专利名称：从血液或血液级分中分离的凝血酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及从血液或血液级分中分离凝血酶的方法，包括用这种方法产生的组合物和施用这些组合物的方法。
背景技术：
全血，如人的全血，含有多种蛋白质、细胞以及其他成分。例如，全血可分离为血液级分如富血小板血浆和贫血小板血浆。全血和血浆级分包含各种凝血因子，如凝血酶,这些凝血因子可形成凝块来愈合组织或皮肤的损伤或别的破口。凝血酶是能够活化多种凝血因子并且可活化血小板的多功能丝氨酸蛋白酶。凝 血酶可通过活化的因子X(Xa)对凝血酶原上两个位点的酶切由凝血酶原产生。因子Xa的活性可通过与活化的因子V(Va)结合而增强，其称作凝血酶原复合物。一旦形成，凝血酶介导的纤维蛋白原通过蛋白水解而消化为纤维蛋白单体，启动了可导致凝块形成的反应级联，这通常是伤口愈合的第一步。凝血酶还可作为伤口愈合所涉及细胞的化学吸引剂(chemo-attractant)发挥功能,所得纤维蛋白网络具有很多的功能,其包括作为产生胶原蛋白的成纤维细胞的支架、增加吞噬作用、促进血管发生、以及结合生长因子，其可进一步支持愈合过程提供。血小板也可从非结合模式活化为结合模式。作为促凝血物质，凝血酶在制止出血(即生理止血)中发挥重要作用。凝块形成的速率可依赖于凝血酶和纤维蛋白原的浓度。因为其在凝块形成中的重要作用，凝血酶可用作组织封闭剂(tissue sealant)或粘合剂,也可与纤维蛋白原联合使用。包括凝血酶的伤口封闭剂的应用有很多，其包括在下列中的使用皮肤移植、神经外科、心脏外科、胸外科、血管外科、肿瘤外科、整形外科、眼外科、矫形外科、创伤外科、头颈外科、妇科及泌尿外科、胃肠外科、口腔外科、药物递送、组织工程、以及牙体窝洞(dentalcavity)止血等。
发明内容
本发明包括涉及从血液和/或血液级分中分离凝血酶的方法、装置和组合物，例如，其中所述分离的凝血酶可用作自体凝血因子。制备包含凝血酶之溶液的方法包括从液体中沉淀纤维蛋白原，所述液体包含全血或血液级分(如贫血小板血浆)。从所述液体中除去沉淀的纤维蛋白原，以形成沉淀后液体。除去沉淀的纤维蛋白原的方法包括过滤所述液体或离心所述液体以使沉淀的纤维蛋白沉积下来。然后，将所述沉淀后液体与钙和玻璃珠一起孵育以形成凝块，将包含凝血酶的溶液与凝块分离。提供包含凝血酶的溶液和组合物，其包含按照本方法制备的凝血酶。向对象之部位施用组织封闭剂的方法中可包括这些溶液和组合物。例如，包含凝血酶的溶液根据本文所述方法制备。然后，将凝血酶施用到对象的所述部位。在某些情况下，使用包含获得自对象的全血或血液级分的液体来制备凝血酶，从而提供对所述对象来说为自体的凝血酶。在施用组织封闭剂中凝血酶的施用还可包括向对象的部位施用纤维素蛋白原和钙。
图I是根据本发明制备包含凝血酶的溶液之方法的图示。图2是根据本发明制备包含凝血酶的溶液之另一个方法的图示。图3是根据本发明制备包含凝血酶的溶液之另一个方法的图示。图4是根据本发明的方法分离血液级分的示例性装置的局部横截面图。图5A和图5B分别是根据本发明的方法制备包含凝血酶的溶液之装置的等轴测视图(isometric view)和局部横截面图。
应当指出这里给出的附图意在示例本发明中材料和方法的一般特征，目的是描述某些实施方案。这些附图可能没有精确反映任何给定实施方案的特征，并且也不一定意在限定或限制本发明范围内的特定实施方案。
具体实施例方式以下对技术的描述仅仅是根据一项或多项发明的主题、制造和用途之本质的示例，而不是意在限制本申请或者可以要求本申请优先权而申请的其他申请或者这些申请所授专利权中所要求保护的任何具体发明的范围、应用或用途。在“具体实施方案”末尾提供了意在帮助理解本发明的对术语和短语的非限制性讨论。本发明涉及从全血和/或血液级分中分离凝血酶的方法，以及包含用所述方法生产的凝血酶的组合物，如组织封闭剂。本发明还提供了向对象的部位施用包含凝血酶的组织封闭剂的方法。例如，所述组织封闭剂可包含与纤维蛋白原混合的凝血酶，其被施加以形成凝块或纤维蛋白胶(fibrin glue)。凝血酶也可用于在治疗点使多种血液成分凝固，其中血液成分包括纯化的纤维蛋白原、全血、富血小板血衆(platelet-rich plasma,PRP)、贫血小板血衆(platelet-poor plasma,PPP)或其浓缩物,和其组合。凝血酶将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，形成可用做封闭剂(sealant)的凝块。可施加所述凝块以封闭手术后的切口部位或者封闭创伤，例如还可促进所述部位处的愈合。在某些情况下，这些凝血酶对于所述对象来说可以是自体的。本发明从血液和血液级分中分离凝血酶的方法可提供具有改善的凝血酶酶活性的凝血酶。其他产生或分离凝血酶的方法可导致活性低于期望的凝血酶。例如，一些方法提供了下述凝血酶，其可使得富血小板血浆凝固但不提供足以凝固其他产物(如浓缩血浆或骨髓抽吸物)的凝血酶活性。然而，本方法包括两个步骤来产生凝血酶纤维蛋白原沉淀和凝块形成/凝血酶原向凝血酶转化，其产生包含活性足以有效凝固此类产物的凝血酶的溶液。参看图I,以示意图的形式显示了制备包含凝血酶之溶液的方法100。从包含全血和/或血液级分的液体中沉淀纤维蛋白原，除去所沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后液体。例如，全血或血液级分Iio与有机溶剂120合并以沉淀纤维蛋白原,如130所示。沉淀纤维蛋白原可包括将全血和/或血液级分110与有机溶剂120混合，以及另外孵育一段时间，比如约10分钟至约20分钟。液体110可包含全血。当在方法100中使用全血时，所述全血可以与抗凝血剂合并。合适凝血剂的实施例包括酸-朽1檬酸盐-葡萄糖(Acid Citrate Dextrose, ACD),其是柠檬酸、柠檬酸钠和葡萄糖的水溶液，可用来保存血液。在某些实施方案中，所述血液成分可包含A⑶-A，其每IOOOml包含总柠檬酸盐(以柠檬酸计，无水(C6H8O7))约20. 59g至约22. 75g，葡萄糖(C6H12O6 * H2O)约 23. 28g 至约 25. 73g 和钠(Na)约 4. 90g 至约 5. 42g。在一些实施方案中，使用A⑶-B，其每IOOOml包含总柠檬酸盐(以柠檬酸计，无水(C6H8O7))约 12. 37g 至约 13. 67g，葡萄糖(C6H12O6 * H2O)约 13. 96g 至约 15. 44g 和钠(Na)约 2. 94g至约3. 25g。在某些实施方案中，可使用约1/10体积至约1/7体积的A⑶-A对全血进行抗凝血处理。其他合适的抗凝血剂包括本领域所知道的，如肝素、柠檬酸磷酸葡萄糖(citratephosphate dextrose,CPD)和乙二胺四乙酸(EDTA)。这些抗凝血剂可以放在用于从对象抽血的注射器中，或者也可以在抽血后与血液混合。抗凝血剂通常包括螯合剂(如，柠檬酸，EDTA)来螯合游离钙离子。在某些实施方案中，所述液体110为血液级分，合适的血液级分包括贫血小板血浆。血液级分110可通过多种合适方法中的任一种得到，包括本领域知道的那些。可用来制备血液级分110的装置的一个实例在图4中显示。在这种情况下，装置400包含容器405， 如管，其在装满血液后放置在离心机中。容器405包含浮标系统，所述系统具有隔离器410和浮标415。浮标415具有选定以使得在离心时能到达选定平衡位置的密度，这一位置位于较高密度的血液级分与较低密度的血液级分之间。离心过程中，浮标415通过沉降至两个级分之间的位置将容器405中的血液分成至少两个级分，而基本上不使所述级分混合。在这种情况下，分离器410和浮标415限定了包含富血小板血浆420的层，而较低密度的贫血小板血浆425 —般在分离器410上方分级分离，以及较高密度的红细胞430 —般在浮标415下方分级分离。用装置400离心后，注射器或者管可以与浮标系统的一部分相连接来提取血液级分(如富血小板血浆和/或贫血小板血浆)。这种装置的市售实施方案包括GPSh IIPlatelet Separation System,来自 Biomet Biologies, LLC(华沙，印第安纳州，美国)和Γ PS'*TTTPlatelet Separation System,来自 Biomet Biologies,LLC(华沙，印第安纳州，美国)。可用于分离图I中血液级分110的装置还包括例如以下中所描述的美国专利No. 6，398，972，Blasetti 等，2002年6 月 4 日授权;美国专利No. 6，649，072，Brandt 等，2003年11月18日授权；美国专利No. 6，790，371，Dolocek等，2004年9月14日授权；美国专利No. 7，011，852，Sukavaneshvar 等，2006 年 3 月 14 日授权；美国专利 No. 7，179，391，Leach等，2007年2月20日授权(通过引用并入本文);美国专利No. 7，374，678，Leach等，2008年5月20日授权(通过引用并入本文);美国专利No. 7，223，346，Dorian等，2007年5月29日授权(通过引用并入本文);和美国专利No. 7，708，152，Dorian等，2010年5月4日授权(通过引用并入本文)。可使用其他方法来分离血液级分110。如，不使用浮标系统来离心全血，全血可以进行多级离心，可使用连续流动离心，还可以使用过滤。此外，也可通过使用低速离心步骤将血浆与红细胞分离来产生血液级分，以防止血小板形成聚集成团。在另一些实施方案中，可将由离心的血液所形成的血沉棕黄层与剩余血浆分开。此外，多种其他市售装置都可以用来分离血液级分110，其包括-Magellan Autologous Platelet Separator System,由 Medtronic, Inc.(明尼阿波利斯，明尼苏达)出售；SmartPReP ,由 Harvest Technologies Corporation(普利茅斯，马萨诸塞)出售；AutoloGel Process,由 Cytomedix, Inc.(罗克维尔，马里兰)出售；和GenesisCS System,由EmCyte Corporation (迈尔斯堡，弗罗里达)。回到图1，如上面所讨论的，全血/血液级分110与有机溶剂120在步骤130中混合。适合使全血/血液级分110中纤维蛋白原沉淀的有机溶剂120包括与水互溶的溶剂如醇类(如甲醇和乙醇)和酮类(如丙酮)。随着有机溶剂的加入，全血/血液级分中的蛋白质发生沉淀。以这种方式，纤维蛋白原从全血/血液级分中沉淀出来。不受任何理论的约束，所述有机溶剂可使蛋白质表面脱水，其随后会在范德华力的作用下结合，至少在它们位于等电点或适当接近等电点的情况下。从带电基团周围除去水分子还可去掉它们的屏蔽层使得电荷交换的发生更加强烈。盐可以结合到蛋白质表面而使得它们的等电性变差，随后可干扰有机溶剂的沉淀。因此，用有机溶剂沉淀可在低盐浓度或降低的盐浓度下进行。在实践中，通过加入有机溶剂的沉淀可以在室温(如约20°C至25°C )或较低温度下实施。较低温度的实例包括约4°C至约-20°C。有机溶剂可以缓慢加入并与全血和/或 血液级分混合。可进行使用少量全血和/或血液级分的测试沉淀加入多种不同量的有机溶剂后取少量样品，离心，以及测定样品中上清以确定纤维蛋白原在何时沉淀。也可测定沉淀的存在以确定蛋白质是否以及何时有效地沉淀，以及例如，特别地纤维蛋白原是否沉淀。在多个实施方案中，沉淀可包括将约12ml贫血小板血浆与约7ml的全血在室温下合并。离心后，可测定多种上清和重悬的沉淀中蛋白质内容物，并可对其进行蛋白质电泳以提供蛋白质(包括纤维蛋白原)的定量测定。可使用除加入有机溶剂以外的其他方法来沉淀纤维蛋白原130。其实例包括加入多价金属离子(如Ca2+、Mg2+、Mn2+和Fe2+)，使用聚电解质(如藻酸盐、羧甲基纤维素、聚丙烯酸、单宁酸和多聚磷酸)、非离子亲水聚合物(如葡聚糖和聚亚烷基二醇)进行絮凝，通过加入酸(如盐酸和硫酸)的等电点沉淀，以及通过加入中性盐(如硫酸铵)的盐析。本领域所知的其他沉淀蛋白质的合适方法也可用于沉淀全血和/或血液级分中的纤维蛋白原。步骤130可包括将全血和/或血液级分液体110与有机溶剂一起孵育适于蛋白质(包括纤维蛋白原)沉淀的一段时间。孵育可以在室温或者所述的较低温度下进行。沉淀纤维蛋白原的代表性孵育时间包括从约10分钟至约20分钟。在某些实施方案中，包含全血和/或血液级分的液体110包含贫血小板血浆和有机溶剂120 (其包括纯乙醇，即基本上100%的乙醇或200pix)Of)，混合和孵育以沉淀纤维蛋白原130可包括将贫血小板血浆抽到含有乙醇的注射器中。适当的体积和比例的实例包括约12ml贫血小板血浆和约7ml200-proof的乙醇(或等同的)。将贫血小板血浆和乙醇混合，并将注射器孵育10至20分钟。所述孵育可以在室温下。所述注射器可安装滤器，其允许液体流过但截留沉淀的纤维蛋白原。除了贫血小板血浆之外或者用来代替贫血小板血浆，可抽取全血到含有抗凝血剂(如Ara-A)和乙醇的注射器中。当抗凝血剂与全血组合时，可改变用来沉淀纤维蛋白原的有机溶剂120(如乙醇)的体积以匹配全血中血浆的降低量。例如，Ilml全血可以与ImlACD-A以及2. 2ml乙醇组合。再回到图1，在沉淀130以后，去除所沉淀的蛋白质(包括纤维蛋白原)140以提供沉淀后液体。去除所沉淀的纤维蛋白原140可包括使用允许液体通过但截留所沉淀蛋白质(包括纤维蛋白原)的滤器过滤所述混合物。或者，可将所沉淀的蛋白质(包括纤维蛋白原)离心以使得沉淀的纤维蛋白原聚集成团或沉积下来，收集液体上清作为沉淀后液体。如170所示，随后，将沉淀后液体与珠150和钙160混合并孵育以形成凝块。所述钙可包括钙盐，如氯化钙、碳酸钙、硫酸钙和其组合。所述钙可以以固体形式(如盐晶体)提供，其可预先测定，从而根据特定的容器体积来提供特定的浓度。或者，钙可以以被沉淀后液体稀释的浓缩液的形式提供。在某些实施方案中，沉淀后液体可包含螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐，它们可因包含全血或血液级分的液体在沉淀步骤中用抗凝血剂处理而存在。向包含螯合剂的沉淀后液体中加入钙可以以下述方式进行提供的钙的终浓度大于可被螯合剂螯合的钙的量。在这种情况下，加入的钙提供了可参与凝血级联的未螯合钙。在某些实施方案中，沉淀后液体在如“美国专利7，694，828, Swift等，2010年4月3日授权”中所描述的装置中与珠150和钙160的结合。这种装置的一个实例为Clotalyst Autologous Clotting Factor System,由 Biomet Biologic, LLC(华沙，印第安纳州)出 售。例如，氯化钙可以在Clotalyst 管中提供，其可以是与所述珠一起装入管中的粉末形式或者以在使用前加入到Clotalyst Autologous Clotting Factor System管中的浓缩液体形式。与沉淀后液体体积混合的钙浓度可以为约3. 4X IO-4M,该钙浓度可逆转ACD-A的作用，后者按上面提到的体积和比例使用在沉淀步骤中来防止包含全血或血液级分的液体凝血。170中用来形成凝块的珠150包括活化珠如玻璃珠。所述珠可以帮助活化一部分沉淀后液体以产生凝血酶。多种珠包括玻璃珠、聚苯乙烯珠、或其他合适的珠。聚苯乙烯和/或玻璃珠150可活化沉淀后液体的多种成分以生产凝血酶，并且可帮助分离和浓缩凝血成分。比如，玻璃珠或聚苯乙烯珠可活化沉淀后液体中的血小板。所述珠可以是任何合适的尺寸，如约0. 001毫米至约3毫米。比如，玻璃珠可以在管中(如Clotalyst 装置的管)提供，其直径为约2毫米。在某些实施方案中，在形成凝块170中搅动沉淀后液体、珠、钙的混合物。搅动可以通过颠倒、震摇、摇动、搅拌或涡旋混合装有沉淀后液体、珠和钙的管或容器来完成。搅动可以实施一次、多次重复、周期性重复、或者可以是持续的。在某些情况下，使用混合组件来搅动沉淀后液体、珠和钙，如“美国专利7，694，828, Swift等，2010年4月3日授权”中描述的。在混合后或混合时可以保持沉淀后液体、珠、和钙相接触以形成凝块170。如混合物可以孵育约5分钟至约10分钟来使凝块形成。孵育可以在室温下。在某些实施方案中，混合物在高于室温的温度(如37°C )孵育，以促进凝块形成。如图I中180所示，使包含凝血酶的溶液与170中所形成的凝块分离。所述分离可包括离心所述凝块并取出部分上清作为包含凝血酶的溶液。离心所述凝块可引起所述珠、凝血物质以及任何残留细胞物质沉积并聚集成团，使得可倾出包含凝血酶的溶液上清或者将其从聚集成的团上吸去。例如，离心可以是在约3200RPM下约5分钟。吸去上清(即包含凝血酶的溶液)可以用注射器、移液管或别的合适方式实施。包含凝血酶的溶液可任选地进行浓缩，如190所示。浓缩可包括使用干燥剂如干燥用聚丙烯酰胺珠，其吸收凝血酶溶液中的部分液体但可具有小到足以防止凝血酶进入所述珠的孔径。然后，可将浓缩的凝血酶与液体填充的聚丙烯酰胺珠分离。别的方法也可以用来浓缩和/或分离凝血酶，包括沉淀、过滤、冷冻干燥、以及本领域所知的其他方法。这些包含凝血酶的溶液可以就这样使用或者可以保存起来备用。比如，所述凝血酶溶液可通过向含有凝血酶的溶液中加入甘油、多羟基化合物、或醇来保存；加入螯合剂以螯合所述包含凝血酶的溶液中的钙；将所述包含凝血酶的溶液的PH降低到低于7 ;和/或降低所述含有凝血酶的溶液的温度。图2中给出了制备包含凝血酶的溶液的另一个方法200。在210中，将贫血小板血浆吸取到含有乙醇的注射器中以沉淀纤维蛋白原。注射器中乙醇的量与抽到注射器中的贫血小板血浆的量成正比，从而有效地沉淀纤维蛋白原。比如，乙醇可以是贫血小板血浆总体积的25%。在一些实施方案中，所述注射器可设置成容纳特定量的贫血小板血浆，而含有对应于该量的25%的乙醇量。一旦纤维蛋白原沉淀，则通过与所述注射器相连的滤器注射所述液体至管中。滤器截留所沉淀的纤维蛋白原，还可截留液体中存在的任何血细胞、血小 板、以及其它沉淀的蛋白质。通过过滤获得沉淀后液体。如220所示，液体通过滤器注入含有珠和钙的管中。所述含有珠和钙的管可以是图5A和5B描述的分离装置。然后将含有沉淀后液体、珠和钙的管如230所示搅动并孵育以形成凝块。搅动和孵育可包括在至少为约20°C的温度(如37°C )下加热至少约20分钟。凝块形成之后，如240所示，通过离心使得加热的珠和固体凝块物质聚集成团；如250所述，之后取出包含凝血酶的液体上清。参考图5A和图5B,分离装置500 —般包含具有圆柱形壁以及第一端504和第二端506的本体,所述第一端和第二端限定了主室502。在第一端504处有第一口 508、第二口 510、第三口 512、开口 513 和滤器 514。第一口 508、第二口 510、第三口 512 和开口 513中的每一个都延伸穿过第一端504，并允许装置500的外部与主室502之间流体连通。第一口 508可盖有第一帽516，第二口 510可盖有第二帽518，第三口 512可盖有第三帽520。第一口 508的第一替代帽522可通过第一链524与第一口 508相连。当第一替代帽522不使用时，第一盖526可扣紧至第一替代帽522上。第二口 510的第二替代帽528可通过第二链530与第二口 510相连。当第二替代帽528不使用时，第二盖532可扣紧至第二替代帽528上。第一口 508和第二口 510各自包含截止阀以阻止物质(如玻璃珠540)通过第一口 508和第二口 510离开主室502。所述阀可以是任何合适的阀，如鸭嘴阀。特别参照图5B，第三口 512包含延伸到主室502内的延长管状部分534。延长部分534从第一端504延伸到主室502内允许吸取选定物质的深度，所述物质如凝血酶或其他凝血因子。例如以及如下文进一步描述的，当主室502包含沉淀后液体、玻璃珠和钙时，该混合物的孵育和离心在主室502的第二端506形成包含血细胞、血浆和玻璃珠的凝集团(clotted mass)。在凝集团的上面,在凝集团最接近第一端504的一侧,形成包含凝血酶和多种其他凝血因子的流出液。可凭借肉眼将第二端506上的凝集团与流出液区分开来。为了用延长管状部分534提取凝血酶以及其他凝血因子，所述延长管状部分534延伸到主室502内，其深度大约是最接近凝血团的流出液之部分的水平。在延长部分534的远端提供顶端附加物536。所述顶端附加物536大体上以直角从延长部分534上伸出。所述顶端附加物包含凹槽或凹口 537。两个支撑杆539大约在顶端附加物536处呈辐射状从延长部分534上伸出，以接触主室502的内部。支撑杆539使顶端附加物536偏向挨着主室502内部，以使顶端附加物536维持在主室502内的固定位置。当顶端附加物536接触到主室502内部时，凹口 537在主室502内壁和顶端附加物536之间提供了缺口或空隙，以允许物质穿过凹口 537并进入顶端附加物536。顶端附加物536帮助使得通过延长部分534抽取的物质的量最大化，特别是当使主室502倾斜以使得更多的围绕顶端附加物536的物质到达凹口 537上时。所述两个支撑杆539和顶端附加物536帮助使得延长部分536处于主室502的中央。口 508、510、和512的尺寸与合适的液体递送或转移装置(如注射器)相匹配。例如，第一口 508的尺寸可以与试剂注射器匹配以允许药剂通过第一口 508并进入主室502 ；第二口 510的尺寸可以与血液注射器匹配以允许血液通过第二口 510并进入主室502 ;以及第三口 512的尺寸可以与注射器匹配以允许从主室502中抽出血液成分(如凝血酶和其他凝血因子)。当物质通过第三口 512从主室502中抽出时，滤器514可以是任何适合过滤这些 物质的滤器。滤器514包含安装在第一口 508和第二口 510顶上的聚酯滤网。所述聚酯滤网包含尺寸为约15微米至约25微米范围的开口。比如，开口尺寸可以是约17微米。替代滤器514或除其以外，可以在延长部分534或顶端附加物536上提供与滤器514类似的滤器。主室502还包含活化剂，如玻璃珠540。玻璃珠带负电的表面活化凝固并释放凝血因子，其在主室502的第二端506上形成凝集团。玻璃珠540可以是任何合适类型的玻璃珠，如硼硅玻璃珠。用图5A和图5B中的装置产生包含凝血酶的溶液的方法可包括以下方面。首先，将包含氯化钙和乙醇的试剂通过第一口 908注入主室902中。试剂注入以后，用第一替代帽522关闭第一口 508。将沉淀后液体(如沉淀并除去纤维蛋白原的贫血小板血浆)通过第二口 510注入主室502中。沉淀后液体注入以后，用第二替代帽528关闭第二口 510。任选地，将注射器和血液分离装置500提前加热到约25°C的温度。通过反复颠倒分离装置500 (如约12次)，来混合装置500中的内容物，使得血液与玻璃珠接触。混合以后孵育该装置。孵育过程可以在一定的温度下持续一段时间，所述温度和时间将允许装置500的内容物在约25°C下加热约15分钟。在孵育时期完成时，在主室502的第二端506上形成红细胞、血浆、玻璃珠的凝集团。孵育完成以后，充分震摇装置500以除去和打碎任何可能存在的凝胶。然后将装置500放置在合适的离心机上在3200RPM下旋转约15分钟，以将凝血酶与其余血液成分分离。离心后，将凝血酶和其他凝血因子的流出液与凝集团分离。离心完成以后，取下第三帽520，并使用合适的抽取装置(如注射器)通过第三口 512、延长部位534和顶端附加物536从主室502中取出凝血酶和其他凝血因子的流出液。图3显示了制备包含凝血酶的溶液的另一个方法300。如320所示，将全血310抽吸到具有一定量A⑶-A的容器中以防止血液凝集。然后将所述抗凝集的血液与乙醇330混合来沉淀纤维蛋白原，以及将合并的液体离心并通过滤器以除去纤维蛋白原沉淀，此时将滤液(即沉淀后液体)收集到包含珠和钙的新容器中，如340所示。将沉淀后液体、珠和钙混合并孵育来形成凝块，如350所示，并且将其离心以使珠和凝块聚集成团，如360所示。然后，在370中，将液体部分或上清(为包含凝血酶的溶液)转移到包含干燥剂的另一个容器中。所述干燥剂从包含凝血酶的溶液中除去一部分液体。然后从干燥剂中分离出浓缩的凝血酶，如380所示。本方法可包括产生用作组织封闭剂的凝血酶，此时所述凝血酶可以直接使用或者可另外与其他凝血因子、血液成分或血液产品相组合。例如，所述包含凝血酶的溶液可以与纤维蛋白原混合，并作为纤维蛋白胶施用于创口、伤口或切口。凝血酶可以将纤维蛋白原转变为纤维蛋白(比如在约5秒至约60秒内)，其随后形成可密封所施用部位并促进这些部位愈合的纤维蛋白支架。在凝血酶活化后，纤维蛋白原交联形成三维基质。在某些实施方案中，向对象的部位施用组织封闭剂的方法包括根据本文公开的方法制备包含凝血酶的溶液。然后将所述包含凝血酶的溶液施用到对象的所述部位。例如，可用包含获得自对象的全血或血液级分的液体制备包含凝血酶的溶液，由此提供自体凝血酶。
施用组织封闭剂的方法还可包括在对象的所述部位施用纤维蛋白原和钙。纤维蛋白原和/或钙可与凝血酶相组合，或者这些成分可分开使用。在某些情况下，施用所述组织封闭剂包括共施用(i)包含纤维蛋白原的第一溶液(ii)包含凝血酶和钙的第二溶液。在这些实施方案中，第一溶液和第二溶液在施用前保持分开，使得直到溶液混合并施用到治疗部位凝血酶才活化纤维蛋白原以形成纤维蛋白基质。所述溶液可在临施用到治疗部位前混合，或者可在治疗部位混合。凝血酶、纤维蛋白原、和钙也可在施用到对象部位前就合并在一起以引发凝血级联。随着凝血级联的进展，凝胶样的物质开始形成，其随后可施用到部位以用作组织封闭剂。本发明组织封闭剂和方法可在外科手术(如整形外科手术)时用在切口部位、移植部位或修复部位。所述组织封闭剂可通过封闭所述部位帮助组织中切口愈合，并且之后还可有助于机体康复。除了纤维蛋白原和钙之外，根据本发明方法制备的包含凝血酶的组织封闭剂还可包含一种或多种血液成分。血液成分的实例包括全血、富血小板血浆、血小板浓缩物、贫血小板血浆或其浓缩物。当所述血液成分包含螯合剂(如柠檬酸盐)时，所述组织封闭剂可包含过量的钙来掩盖螯合剂并提供用于凝血级联的游离钙离子。本发明的方法和组合物可用于从多种来源(包括自体的、同源的、或异源)制备凝血酶。比如，可制备牛凝血酶以用作对人进行手术时的组织封闭剂。凝血酶还可以从同源来源得到，如相匹配的人供体。然而，在组织封闭中使用自体凝血酶和自体凝血因子(如自体纤维蛋白原和自体血液成分)是期望的，以降低感染、免疫反应、或使用非自体来源引起的其它副作用的可能性。因此，本发明方法可提供自体组织封闭剂，其可在对象接受外科手术或者治疗对象身上的创伤或外伤之前或期间制备。术语的非限制性讨论本文使用的标题(如“背景技术”和“发明内容”)和小标题只是为了一般性组织本公开内容的主题，并不是为了限制本发明的公开内容或其任何方面。特别的，在“背景技术”公开的主题可能包括新技术，可能不构成对现有技术的记载。在“发明内容”公开的主题，并不是对本发明或其任何实施方案整个范围的穷举性或完全的公开。由于具有特定的用途而在本说明书的某章节中对物质的分类或讨论仅是为方便起见，而不应推断出当其在任何给定组合物或方法中使用时所述物质必须或仅仅根据本文中的该分类发挥作用。本文引用的参考文献并不是承认这些参考文献为现有技术或者与本文所公开发明的专利性有任何关联。对技术领域和背景技术部分所引用的参考文件内容的任何讨论，只是为了提供参考文献作者观点的一般性总结，而不是承认这些参考文献内容的正确性。本说明书的具体实施方式
章节中引用的所有参考文献通过引用以整体并入本文。当给出本发明的实施方案时，描述和具体实施例的目的只是为了举例说明本发明而不旨在限制其范围。另外，具有所述特征的多个实施方案的记载并不旨在排除其他具有额外特征的实施方案或者并入所述特征的不同组合的实施方案。除非另外明确规定，提供具体实施例是为了举例说明怎样制备和使用本发明组合物和方法的目的，而不旨在陈述本发明给定的实施方案已制备或测试或者未制备或测试。可以在本发明范围内对某些实施方案、材料、组合物、和方法进行等同的改变、修改或变化，具有基本上类似的结果。本文使用的词语“期望”或“可以期望”指在特定的情况下提供某些优点的本发明的实施方案。然而，在相同的情况或别的情况下，别的实施方案也可能是“期望”的。此外， 一个或多个期望的实施方案的记载并不暗示其他实施方案不可用，也不旨在从本发明范围内排除其他实施方案。本文使用的词语“包括”以及它的多种变化形式意为非限制性的，使得列表中项目的记载不排除在本发明的物质、组合物、装置和方法中也可用的其他类似项目。类似的，术语“可”和“可以”以及其变化形式也意为非限制性的，使得对实施方案的记载“可”或“可以”包含某些要素或特征，而不排除不含有这些要素或特征的本发明的其他实施方案。尽管作为非限制性术语如“包含”、“含有”、“具有”同义词的开放式术语“包括”在本文中用于描述或限定本发明的实施方案，但是作为替代地，实施方案也可用更具限制性的术语如“由...组成”或“基本上由...组成”来描述。因此，对于记载物质、组分或过程步骤的任何给定的实施方案，本发明还特别包括由这些物质、组分或过程步骤组成或者基本上由其组成的实施方案，以排除额外的物质、组分或过程(由...组成)，以及排除影响实施方案重要性质的额外的物质、组分或过程(基本上由...组成)，即使这些额外物质、组分或过程未在本申请中明确记载。例如，记载了要素A、B和C的组合物或过程的叙述特别预想了由A、B和C组成以及基本上由其组成的实施方案，排除了在本领域可涉及的要素D，即使本文并没有明确指出排除要素D。除非另外规定，本文提到的组合物的所有百分比为以总组合物重量计。除非另外规定,范围的公开包括端点，包括公开内容的所有不同值，以及整个范围内进一步细分的范围。因此，比如，某范围为“从A至B”或者“从约A至约B”就包括了 A和B。对于特定参数(如温度、分子量、重量百分比等)，值和值的范围的公开并不排除其他本文有用的值和值的范围。对于给定的参数，认为两个或更多个具体示例的值可确定对于该参数所要求权利的值范围的端点。比如，如果在本文中举例说明参数X具有值Z，另外举例说明具有值Z，那么可认为参数X可具有约A至约Z的值的范围。类似的，认为对于参数(无论这些范围是嵌套的、重叠的还是不同的)，两个或更多值范围的公开包括了可使用所公开范围的端点要求权利的值范围的所有可能组合。例如，如果本文举例说明参数X具有1-10或2-9或3-8范围的值，那么可认为参数X可具有其他值的范围，包括1-9，1-8，1-3，1-2，2-10，2-8，2-3，3-10，和 3-9。
当提到要素或层位于另一要素或层“上”，或者与之“连接”、“相连”或“结合”时，则它可以直接位于另一要素或层上，与其连接、相连或结合，也可以存在介于它们之间的要素或层。相反的，当提到某一要素或层“直接位于”另一要素上，或者与之“直接连接”、“直接相连”或者“直接结合”时，就不存在介于它们之间的要素或层。其他用于描述要素间关系的词也应该按同样的使用方式理解(如“位于...之间”和“直接位于...之间”，“相邻 ”和“直接相邻”等)。本文使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出项之间的任何以及所有组合。
权利要求
1.用于制备包含凝血酶的溶液的方法，所述方法包括 从包含贫血小板血浆或全血的液体中沉淀纤维蛋白原； 从所述液体中除去沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后液体； 将所述沉淀后液体与钙和多个珠一起孵育以形成凝块；和 将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离。
2.根据权利要求I的方法，其中所述包含贫血小板血浆或全血的液体包含贫血小板血浆。
3.根据权利要求I的方法，其中所述包含贫血小板血浆或全血的液体还包含抗凝血剂。
4.根据权利要求3的方法，其中所述抗凝血剂包括酸-柠檬酸盐-葡萄糖溶液。
5.根据权利要求I的方法，其中所述沉淀步骤包括向所述包含贫血小板血浆或全血的液体中添加有机溶剂。
6.根据权利要求5的方法，其中所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮或其组合。
7.根据权利要求I的方法，其中所述孵育步骤包括孵育约5分钟至约10分钟。
8.根据权利要求I的方法，其中所述包含贫血小板血浆或全血的液体还包含螯合剂，并且钙以大于所述螯合剂可结合之量的量存在。
9.根据权利要求I的方法，其中所述珠包括玻璃珠、聚苯乙烯珠或其组合。
10.根据权利要求I的方法，其中将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离包括离心所述凝块和取出作为包含凝血酶之溶液的一部分上清。
11.根据权利要求I的方法，其还包括以下步骤中的至少之一向所述包含凝血酶的溶液中加入甘油、多羟基化合物或醇；向所述包含凝血酶的溶液中加入螯合剂以螯合钙；将所述包含凝血酶之溶液的PH调节到低于7 ;以及降低所述包含凝血酶之溶液的温度。
12.根据权利要求I的方法，其中 从包含贫血小板血浆或全血的液体中沉淀纤维蛋白原包括向贫血小板血浆中添加乙醇； 从所述液体中除去沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后液体包括过滤所述液体； 将所述沉淀后液体与钙和多个珠一起孵育以形成凝块包括将所述沉淀后液体、氯化钙和珠混合；和 将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离包括将所述凝块离心并取出作为包含凝血酶之溶液的一部分上清。
13.根据权利要求I的方法，其中 从包含贫血小板血浆或全血的液体中沉淀纤维蛋白原包括将贫血小板血浆或全血抽吸到含有乙醇的注射器中，其中当所述液体包含全血时，所述注射器中还含有抗凝血剂；从所述液体中除去沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后液体包括将滤器与所述注射器相连并将所述液体过滤进包含所述钙和所述多个珠的管中； 将所述沉淀后液体与钙和多个珠一起孵育以形成凝块包括将所述沉淀后液体、氯化钙和珠在所述管中混合；以及 将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离包括离心所述凝块并取出作为包含凝血酶之溶液的一部分上清。
14.根据权利要求13的方法，其还包括浓缩所述包含凝血酶的溶液。
15.根据权利要求14的方法，其中浓缩所述包含凝血酶的溶液包括将所述溶液与聚丙烯酰胺珠一起孵育。
16.用于向对象的部位施用组织封闭剂的方法，其包括 根据权利要求I的方法制备包含凝血酶的溶液； 向所述对象的所述部位施用所述包含凝血酶的溶液。
17.根据权利要求16的方法，其中使用包含获得自所述对象的全血或血液级分的液体制备所述包含凝血酶的溶液。
18.用于在具有混合组件的容器中由全血样品制备包含凝血酶之溶液的方法，所述方法包括 采集全血样品； 沉淀所述全血样品中的纤维蛋白原； 通过过滤所述全血样品或离心所述全血样品以使得沉淀的纤维蛋白原沉积下来，从而从所述全血样品中除去沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后全血样品； 将所述沉淀后全血样品引入所述容器中； 将所述沉淀后全血样品与钙盐和活化珠混合；和 在将所述沉淀后全血样品与所述成分混合后，从所述容器中抽出一定体积的包含凝血酶的溶液。
19.根据权利要求18的方法，其中所述沉淀步骤包括添加选自甲醇、乙醇、丙酮、和其组合的有机溶剂。
20.根据权利要求18的方法，其还包括将乙醇混入所述混合的沉淀后全血样品，以得到在所述混合的沉淀后全血样品中约4%至约7%的乙醇浓度。
21.根据权利要求18的方法，其中将所述沉淀后全血样品与聚丙烯酰胺珠混合。
22.用于向对象的部位施用组织封闭剂的方法，其包括 根据权利要求18的方法制备包含凝血酶的溶液；和 向所述对象的所述部位施用所述包含凝血酶的溶液。
23.根据权利要求22的方法，其中使用从所述对象采集的全血样品制备所述包含凝血酶的溶液。
24.根据权利要求22的方法，其中所述施用包括共施用(i)包含纤维蛋白原的第一溶液和(ii)第二溶液，所述第二溶液包含所述包含凝血酶的溶液和钙。
全文摘要
本发明涉及有关生成和使用凝血酶的方法、装置和组合物。所述方法包括通过从液体中沉淀纤维蛋白原来制备包含凝血酶的溶液，所述液体包含全血或血液级分。从所述液体中除去所沉淀的纤维蛋白原，以形成沉淀后液体，所述沉淀后液体与钙、多个珠一起孵育以形成凝块。将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离。由此制备的凝血酶可用作组织封闭剂，以及用在给对象施用组织封闭剂(包括施用自体组织封闭剂)的方法中。
文档编号C12N9/74GK102766616SQ20121013539
公开日2012年11月7日 申请日期2012年5月2日 优先权日2011年5月2日
发明者希拉里·奥弗霍尔泽, 珍妮弗·E·沃德尔-马伊 申请人:拜欧米特生物制剂有限责任公司