专利名称：含有高生物量的富硒酵母及其生产方法
技术领域：
本发明涉及发酵工业技术领域，特指一种含有高生物量的富硒酵母及其生产方法。
众所周知，硒是人和动物体内的一种必需微量元素，是生物体内谷胱甘肽过氧化合物的重要成分，有着多方面的生物学功能，其中最主要的生物学功能是清除生物体内产生的过多活性氧自由基，因而具有提高生物体免疫力、抗衰老、抗癌的作用。此外，环境砷中毒是一个世界性问题，其危害不仅表现为近期砷对人和动物的健康有害，更为严重的是引起人体远期恶性化改变——癌变、突变及畸变。依据砷-硒可以互为解毒剂的医学原理，加之硒具有抑制和抗癌变、抗突变及抗畸变的生物学功能，富含硒的酵母在预防和治疗地方性砷中毒方面将发挥显著的作用。此外，酵母细胞还含有丰富的蛋白质、核酸、维生素及机体必需的14种微量元素，对机体的健康有益。
近年来，尽管已有称做“富硒酵母”的生产，但这些生产存在明显的缺陷和不足其一是没有对酵母菌种进行任何筛选和育种，随机用一种酵母菌种，由于不同酵母菌种对硒的抗性有较大差异，从而对硒离子的吸收转化能力差异也很大。
其二是没有对生产发酵培养富硒酵母的培养基的硒离子浓度、培养条件进行优化，因此培养的酵母虽然称做“富硒酵母”，但是这种称做“富硒酵母”细胞的硒含量较低，酵母细胞的生物量也较低。
现有技术中生产称做“富硒酵母”细胞的方法大体有三种，第一种是采用混合处理方法，将一定量的硒酸盐或亚硒酸盐与酵母细胞混合而成。其主要缺陷在于其未将无机硒转化成为有机硒，这种硒酸盐或亚硒酸盐与酵母细胞混合在一起的所谓“富硒酵母”能使人和动物对其的吸收率很低，产生的生物学作用较差，不是真正的富硒酵母。
第二种是采用简单的吸附方法，将市场上的面包酵母或啤酒酵母细胞悬浮于含有硒酸盐或亚硒酸盐的水溶液中处理一定时间，使硒离子吸附于酵母细胞表面，其主要缺陷在于这种处理仍然不能将无机硒转化成为有机硒，这种吸附硒酸盐或亚硒酸盐的酵母细胞与上述第一种方法没有本质的区别，能使人或动物对其的吸收率很低，产生的生物学作用较差，同样不是真正的富硒酵母。
第三种是在含有硒离子的培养基中培养酵母细胞，但是对酵母菌种没有进行任何筛选和育种，随机用一种酵母菌种，其主要缺陷在于由于不同酵母菌种对硒的抗性有较大差异，从而对硒离子的吸收转化能力差异很大。此外，这种技术对培养基的硒离子浓度、培养条件未进行优化，因此采用这种技术培养的酵母中，有机硒含量较低，每克干酵母细胞含有机硒500微克以下、细胞生物量也低、从而经济效益也很低。
本发明的目的在于提供一种含有高生物量的富硒酵母及其生产方法，利用现代高新生物技术，依据不同酵母菌种的生理生化特性，通过筛选，获得生物量高的酵母菌种及细胞硒含量高的酵母菌种，然后采用杂交育种技术选育出高生物量和高硒含量的富硒酵母菌种，在优化的培养基中及发酵条件下发酵培养，通过适当的生产工艺，获得高生物量的富硒酵母产品，每克干富硒酵母细胞含有机硒达500-1500微克。
本发明的目的是这样实现的一种含有高生物量的富硒酵母，其特征在于它是通过筛选，制得生物量高的酵母菌种和抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种，然后采用杂交育种技术，选育出高生物量和高硒含量的富硒酵母菌种，在优化的培养基中发酵培养获得高生物量和高硒含量的富硒酵母，每克干富硒酵母细胞含有机硒达500-1500微克。
一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于它包括如下步骤
1)、制备高生物量的富硒酵母菌种通过分子育种的手段获得高生物量和高硒含量的富硒酵母优良菌种，其采用的方法是①依据不同酵母菌种的生理生化特性，在含有不同硒浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种；②对生物量高的酵母菌种以及抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种进行生孢、单倍体分离，经诱变筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株；③将分离到的生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌单倍体突变菌株进行杂交；④在选择培养基上筛选高生物量和高硒含量的二倍体杂交优良菌株，即富硒酵母菌种。
2)、发酵培养高生物量和高硒含量的富硒酵母(1)、发酵培养基配方选择8％～20％总糖量的麦芽汁，内含200～400微克/毫升的硒酸盐或400～600微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为4.5-7.0；(2)、发酵培养条件发酵培养高生物量和高硒含量的富硒酵母的培养条件是种子液的接种量为5-30％，在25-32℃的条件下，搅拌培养16-30小时；3)、生产高生物量和高硒含量的富硒酵母其生产工艺包括斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高富硒含量的富硒酵母，其各生产工艺如下(1)、斜面菌种富硒酵母菌种接种于含有总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁固体斜面上，在25-32℃培养24-72小时后，放入4℃冰箱保存；
(2)、液体菌种将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25-32℃搅拌培养14-20小时，即为液体菌种；(3)、一级液体种子培养将液体菌种按5～20％的接种量接入30个装有150毫升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25-32℃搅拌培养14-20小时，即为一级液体种子培养物；(4)、二级液体种子培养将一级种子培养液按5～20％的接种量接入装有45升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐，在25-32℃搅拌培养14-20小时，即为二级液体种子培养物；(5)、三级液体种子培养将二级种子培养液按10～30％的接种量接入装有450升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～600微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐，在25-32℃搅拌培养14-20小时，即为三级液体种子培养物。
(6)、发酵罐发酵培养将三级种子培养液按20～40％的接种量接入装有2250升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养14-24小时；(7)、收集酵母细胞及干燥采用板框压榨或离心收集富硒酵母细胞。在45～85℃条件下风干，水分小于10％；(8)、粉碎用粉碎机将风干的富硒酵母细胞粉碎；(9)、包装用不透气的包装袋包装，即为高生物量的高富硒含量的富硒酵母，每克干富硒酵母细胞含有机硒达500-1500微克。
该发酵培养基配方和发酵培养条件是总糖量为12％的水解糖，0.8％的玉米水解液，0.5％硫酸铵，300微克/毫升的硒酸盐或500微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为5.0，接种量为15％，在28-30℃的条件下，搅拌培养30小时。该发酵培养基配方和发酵培养条件是总糖量15％的糖蜜，1.0％的玉米水解液，0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，350微克/毫升的硒酸盐或450微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为6.0，接种量为20％，在26-28℃搅拌培养24小时。该高生物量和高硒含量的富硒酵母的生产工艺包括四级种子液培养。该高生物量和高硒含量的富硒酵母的生产工艺包括随实际生产条件做适当的增加或减少工艺的变化。
本发明的主要优点如下1、本发明使用的富硒酵母菌种，不仅具有高生物量，而且细胞的有机硒含量较高，其有机硒含量高达每克干细胞含500-1500微克，而现有技术技术生产的产品的有机硒含量为每克干细胞含有机硒500微克以下。
2、本发明的方法使用的发酵底物为普通的麦芽汁或用淀粉水解糖或糖蜜作发酵底物，只需调节其总糖含量，添加硒酸盐或亚硒酸盐，方法简单，成本低廉。
3、本发明的方法对发酵设备及条件没有特殊要求，一般发酵厂的设备和条件均可生产，生产投资较少。
4、本发明的方法生产的富硒酵母产品安全无毒，投资少、见效快、效益高。
5、本发明的方法实用性强，操作简便，易于普遍推广。
6、按本发明的方法生产的富硒酵母产品的生物量高，酵母细胞的有机硒含量高，质量好，每克干富硒酵母细胞含有机硒达500-1500微克。
下面结合较佳实施例和附图进一步说明。
图1是本发明的生产工艺流程示意图。
实施例1参阅
图1，本发明的高生物量的富硒酵母的生产方法包括如下步骤
1)、制备高生物量的富硒酵母菌种由于自然界中没有生物量和细胞硒含量同时都高的酵母菌种，只能通过分子育种的手段才能获得高生物量和高硒含量的富硒酵母优良菌种。本发明采用的方法是①依据不同酵母菌种的生理生化特性，在含有不同硒浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种。
②对生物量高的酵母菌种以及抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种进行生孢、单倍体分离，经诱变筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株。
③将分离到的生物量高的酵母菌单倍体突变菌株以及抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌单倍体突变菌株进行杂交育种。
④在选择培养基上筛选高生物量和高硒含量的二倍体杂交优良菌株，即富硒酵母菌种。
2)、在发酵培养基和优化的发酵培养条件上发酵培养高生物量和高硒含量的富硒酵母(1)、发酵培养基配方选择8％～20％总糖量的麦芽汁，内含200～400微克/毫升的硒酸盐或400～600微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为4.5-7.0。
(2)、优化的发酵培养条件发酵生产高生物量和高硒含量的富硒酵母的培养条件是富硒酵母菌种的接种量为5-30％，在25-32℃条件下，搅拌培养16-30小时。
3)、生产高生物量和高硒含量的富硒酵母产品其生产工艺包括斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高富硒含量的富硒酵母。下面对各生产工艺进一步说明如下(1)、斜面菌种富硒酵母菌种接种于含有总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升(或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升)的麦芽汁固体斜面上，在25-32℃的条件下，培养24-72小时后，放入4℃冰箱保存。
(2)、液体菌种将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升(或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升)的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25-32℃的条件下，搅拌培养14-20小时，即为液体菌种。
(3)、一级液体种子培养将液体菌种按5～20％的接种量接入装有150毫升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为400～600微克/毫升(或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升)的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25-32℃的条件下，搅拌培养14-20小时，即为一级液体种子培养物。
(4)、二级液体种子培养将一级种子培养液按5～20％的接种量接入装有45升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升(或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升)的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐，在25-32℃的条件下，搅拌培养14-20小时，即为二级液体种子培养物。
(5)、三级液体种子培养将二级种子培养液按10～30％的接种量接入装有450升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升(或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升)的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐，在25-32℃的条件下，搅拌培养14-20小时，即为三级液体种子培养物。
(6)、发酵罐发酵培养将三级种子培养液按20～40％的接种量接入装有2250升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升(或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升)的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃的条件下，搅拌培养14-24小时。
(7)、收集酵母细胞及干燥采用板框压榨或离心收集富硒酵母细胞。在45～85℃条件下风干，水分小于10％。
(8)、粉碎用粉碎机将风干的富硒酵母细胞粉碎。
(9)、包装用不透气的包装袋包装，即为高生物量的高富硒含量的富硒酵母，每克干富硒酵母细胞含有机硒达500-1500微克本发明的生产方法可根据厂家的发酵设备及条件，对以上工艺作适当增加或减少的调整变动。
实施例2本发明的生产方法依据不同地区的不同原料，可选择不同的发酵培养基配方、培养条件及高生物量和高硒含量的富硒酵母的生产工艺作适当增加或减少的调整变动。
本实施例是选择以淀粉水解糖为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是总糖量为12％淀粉水解糖，0.8％的玉米水解液，0.5％硫酸铵，350微克/毫升的硒酸盐或550微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为5.0，种子液的接种量为15％，在28-30℃的条件下，搅拌培养30小时。
其生产工艺包括斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高硒含量的富硒酵母。每克干富硒酵母细胞含有机硒达1000微克本实施例的生产工艺增加四级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养大体相同，其他工艺条件与实施例1基本相同，故不重述。
实施例3本实施例是选择以蔗糖糖蜜或甜菜糖蜜为培养基，其发酵培养基配方和培养条件是总糖量为15％的蔗糖糖蜜或甜菜糖蜜、1.0％的玉米水解液，0.8％硫酸铵，0.1％磷酸，300微克/毫升的硒酸盐或500微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为6.0，种子液的接种量为20％，26-28℃搅拌培养28小时。
其生产工艺包括液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→五级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高硒含量的富硒酵母。每克干富硒酵母细胞含有机硒达1200微克本实施例的生产工艺增加五级液体种子培养，其条件与三级液体种子培养大体相同，其他工艺条件与实施例2基本相同，故不重述。
综上所述，本发明的方法是充分利用微生物技术，依据不同酵母菌种的生理生化特性，通过筛选，获得生物量高的酵母菌种和抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种，然后采用杂交育种技术选育出高生物量和高硒含量的富硒酵母菌种，在优化的发酵培养基中发酵培养，获得高生物量和高硒含量的富硒酵母，这种高生物量和高硒含量的富硒酵母具有成本低、原料广泛、操作简便、发酵周期短、酵母细胞的生物量高和有机硒含量高等特点。采用本发明的生产富硒酵母方法，适合大规模的生产和因陋就简小批量的生产，具有广泛的实际应用前景，并具有重大的社会效益和巨大的经济效益。
权利要求
1.一种含有高生物量的富硒酵母，其特征在于它是通过筛选，获得生物量高的酵母菌种和抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种，然后采用杂交育种技术，选育出高生物量和高硒含量的富硒酵母菌种，在发酵培养基和优化的发酵条件下，发酵培养生产含有高生物量的富硒酵母，每克干富硒酵母细胞含有机硒达500-1500微克。
2.一种含有高生物量的富硒酵母的生产方法，其特征在于它包括如下步骤1)、制备高生物量的富硒酵母菌种通过分子育种的手段获得高生物量和高硒含量的富硒酵母优良菌种，其采用的方法是①依据不同酵母菌种的生理生化特性，在含有不同硒浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种；②对生物量高的酵母菌种以及抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种进行生孢、单倍体分离，经诱变筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株；③将分离到的生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌单倍体突变菌株进行杂交；④在选择培养基上筛选高生物量和高硒含量的二倍体杂交优良菌株，即富硒酵母菌种。2)、发酵培养高生物量和高硒含量的富硒酵母(1)、发酵培养基配方选择8％～20％总糖量的麦芽汁，内含有200～400微克/毫升的硒酸盐或400～600微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为4.5-7.0；(2)、发酵培养条件发酵生产高生物量和高硒含量的富硒酵母的培养条件是种子液接种量为5-30％，在25-32℃的条件下，搅拌培养16-30小时；3)、生产高生物量和高硒含量的富硒酵母其生产工艺包括如下步骤斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高富硒含量的富硒酵母，其各生产工艺如下(1)、斜面菌种富硒酵母菌种接种于含有总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁固体斜面上，在25-32℃培养24-72小时后，放入4℃冰箱保存；(2)、液体菌种将保存的富硒酵母菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～800微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，于25-32℃搅拌培养14-20小时即为液体菌种；(3)、一级液体种子培养将液体菌种按5～20％的接种量接入30个装有150毫升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25-32℃搅拌培养14-20小时，即为一级液体种子培养物；(4)、二级液体种子培养将一级种子培养液按5～20％的接种量接入装有45升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐，在25-32℃搅拌培养14-20小时，即为二级液体种子培养物；(5)、三级液体种子培养将二级种子培养液按10～30％的接种量接入装有450升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐，在25-32℃搅拌培养14-20小时，即为三级液体种子培养物。(6)、发酵罐发酵培养将三级种子培养液按20～40％的接种量接入装有2250升总糖含量为8-20％、硒酸盐浓度为200～400微克/毫升或用亚硒酸盐，其浓度为400～600微克/毫升的麦芽汁培养基的发酵罐，在25-32℃搅拌培养14-24小时；(7)、收集酵母细胞及干燥采用板框压榨或离心收集富硒酵母细胞。在45～85℃条件下风干，水分小于10％；(8)、粉碎用粉碎机将风干的富硒酵母细胞粉碎；(9)、包装用不透气的包装袋包装，即为高生物量的高富硒含量的富硒酵母，每克干富硒酵母细胞含有机硒达500-1500微克。
3.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于该发酵培养基配方和培养条件是总糖量为12％淀粉水解糖，0.8％的玉米水解液，0.5％硫酸铵，350微克/毫升的硒酸盐或550微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为5.0，种子液的接种量为15％，在28-30℃的条件下，搅拌培养30小时。
4.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于该发酵培养基的配方和培养条件是总糖量为15％的糖蜜、1.0％的玉米水解液，0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，300微克/毫升的硒酸盐或500微克/毫升的亚硒酸盐，培养基的pH为6.0，种子液的接种量为20％，在26-28℃搅拌培养24小时。
5.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于该高生物量和高硒含量的富硒酵母的生产工艺包括四级液体种子培养。
6.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于该高生物量和高硒含量的富硒酵母的生产工艺包括随实际生产条件做适当的增加或减少工艺的变化。
全文摘要
一种含有高生物量的富硒酵母及其生产方法,它是通过筛选,获得生物量高的酵母菌种和抗硒能力强及细胞硒含量高的酵母菌种,然后采用杂交育种技术,选育出高生物量和高硒含量的富硒酵母菌种,在发酵培养基和优化的发酵条件下,发酵培养制得高生物量的富硒酵母,每克干富硒酵母细胞含有机硒达500－1500微克。本发明生产的富硒酵母安全无毒,投资少、见效快、效益高。其生产方法实用性强,操作简便,易于大批量生产或因陋就简普遍推广应用。
文档编号C12N15/01GK1309177SQ01100600
公开日2001年8月22日 申请日期2001年1月17日 优先权日2001年1月17日
发明者张博润, 何秀萍, 铁翠娟 申请人:中国科学院微生物研究所