专利名称：预防山羊传染性胸膜肺炎的双价二联油乳剂灭活疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种兽用油乳剂灭活疫苗及其制备方法，特别涉及一种预防山羊传染性胸膜肺炎的双价二联油乳剂灭活疫苗及制备方法，属于兽用生物防治技术领域。
背景技术：
山羊传染性胸膜肺炎是我国当前山羊养殖生产中危害较为严重的一种条件性传染病，其致病原主要为绵羊肺炎支原体“Y98”和丝状支原体山羊亚种“Pm”。国内实验研究表明，“Y98”主要流行于我国西北、东北等地区，“Pe3”主要流行于西南、华南等地区。由于该病的流行特点在我国存在地域上的显著差异，目前国内尚无统一的疫苗制品。近年来， 随着日益增长的市场需求和养殖规模的不断扩大，加大了全国各地区间的种群流动和商品流通，各地方致病原拟将随种间流动而改变山羊传染性胸膜肺炎原有的流行规律及发病特性；近年的血清学诊断及流行病学调查研究表明，多菌株的交叉感染现象在各地区已逐步显现出来，拟为该病的有效防控提出了新的要求。根据贵州省畜牧兽医研究所1999一2010 年期间对贵州山羊传染性胸膜肺炎的血清学诊断、流行病学调查以及病原分离鉴定研究表明，其丝状支原体山羊亚种“P(；3”阳性感染率为28. 33-38. 3%，绵羊肺炎支原体“Y98”阳性感染率为15.8%，Ps3与Y98的交叉感染率达13.8%，其临床发病率达20— 30%左右，同时， 贵州省畜牧兽医研究所也先后从擬似发病羊只病理组织中分离出致病原丝状支原体山羊亚种“Pe3”和绵羊肺炎支原体“Y98”致病株。由于国内目前应用的山羊传染性胸膜肺炎预防疫苗使用效果并不理想，致使该病至今未能得到有效防控，特别是在每年的冬、春季节，山羊传染性胸膜肺炎仍呈高发态势，严重制约了山羊产业的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对预防山羊传染性胸膜肺炎具有良好免疫特异性及使用安全性的双价二联油乳剂灭活疫苗及制备方法。本发明是这样实现的预防山羊传染性胸膜肺炎双价二联油乳剂灭活疫苗特异性免疫抗原绵羊肺炎支原体“Y98”毒株和丝状支原体山羊亚种贵州地方株“贵罗Pro”毒株， 每毫升含菌量分别为10 X IO6 —10 X IOltl活菌。经优选后的标准抗原量为每毫升Y98彡IOX IO9活菌，“贵罗Ps3”彡IOX IO9活菌。一种预防山羊传染性胸膜肺炎的双价二联油乳剂灭活疫苗的制备方法其制备步骤为
(I)灭活疫苗的制备
①菌株复壮分别取“贵罗Pe3”、“Y98”冻干毒株于健康山羊气管内注射，复壮观察，待发病7-10天后，剖取接种山羊肺、淋巴、胸水等病变组织制成含菌母液；
②母液二次接种健康山羊，待发病7-10天后，取肺、淋巴、胸水等病变组织接种于选择性支原体培养基，分离提取复壮菌株；
③复壮菌株扩大培养，制成菌液，经检测和细菌计数每毫升“贵罗pe3”、“Y98”活菌分别不低于IOXlO9 ；
④灭活将菌液按O.3%比例加入福尔马林溶液，18°C灭活48h，经无菌检验合格后作为免疫抗原；
⑤水相制备取合格菌液与土温-80按I:0. 05混匀；
⑥油相制备94%柏油与6%司本-80混匀后加入2%硬脂酸铝；
⑦灭活油乳剂制备取油相2份、水相I份进行碾磨乳化。(2)安全检验用实验兔、豚鼠按每只2_3ml肌肉注射灭活苗，观察10日无异常。(3)效力检验选择健康实验山羊分别在第7d、15d进行2次免疫接种，第25d颈静脉采血分离血清,检测免疫阳性抗体。(4)攻毒试验对免疫山羊每只按100亿活菌量气管内注射，观察25-30d无异常。(5)疫苗分装在不低于10万级生物净化GMP生产车间条件下无菌密闭封装。(6)储存条件2— 8°C恒温冷藏保存。用法与用量皮下或肌肉注射。成年羊5ml/只，小羊3ml/只，一年注射2次。本发明应用山羊传染性胸膜肺炎的主要致病原绵羊肺炎支原体“Y98 ”和丝状支原体山羊亚种“Pe3 ”作为特异性免疫抗原，研发出双价二联油乳剂灭活疫苗用于山羊传染性胸膜肺炎的预防免疫，符合当前山羊传染性胸膜肺炎的流行规律和发病特性。本发明疫苗主要用于山羊传染性胸膜肺炎的免疫防控。本发明经菌株复壮、菌株扩大培养、灭活、活检、乳化、安检、效检、应用防治等一系列实验研究表明，羊传染性胸膜肺炎双价二联灭活油乳剂疫苗具有良好的免疫特异性和敏感性，当菌体抗原量Y98彡IOX 109、“贵罗Pe3”彡IOXlO9 时，其实验组免疫抗体阳性率为100%，攻毒保护实验有效率达87. 5%以上；应用推广试验免疫抗体阳性率达90. 7-96. 3%。本发明研究应用的油相、水相乳化抗原双相包被技术，具有免疫抗原分布均匀、吸附性好、不易分离的特点，能有效提高疫苗的稳定性；在注射部位形成油囊缓慢释放，在一定时间内可增强免疫抗原的持续作用。本疫苗使用的特异性免疫抗原 “贵罗Pe3”和“Y98”是我国当前山羊传染性胸膜肺炎发生并流行的主要致病原，对山羊传染性胸膜肺炎具有良好的免疫特异性和敏感性，其灭活乳化后具有极高的使用安全性和稳定性，完全符合国家对动物防疫制品在特异性、生物安全性等方面的基本要求。对贵州省和全国其他地区在山羊传染性胸膜肺炎的生物防治方面具有良好的生产、经济和社会意义。、试验材料
1.I实验动物实验用健康山羊由贵州省畜牧兽医研究所花溪黑山羊良种繁育养殖示范基地提供；实验用家兔、豚鼠由贵阳医学院实验动物室提供。I. 2实验菌株绵羊肺炎支原体“Υ98”毒株和丝状支原体山羊亚种贵州地方株“贵罗Pe3”毒株由贵州省畜牧兽医研究所畜禽重大疫病研究室分离鉴定保存。I. 3实验试剂实验用营养培养基、支原体选择性培养基由实验室制备。山羊传染性胸膜肺炎ELISA抗体检测试剂盒和间接血凝检测试剂盒由贵州省畜牧兽医研究所畜禽重大疫病研究室提供。、实验内容及方法
2.I双价二联油乳剂灭活疫苗的制备2.I. I菌株复壮分别取Pe3、Y9J*干菌于健康山羊气管内注射，复壮观察，待发病7-10 天后，剖取接种山羊肺、淋巴、胸水等病变组织制成含菌母液。母液二次接种健康山羊，待发病7-10天后，取肺、淋巴、胸水等病变组织接种于支原体选择性培养基，分离提取复壮菌株。2. I. 2菌液制备将分离复壮的菌株分别接种于犊牛血清营养培养基中扩大培养，分别按每毫升IOX IO6UOX IO9UOX IO10活菌量制备菌液。2. I. 3菌体灭活分别将菌液按0. 3%比例加入福尔马林溶液，18°C灭活48h，经无菌检验合格后作为免疫抗原。2. I. 4活菌检测分别取灭活菌液接种于血平板，37°C培养观察24— 36小时，无活菌生长视为检验合格。2. I. 5水相制备取合格菌液与土温-80按I :0. 05混匀。2. I. 6油相制备94%柏油与6%司本-80混匀后加入2%硬脂酸铝。2. I. 7乳化取油相2份、水相I份进行充分碾磨乳化。2. I. 8无菌分装在10万级生物净化GMP生产车间进行无菌密闭封装。2. 2安全检验用实验兔、豚鼠按每只2_3ml肌肉注射灭活苗，观察10日。2. 3效力检验非免疫实验山羊32只，体重12. 5—20kg，随机平均分成4组，每组 8只，其中第1-3组为实验组，第4组为对照组。2. 3. I免疫实验及分组健康实验羊分组观察7d无异常后进行实验(见表I)。表一
权利要求
1.一种预防山羊传染性胸膜肺炎的双价二联油乳剂灭活疫苗，其特征在于它是由山羊传染性胸膜肺炎主要致病原绵羊肺炎支原体“Y98 ”毒株和丝状支原体山羊亚种贵州地方株“贵罗pe3”毒株为特异性免疫抗原，经灭活乳化合成；其中每毫升“γ98”、“贵罗pe3”含菌量分别为 ιοχιο6—ιοχιο10ο
2.根据权利要求I所述的一种预防山羊传染性胸膜肺炎的双价二联油乳剂灭活疫苗， 其特征在于它是由山羊传染性胸膜肺炎主要致病原绵羊肺炎支原体“γ98”毒株和丝状支原体山羊亚种贵州地方株“贵罗Pe3”毒株为特异性免疫抗原，经灭活乳化合成；其中每毫升 “Υ98”、“贵罗Pe3”含菌量分别不低于IOX IO9。
3.一种预防山羊传染性胸膜肺炎的双价二联油乳剂灭活疫苗的制备方法其特征在于制备步骤为(1)灭活疫苗的制备①菌株复壮分别取“贵罗Pe3”、“Y98”冻干毒株于健康山羊气管内注射，复壮观察，待发病7-10天后，剖取接种山羊肺、淋巴、胸水等病变组织制成含菌母液；②母液二次接种健康山羊，待发病7-10天后，取肺、淋巴、胸水等病变组织接种于选择性支原体培养基，分离提取复壮菌株；③复壮菌株扩大培养，制成菌液，经检测和细菌计数每毫升“贵罗Pe3”、“Y98”活菌分别不低于IOXlO9 ；④灭活将菌液按O.3%比例加入福尔马林溶液，18°C灭活48h，经无菌检验合格后作为免疫抗原；⑤水相制备取合格菌液与土温-80按I:0. 05混匀；⑥油相制备94%柏油与6%司本-80混匀后加入2%硬脂酸铝；⑦灭活油乳剂制备取油相2份、水相I份进行碾磨乳化；(2)疫苗分装在不低于10万级生物净化GMP生产车间条件下无菌密闭封装；(3)储存条件2—8°C恒温冷藏保存。
全文摘要
本发明公开了一种预防山羊传染性胸膜肺炎的双价二联油乳剂灭活疫苗及制备方法。它是由绵羊肺炎支原体“Y98”毒株和丝状支原体山羊亚种贵州地方株“贵罗PG3”毒株作为特异性免疫抗原，经菌株复壮、菌株扩大培养、灭活、活检、乳化、安检、效检、应用防制等一系列实验研究合成。当每毫升抗原含量在Y98 ≥10×109、“贵罗PG3”≥10×109时，其免疫抗体阳性率为100%，攻毒保护实验有效率达87.5%以上；应用推广试验免疫抗体阳性率达90.7-96.3%；表明对山羊传染性胸膜肺炎具有良好免疫特异性和敏感性，其使用具有可靠的安全性和稳定性。
文档编号A61K39/116GK102580075SQ20121008998
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者尚以顺, 文正常, 杨粤黔, 潘淑惠 申请人:贵州省畜牧兽医研究所