流程图如图2所示。
[0103]2.1.1apx II C基因上、下同源臂的引物设计和PCR扩增
[0104]根据已报道的APP7型AP76株序列(参照GenBank登录号为CP001091.1的基因序列)设计两对引物，分别扩增apx II C基因的上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX,扩增片段大小分别为1412bp和1443bp,上同源臂apx II CS和下同源臂apx II CX的PCR扩增结果如图10所示。上同源臂上游引物5’端设计EcoR I酶切位点，下同源臂下游引物5’端设计BamH I酶切位点。上述引物均由北京华大基因公司合成。
[0105]扩增上同源臂的引物序列如下:
[0106]II CSF:5，-CGGAATTC(EcoR)ATGACAACACCAATGATTGATTTAC-3’
[0107]II CSR:5 ’ -AATCCCCGAAAGCATCATCCCTCCCATTC-3，
[0108]扩增下同源臂的引物序列如下:
[0109]II CXF:5 ’ -GGATGATGCTTTCGGGGATTCATCTCTATTG-3，
[0110]II CXR:5 ’ -CGGGATCC(BamH)GTTGTAATAAGTCCCGTAACACCAG-3 ’
[0111]以APP血清7型CVCC265株基因组DNA为模板分别扩增apx II C基因上、下同源臂:PCR扩增反应体系为5(^1^，其中模板0嫩101^，上、下游引物各ΙμΜ，dNTP200 μ Μ,IOXTaq bufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反应程序为:95 °C 预变性5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30 个循环，72°C IOmin0 PCR 产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收。
[0112]2.1.2重叠延伸PCR方法扩增Aapx II C基因片段
[0113]以上、下同源臂的PCR回收产物为模板，采用重叠延伸PCR方法拼接apx II C基因的上、下同源臂，扩增Aapx II C基因片段，Aapx II C基因的PCR拼接结果如图11所示。引物II CSR5’端下划线部分的碱基与引物II CXF斜粗体部分的碱基反向互补，引物II CXF5’端下划线部分的碱基与引物II C SR斜粗体部分的碱基反向互补。PCR扩增反应体系为50 μ L，其中模板 DNAlOng，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X Taq bufferlO μ L, Ex Taq DNA聚合酶 2U(TaKaRa)ο PCR 反应程序为:95°C预变性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72°C 150s, 30个循环，72°C IOmin0 PCR产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，然后用EcoR I和BamHI进行酶切，用胶回收试剂盒回收。
[0114]2.1.3重组自杀质粒pUC Δ apx II C的构建
[0115]将纯化的Aapx II C基因片段用T4DNA连接酶(TaKaRa)与经EcoR I和BamH I双酶切消化的PUC18载体相连接，16°C连接24h，热激转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，经酶切鉴定的阳性质粒命名为pUCAapx II C，对克隆的Aapx II C基因进行PCR以及测序鉴定，重组自杀质粒pUC Δ apx II C的PCR鉴定结果如图12所示。
[0116]2.2APP血清7型clpP和apx II C双基因缺失突变株的构建
[0117]将构建的重组自杀质粒pUC Λ apx II C电转化进入实施例1中构建好的APP AclpP,在10ug/mL Amp抗性平板上筛选单交换株阳性菌落,并在apx II C上、下同源臂内部设计引物，进行PCR鉴定，clpP单基因缺失株能扩增获得564bp片段，clpP和apx II C双基因缺失株能扩增获得294bp片段，单交换株能同时扩增获得564bp和294bp片段，APP AclpP Aapx II C单交换株的PCR鉴定结果如图13所示。上述引物均由北京华大基因公司合成。
[0118]引物序列如下:
[0119]II CJDF: 5，-GAAGAGCCATTACCCAACAAC-3，
[0120]II CJDR:5，-ATACAATAGAGATGAATCCCCG-3’
[0121]将单交换株阳性单菌落在不含Amp抗性的TSB (1%的烟酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的马血清)培养增殖后，涂布于无抗性的TSA平板，挑取单菌落，进行PCR鉴定，ClpP单基因缺失株能扩增获得564bp片段，clpP和apx II C双基因缺失株仅能扩增获得294bp片段，APP Λ clpP Λ apx II C双基因缺失株的PCR鉴定结果如图14所示，该阳性克隆命名为APP Δ cIpP Δ apx II C。`
[0122]将本发明制备的clpP和apx II C双基因缺失突变菌株APP Λ clpP Λ apx II C在TSB培养基连续传代10次，用PCR鉴定，若每一代的突变菌株都能扩增出294bp片段，表明本发明的突变菌株是能够稳定遗传的；若扩增出564bp片段，表明本发明的突变菌株是不能稳定遗传的。结果如图15所示，表明本发明制备的clpP和apx II C双基因缺失突变菌株能够稳定遗传。
[0123]实施例3APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突变株的构建
[0124]3.1重组自杀载体pUC Δ fur的构建
[0125]猪胸膜肺炎放线杆菌重组自杀质粒pUC Λ fur的构建流程图如图3所示。
[0126]3.1.1fur基因上、下同源臂的引物设计和PCR扩增
[0127]根据已报道的APP7型AP76株序列(参照GenBank登录号为CP001091.1的基因序列)设计两对引物，分别扩增fur基因的上同源臂furS和下同源臂furX，扩增片段大小分别为1412bp和1443bp，上同源臂furS和下同源臂furX的PCR扩增结果如图16所示。上同源臂上游引物5’端设计EcoR I酶切位点，下同源臂下游引物5’端设计BamH I酶切位点。上述引物均由北京华大基因公司合成。
[0128]扩增上同源臂的引物序列如下:
[0129]furSF: 5，-CGGAATTC (EcoR) TTAGCCGTGATGGTGGTG-3 ’
[0130]furSR: 5，-TTTCATGCATTTTCTTCAGACATAACTTG-3，[0131]扩增下同源臂的引物序列如下:
[0132]furXF: 5，~AAGAAAATGCATGAAATTAGCGACGCACAG~3，
[0133]furXR: 5，-CGGGATCC (BamH) GTTTAGGCTCGCCTTTGC-3，
[0134]以APP血清7型CVCC265株基因组DNA为模板分别扩增fur基因上、下同源臂:PCR扩增反应体系为50yL，其中模板DNAlOng，上、下游引物各ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X TaqbufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶 2U (TaKaRa)0 PCR 反应程序为:95 °C 预变性 5min，94°C 60s, 55°C 60s, 72°C 90s, 30个循环，72°C IOmin0 PCR产物经凝胶电泳后用胶回收试剂
盒回收。
[0135]3.1.2重叠延伸PCR方法扩增Λ fur基因片段
[0136]以上、下同源臂的PCR回收产物为模板，采用重叠延伸PCR方法拼接fur基因的上、下同源臂，扩增Afur基因片段，Afur基因的PCR拼接结果如图17所示。引物furSR5’端下划线部分的碱基与引物furXF斜粗体部分的碱基反向互补，引物furXF5’端下划线部分的碱基与引物fur SR斜 粗体部分的碱基反向互补。PCR扩增反应体系为50 μ L，其中模板 DNAlOng，上、下游引物各 ΙμΜ，dNTP200 μ Μ, 10 X Taq bufferlO μ L, Ex Taq DNA 聚合酶2U (TaKaRa)0 PCR 反应程序为:95°C预变性 5min，94°C 60s, 55°C 90s, 72°C 150s, 30 个循环，72°C lOmin。PCR产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，然后用EcoR I和BamH I进行酶切，用胶回收试剂盒回收。
[0137]3.1.3重组自杀质粒pUC Afur的构建
[0138]将纯化的Λ fur基因片段用T4DNA连接酶(TaKaRa)与经EcoR I和BamH I双酶切消化的PUC18载体相连接，16°C连接24h，热激转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，经酶切鉴定的阳性质粒命名为pUC Δ fur,对克隆的Λ fur基因进行PCR以及测序鉴定，重组自杀质粒pUC Δ fur的PCR鉴定结果如图18所示。
[0139]3.2APP血清7型clpP、apx II C和fur三基因缺失突变株的构建
[0140]将构建的重组自杀质粒pUC Λ fur电转化进入实施例2中构建好的APP Δ cIpP Δ apx II C,在10ug/mL Amp抗性平板上筛选单交换株阳性菌落,并在fur上、下同源臂内部设计引物，进行PCR鉴定，clpP和apx II C双基因缺失株能扩增获得897bp片段，clpP, apx II C和fur三基因缺失株能扩增获得548bp片段，单交换株能同时扩增获得897bp和548bp片段，APP AclpP Aapx II C Λ fur三基因缺失株的PCR鉴定结果如图19所示。上述引物均由北京华大基因公司合成。
[0141]引物序列如下:
[0142]furJDF:5’ -GACATTGGCCGACGGAAG-3’
[0143]furJDR: 5，-GCCAATCACGAAAGCAACG-3 ’
[0144]将单交换株阳性单菌落在不含Amp抗性的TSB(1%的烟酰胺腺嘌吟二核昔酸和10%的马血清)培养增殖后，涂布于无抗性的TSA平板，挑取单菌落，进行PCR鉴定，ClpP和apx II C双基因缺失株能扩增获得897bp片段，clpP、apx II C和fur三基因缺失株仅能扩增获得548bp片段，APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur三基因缺失株的PCR鉴定结果如图20所示，该阳性克隆命名为APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0.7930。[0145]将本发明制备的clpP、apx II C和fur三基因突变菌株APP Λ clpP Λ apx II CAfur在TSB培养基连续传代10次，用PCR鉴定，若每一代的突变菌株都能扩增出548bp片段，表明本发明的突变菌株是能够稳定遗传的；若扩增出897bp片段，表明本发明的突变菌株是不能稳定遗传的。结果如图21所示,表明本发明制备的clpP、apx II C和fur三基因缺失突变菌株能够稳定遗传。
[0146]实施例4APP Δ clpP Δ apx II CA fur突变株的毒力鉴定和安全性评价
[0147]试验动物:4-6周龄SPF级Balb/C雌鼠，8-9周龄APP血清阴性健康猪，均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
[0148]4.1对小鼠的毒力鉴定和安全性评价试验
[0149]将小鼠随机分为二组，每组60只。具体接种方案如下:
[0150]第一组(试验组):接种实施例3制备的APP Δ clpP Δ apx II C Afur,稀释为表1中所列6个浓度(CFU)，每个浓度10只小鼠，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml0
[0151]第二组(对照组):接种猪胸膜肺炎放线杆菌CVCC265，稀释为表1中所列6个浓度(CFU)，每个浓度10只小鼠，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml0
[0152]小鼠存活情况见表1。结果表明，APP Λ clpP Λ apx II C Λ fur对小鼠的毒力与野生株CVCC265相比下降了 100倍以上。
[0153]表1
[0154]
【权利要求】
1.一种不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株，其特征在于该菌株缺失了蛋白酶ClpP、Apx II毒素激活因子Apx II C和铁吸收调节蛋白Fur的编码基因。
2.如权利要求1所述的不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株，其特征在于所述猪胸膜肺炎放线杆菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株。
3.如权利要求2所述的不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株，其特征在于所述猪胸膜肺炎放线杆菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型CVCC265株。
4.如权利要求1所述的不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株，其特征在于:所述蛋白酶ClpP的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述Apx II毒素激活因子Apx IIC 的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，所述铁吸收调节蛋白Fur的氨基酸序列如SEQ ID N0.6 所示。
5.如权利要求1-4任一项所述的不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株， 其特征在于:所述的基因缺失株为APP A clpP A apx II C A fur,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC N0.7930。
6.权利要求1-5中任一项所述的不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株在制备预防猪传染性胸膜肺炎疫苗中的应用。
7.一种不含抗性标记的猪传染性胸膜肺炎弱毒活疫苗，其活性成分为权利要求1-5中任一项所述的不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌三基因缺失株。
【文档编号】A61K39/02GK103555645SQ201310469680
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】王春来, 谢芳, 李刚, 张艳禾 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所