专利名称：一种富硒酵母中硒蛋氨酸的检测方法
技术领域：
本发明属于食品分析领域，涉及一种测定富硒酵母中硒蛋氨酸的高效液相色谱 (HPLC)方法。
背景技术：
功能性酵母指筛选适宜的酵母菌种，通过控制其生长环境，使酵母在生长过程中富集培养基中的某类营养素并经酵母体内代谢转化为某类人群需要的特殊活性物质。目前国内最成熟的功能性酵母产品为富硒酵母，其选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，并在生产中向培养基中加入亚硒酸盐等无机硒制剂，酵母获取无机硒后将其转化为主要以硒蛋氨酸形式存在的有机硒(有机硒指与生物大分子结合或参与生物大分子合成的硒)；又因有机硒较无机硒更易被人体吸收利用，副作用更少，富硒酵母因此成为当代富硒营养补充剂生产中最佳的原料。硒蛋氨酸不仅是富硒酵母中含量最丰富的硒化物，含硒量占酵母总硒含量 60-80%，其同时也是研究证实的生物有效性最高的硒化物。硒蛋氨酸被人体吸收后或先经转硒途径转化为硒半胱氨酸，再经β -裂解酶还原为硒化氢，氢化硒则或作为活性前体参与体内硒蛋白合成，或经生物甲基化反应生成单甲基硒、双甲基硒及三甲基硒后被排出体外；或当硒蛋氨酸摄入过量时，经Y-裂解酶还原形成活性硒中间体甲基硒醇(CH3SeH)； 或随机地取代蛋氨酸参与机体蛋白质的合成，其取代频率依赖于食物中硒蛋氨酸和蛋氨酸的比例；或作为硒的储存形式在机体摄入硒量减少时以蛋白降解的方式将硒释放出来，并通过转硒途径或Y-裂解反应参与含硒酶的合成。研究认为，因硒元素与硫元素的性质相近，酵母从环境中摄取硒元素后可将其作为硫元素的替代用于蛋氨酸的生物合成进而生成硒蛋氨酸，取代的频率取决于酵母体内硒的浓度。富硒酵母中硒蛋氨酸的浓度是其质量和营养价值的一个重要反应，这就需要对富硒酵母中的硒蛋氨酸进行分离分析和定量检测。由于富硒酵母基质复杂且硒蛋氨酸容易被氧化，增加了其中硒蛋氨酸的萃取难度和检测难度。目前研究上普遍采用HPLC-ICP-MS法、HPLC-ESI-MS/HPLC-ESI-MS/MS法对富硒酵母进行硒的形态分析，对仪器设备条件要求严苛，实验成本昂贵，难以适应实验室常规检测要求，方法不易普及。因此，研究并建立一种准确、简便、经济、且易于推广的富硒酵母中硒蛋氨酸的检测方法十分必要。引证文献1.Aleksandra Polatajko, Magdalena Sliwka-Kaszynska, Mihaly Dernovics, Rafal Ruzik, Jorge Ruiz Encinar and Joanna Szpunar. A systematic approach to selenium speciation in selenized yeast[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry,2004,19(1) :114-120.2. H. Chassaigne, C. C. Chery, G. Bordin, A. R. Rodriguez. Development of new analytical methods for selenium speciation in selenium-enriched yeast material[J], Journal of Chromatography A,976(2002),409-422.
3. Susan M. bird，Peter C Uden, Julian F. Tyson, Eric Block， Eric Denoyer.Speciation of Selenoamino Acids and Organoselenium Compounds in Selenium—enriched Yeast Using High-performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, July 1997, Vol. 12(785-788).4.Laura Hinojosa Reyes，Jorge Ruiz Encinar,Juan Manuel Marchante-Gayon, JoseIgnacio Garcia Alonso，Alfredo Sanz-Medel. Selenium bioaccessibility assessment in selenized yeast after “in vitro，，gastrointestinal digestion using two-dimensional chromatography and mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，1110 (2006) 108-116.5. Zoyne Pedrero, Yolanda Madrid. Novel approaches for selenium speciation in foodstuffs and biological specimens :A review [J]. Analytica Chimica Acta 634(2009)135-152.6.Johann Far，Hugues Preud’ homme，Ryszard Lobinski.Detection and identification of hydrophilic selenium compounds in selenium-rich yeast by size exclusion-microbore normal-phase HPLC with the on-line ICP-MS and electrospray Q-TOF-MS detection[J]. Analytica Chimica Acta 657(2010) 175-190·7. Peter C. Uden, Harriet Totoe Boakye, Chethaka Kahakachchi, Julian F. Tyson. Selective detection and identification of Se containing compounds-review and recent developments[J]. Journal of Chromatography A， 1050(2004)85-93.8. Erik H. Larsen，Marianne Hansen，Teresa Fan，Martin Vahl. Speciation of selenoamino acids， selenonium ions and inorganic selenium by ion exchange HPLC with mass spectrometric detection and its application to yeast and algae [J]. J. Anal. At. Spectrom.，2001，16，1403-1408·9. L Hino josa. Reyes, F. MorenoSanz, P. HerreroEspi lez，J. M. Marchante-Gayon, J.I.Garcia Alonso, A.Sanz-Medel.Biosynthesis of isotopically enriched selenomethionine application to its accurate determination in selenium-enriched yeast by isotope dilution analysis HPLC-ICP-MS[J]. J. Anal. At.Spectrom.，2004，19，1230-1235.10. Corinne Casiot，Veronique Vacchina，Hubert Chassaigne，Joanna Szpunar, Martine Potin-Gautier, Ryszard Lobinski . An approach to the identification of selenium species in yeast extracts using pneumatically-assisted electrospray tandem mass spectrometry[J]. Anal. Commun. ,1999,36,77-80.11. Corinne Casiot，Joanna Szpunar, Ryszard Lobifiski，Martine Potin-Gautier. Sample preparation and HPLC separation approaches to speciation analysis of selenium in yeast by ICP-MS[J]. J. Anal. At. Spectrom.，1999，14， 645-650.12.Erik H. Larsen，Jens Sloth，Marianne Hansena，Sven Moesgaard. Seleniumspeciation and isotope composition in 77Se_enriched yeast using gradient elution HPLC separation and ICP-dynamic reaction cell-MS[J]. J. Anal. At. Spectrom.,2003, 18,310-316.
发明内容
本发明开发了一种富硒酵母中硒蛋氨酸的检测方法，该方法采用丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)检测富硒酵母中硒蛋氨酸，从而为富硒酵母的营养与质量评价提供了一种便利、有效的手段。本方法具有准确、经济、简便、灵敏度高、重复性好、 精密度高等特点。本发明提供一种富硒酵母中硒蛋氨酸的检测方法，包括(1)采用物理方法破坏富硒酵母的细胞壁，称取0. Ig富硒酵母粉末于玻璃瓶中，加入 5mL 0.05-1.0% DTT (w/v)0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7. 4)，40mg 链霉蛋白酶，于 37°C摇床振摇反应Mh，待酶解液冷却至室温，向酶解液中加入蛋白沉淀剂，充分混勻后于 3000rpm离心lOmin，取上清液分析；(2)取200 μ L上清液，加入1. 80mL碳酸钠缓冲液，ImL 6000mg/L丹磺酰氯溶液，于60°C水浴衍生池，加入0. ImL 20mg/mL盐酸甲胺溶液结束衍生反应，于避光处静置 15min ；(3)高效液相色谱对衍生液进行组分分离，荧光检测器检测，采用外标法计算硒蛋氨酸的含量衍生后的富硒酵母酶解液经微孔滤膜过滤后进样测定。所述的高效液相色谱仪采用C18柱Q50mmX 4. 6mm,粒径5 μ m)，柱温度30°C ；进样量10 μ L ；梯度洗脱，洗脱程序如表 1 表1梯度洗脱程序
权利要求
1. 一种富硒酵母中硒蛋氨酸的检测方法，其特征在于(1)采用物理方法破坏富硒酵母的细胞壁，称取0.Ig富硒酵母粉末于玻璃瓶中，加入 5mL 0. 05mol/L 磷酸缓冲液(pH7. 4)含 0. 05-1. 0% DTT (w/v)，40mg 链霉蛋白酶，于 37°C摇床振摇Mh，待酶解液冷却至室温，向酶解液中加入蛋白沉淀剂，充分混勻后于3000rpm离心lOmin，取上清液分析；(2)取200μ L上清液，加入1. SmL碳酸钠缓冲液，ImL 6000mg/L丹磺酰氯衍生溶液，于 60°C水浴衍生浊，加入0. ImL 20mg/mL盐酸甲胺溶液结束衍生反应，于避光处静置15min，；(3)高效液相色谱对衍生液进行组分分离，荧光检测器检测，采用外标法计算硒蛋氨酸的含量衍生后的富硒酵母酶解液经微孔滤膜过滤后进样测定。所述的高效液相色谱仪采用C18柱O50mmX4. 6mm，粒径5 μ m)，柱温度30°C ；进样量10 μ L ；梯度洗脱，洗脱程序如表1 表1梯度洗脱程序时间(min)A (%)B (%)流速(mL/min)0.0086.014.01.05.0080.020.01.019.0074.125.91.023.0073.526.51.030.0073.027.01.038.0057.043.01.041.0032.068.01.045.0032.068.01.047.0014.086.01.052.0014.086.01.0注A为IOmM磷酸缓冲液N, N-二甲基甲酰胺，pH6. 55) ；B为乙腈，表中流动相比例均为体积百分比；硒蛋氨酸出峰时间29 31min。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤(1)中，所述细胞物理破壁方法是指液氮冷冻后研钵研磨破壁方法；
3.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤(1)中，所述磷酸缓冲液中DDT的浓度为 0. 05-1. 0%，最佳浓度为0. 1%。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤(1)中，所述蛋白沉淀剂为0.ImL 1. 5g/ mL亚铁氰化钾和0. ImL 3g/mL乙酸锌。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤⑵中，所述衍生条件为加入ImL碳酸钠缓冲液，ImL 6000mg/L丹磺酰氯衍生溶液，于60°C水浴衍生池。
全文摘要
本发明公开了一种富硒酵母中硒蛋氨酸的检测方法，属食品分析技术领域。主要步骤如下(1)酶解富硒酵母中结合型硒蛋氨酸(SeMet)；(2)以丹磺酰氯为衍生剂对硒蛋氨酸进行衍生化处理；(3)高效液相色谱-荧光法对衍生液组分分离与测定，采用外标法计算样品中硒蛋氨酸的含量。本发明通过对酶解条件及衍生过程的参数进行优化，解决了富硒酵母中硒蛋氨酸的提取及衍生的技术难题，建立了一种检测富硒酵母中硒蛋氨酸的HPLC-FLD方法，为富硒酵母的质量评价提供了一种准确、简便、经济的有效方法。
文档编号G01N30/02GK102288693SQ20111017771
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者熊正河, 钟其顶, 韦淑毅, 高洪波 申请人:中国食品发酵工业研究院