专利名称：一种重组单纯疱疹病毒的构建及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术发明领域。具体涉及一种重组单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)的构建及用途。本发明提出的重组单纯疱疹病毒是一种“含可控卸除包装信号的HSV重组病毒”。
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科，代表株是1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。HSV-1能感染几乎所有类型的细胞，尤其具有嗜神经细胞的特点，可经神经细胞的突触顺行或逆行传播，并能在神经元中建立稳定的隐性感染而不影响神经细胞的功能。因此，HSV-1可望用作将外源基因导入机体细胞、尤其是神经细胞的一种新型病毒载体。
HSV-1基因组是一个分子量为152kb的双链线状DNA，它由通过共价结合的长片段(L)和短片段(S)组成。L和S分别占整个基因组的82％和18％，L和S的两端都含有反向重复序列(inverted repeat)，分别存在于基因组的内部(IRL,IRS)和末端(TRL,TRS)，中间是独特的UL和US序列。L片段两端的反向重复以ab和b'a'表示，S片段两端以a'c'和ca表示。通常在L-S连接区以及L片段末端a序列重复的拷贝数是不同的，但在S片段末端通常只有单拷贝的a。标准的HSV-1基因组可表示为anb-UL-b'a'mc'-Us-ca,n和m从1-10不等。a中包含病毒基因组的切割和包装信号，HSV感染细胞后，其线状基因组闭合成环状，并在细胞核内进行滚环复制，产生首尾相连的大DNA链，称为嵌合体(concatemer)。嵌合体在a处被病毒衣壳蛋白识别，被切割成病毒基因组大小的DNA，并包装进衣壳中。a序列在不同的HSV-1株中大小从280-550bp不等。它包含多个同向重复(DR)和特异(U)序列。比如，在HSV-1(F)病毒株中，a序列结构为DR1-Uc-(DR4)x-(DR2)Y-Ub-DR1，其中DR1,DR2和DR4分别长20,12和37bp,Uc和Ub长58和64bp。HSV-1基因组的嵌合体的切割发生在两个a拷贝之间的DR1处。L和S片段的游离末端各只含20bpDR1的一部分，其中L片段的末端a序列包含18 bp和一个3'突出端，S片段的末端a序列仅有1bp和一个3'突出端。当线状双链的病毒DNA环化时，由此两末端共同构成完整的DRl。因此从环化的病毒基因组角度看，其上有两个含a的区域，以下简称pac(package)。这两个pac分别位于病毒基因组的两个L和S片段的结合处，它们是病毒基因组的包装信号。研究表明一个pac就能完成病毒基因组的切割和包装功能，但是如果两个pac都缺失，病毒基因组在细胞中产生的嵌合体无法被进一步切割和包装进病毒衣壳中，从而无法产生下一代病毒。
本发明所提出的重组HSV，以下简称rHSV/LaL-MtCre，其特征在于以下三点(1)HSV-1基因组中原有的两个包装信号pac缺失；(2)在基因组的某一位点插如了一个经过改造的包装信号，该包装信号两侧各带有一个同向排列的loxP序列。loxP序列是重组酶Cre的特异识别位点。(3)在病毒基因组的另一位点插入了一个表达Cre的基因cre，该基因上游是一个金属硫蛋白(metallothioneine,Mt)启动子，该启动子只在环境中锌离子浓度达到一定水平时，才启动cre基因的表达。
除本发明使用的噬菌体P1 Cre/loxP系统外，其它类似的DNA重组酶系统，比如酵母Flp/Frt系统(Mark et al.Nucleic Acids Research,20,4451-4455(1992))和R/Ft(Kilby et al 1993,TIG9,413-420)也能用于本发明中。除本发明提出的金属硫蛋白启动子外，可调控的启动子还可以是其它类型激素(肾上腺皮质激素glucocorticoids GRE，黄体酮progesterones PRE，雌激素estrogens ERE等)，病毒蛋白(含TRA或RRE的启动子相应被HIV的TAT或REV蛋白激活)或是细胞来源的调控物质(含有UAS-Ga14序列受Ga14激活)，或是细菌四环素启动子(受tTA的激活)等。
重组酶Cre是噬菌体编码的343个氨基酸的多肽链，它能特异地使两个同向排列的loxP序列(34碱基对)发生重组，从而导致其间的DNA的缺失。Cre重组酶作用于loxP，不依赖于DNA的复制和外源能量(比如ATP)，而且对原核或真核、超螺旋或线性DNA都起作用。(Sternberg,N.,Hamilton,D.,J.Mol.Biol.1981,150,467-486)。本发明所构建的rHSV/LaL-MtCre中，loxP-pae-loxP插在HSV-1 UL44基因(非必需基因，编码病毒糖蛋白C)的Xbal位点中，MtCre基因插在HSV-1 UL2基因(非必需基因，编码病毒尿嘧啶-DNA糖基化酶)的XbaⅠ位点中(附
图1为重组病毒rHSV/LaL-MtCre的构建图)。经转染进细胞的5个粘粒上的病毒基因组片段发生同源重组，形成环状的病毒基因组。后者进行滚环复制形成头尾相接的嵌合体，同时表达病毒的早、中、晚期蛋白，并将嵌合体切割成152kb左右的线状基因组。由于嵌合体的切割发生在pac中的a的内部，因此pac被切成两段，分别位于rHSV/LaL-MtCre线状基因组的两末端，形成‘pac-loxP-基因组-loxP-pac’的结构。rHSV/LaL-MtCre感染细胞后，该基因组两端的pac相连，形成环状基因组，进行病毒基因组的复制和包装。
当rHSV/LaL-MtCre感染普通的HSV-1敏感细胞时，Cre重组酶不表达，rHSV/LaL-MtCre能正常复制和扩增；当rHSV/LaL-MtCre感染的细胞中含有适量的锌离子时，Mt启动子被激活，cre基因表达Cre重组酶，Cre特异地将rHSV/LaL-MtCre的loxP-pac-loxP切除，切点处病毒DNA自动连接，不留缺口，因此rHSV/LaL-MtCre病毒无法包装出子代病毒，但病毒基因组仍可以在细胞中复制和表达。在本发明前，我们已经构建了一株重组HSV病毒rHSV/LaL(曹晖等，病毒学报，2000,16(4):374-377)(中国专利申请号99122067.6)，该病毒含loxP-pac-loxP，但不含可调控的Cre基因，因此它的包装信号是通过反式(如细胞株)表达的Cre蛋白来切除的。
本发明提出的rHSV/LaL-MtCre是通过对一套含有HSV-1病毒全基因组的粘粒质粒(SetC粘粒包括cos6,cos14,cos28,cos48,cos56)(CunninghamC.and Davison A.J.1993,Virology197:116-124)进行改造的基础上产生的。首先，将位于粘粒质粒cos6和cos48上的HSV-1基因组中原有的两个包装信号pac切除，成为cos6Δa和cos48Δa。然后，将两侧已装上同向排列的Cre重组酶特异识别位点loxP的pac插入cos56上的HSV-1的非必需基因UL44的XbaⅠ位点中，成为cos56/loxP-pac-loxP将带有金属硫蛋白启动子的cre基因插入cos6Δa的XbaⅠ位点中，成为cos6Δa-MtCre。将cos6Δa-MtCre、cos56/loxP-pac-loxP、cos28、cos14、cos48Δa五个粘粒经PacⅠ酶切去粘粒骨架部分后，用脂质体方法共转染HSV-1敏感细胞(如BHK-21)，5个HSV-1片段在细胞中发生同源重组而产生重组病毒rHSV/LaL-MtCre。该重组病毒能在不含锌离子的BHK-21细胞中稳定传代。在含适量锌离子的BHK-21细胞中不能或只产生少量子代病毒。
本发明提出的rHSV/LaL-MtCre可以进一步进行改造，以适应不同的要求。比如，将其基因组上的某些病毒感染所必需的基因(如包膜蛋白gH)去除，后者由细胞株反式提供，以达到进一步减少辅毒的目的。如果将HSV-1的γ34.5等基因去除，可以使其只感染分裂细胞，比如肿瘤细胞，而不感染非分裂细胞，比如肌体的正常细胞，因此除了用作辅助病毒，它还有望直接作为基因转移和基因治疗的载体，通过改变环境中的锌离子的浓度可以实现对该重组病毒的量的控制。
本发明提出的rHSV/LaL-MtCre有以下几方面的用途
(1)作为包装病毒载体的辅助病毒病毒载体在基因转移和基因治疗中起着非常重要的作用，HSV-1作为辅助病毒可以用于多种病毒载体的辅助包装。
1)作为HSV-1扩增子(amplicon)载体的辅助病毒。HSV-1能感染几乎所有类型的细胞，尤其具有嗜神经细胞的特点，可经神经细胞的突触顺行或逆行传播，并能在神经元中建立稳定的隐性感染而不影响神经细胞的功能。因此，以HSV-1为基础的病毒载体可望用作将外源基因导入机体细胞、尤其是神经细胞的一种新型病毒载体。HSV-1扩增子载体只含有HSV-1病毒复制和包装所必需的顺式元件，即复制子oris和包装信号pac，另外还包括需转移的外源基因以及原核复制子和抗性基因。扩增子病毒包装所需的反式元件通常由辅助病毒HSV-1或含病毒基因组的质粒DNA等辅助包装系统提供。因此扩增子病毒是一种高度缺损的病毒颗粒，它不含HSV病毒的结构基因，具有很好的安全性，且外源基因的包装容量大(大于30kb，理论上可达近150kb)。在能提供反式元件的细胞中，用转染方式进入细胞的HSV-1扩增子载体质粒经“滚环”复制产生头尾相接的嵌合体，然后被切割、包装成含多拷贝外源基因、DNA总长约150kb的假病毒。因此HSV-1扩增子载体有较高的外源基因表达量。例如，一个10Kb大小的扩增子质粒包装成一个150Kb的扩增子病毒，其中含有15个拷贝、首尾相接的这种扩增子质粒。与目前常用的几类病毒载体，比如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体相比，HSV-1扩增子病毒载体的优势在于载体含多个拷贝的外源基因，外源基因的表达量高、包装容量大(可包装大到15～30kb的外源基因片段)、载体构建简单等优点，因而在基因转移和基因治疗领域日益受到更多的关注。HSV-1扩增子载体已经被广泛用于基因转移和基因治疗的研究和临床前应用，并取得了显著的进展。但是，扩增子载体中往往含有大量的HSV-1辅助病毒，HSV-1具有细胞毒性。要使扩增子载体进入临床实验，必须减少直至完全去除辅助病毒。目前较常用的HSV-1扩增子载体辅助包装系统通常有以下两类一类是以HSV-1复制缺陷型突变株作为辅助病毒(Geller,A.I.,K.Keyomarski,J.Bryan,A.B.Pardee.1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8950-8954)。这类辅助病毒有的是缺失某个病毒复制所必需的基因，该基因编码的蛋白由细胞反式提供有的是温度敏感突变株，这种辅助病毒31℃时能正常复制，而37℃时不能复制。这种方法得到的扩增子病毒中含有大量辅助病毒，这些辅助病毒虽然无法正常复制，但仍有感染能力。此类辅助病毒有以下几个问题①辅助病毒的基因表达带来的细胞毒作用和免疫反应②辅助病毒和内源性病毒间潜在的相互作用③混合病毒中扩增子病毒与辅助病毒比例的波动而带来外源基因的不稳定表达；④辅助病毒潜在的致癌作用⑤辅助病毒回复成野生型病毒的可能。另一类是扩增子病毒载体的无辅毒包装系统，通常是将缺失包装信号的HSV-1基因组放在五个粘粒(Fraefel C,Song S,Lim F,et al.J virology,1996,70:7190～7197)或细菌人工染色体中(Stavropoulos TA,Strathdee C A.Virology,1998,72:137～7143),通过与扩增子质粒共转染方式导入细胞，为扩增子质粒的复制和包装成病毒提供反式蛋白，这种方式产生的扩增子病毒液中不含辅助病毒，但由于转染的效率较低而使扩增子病毒的滴度很低，而且每次生产都要进行大规模的多质粒共转染，从而难以获得临床实验所需量的扩增子病毒载体。本发明采用Cre-loxP系统将重组病毒rHSV/LaL-MtCre基因组的包装信号pac切除，病毒基因组在细胞中能复制和表达病毒的各种早、中、晚期蛋白，并产生病毒壳粒，但辅助病毒基因组无法组装进病毒壳粒。从而在保证扩增子质粒得到了足够量的病毒蛋白的同时，减少子代辅助病毒的产生。同时该方法得到的扩增子病毒可以在补充辅助病毒的条件下在细胞上传代和扩增，它与上述粘粒法或人工细胞染色体法需要反复转染相比，具有大规模生产的优势。
2)作为腺病毒相关病毒(AAV)载体的辅助病毒。AAV载体因对人不致病，安全性好、能感染多种类型的细胞、可介导外源基因的长期表达等特点，是目前较理想的基因治疗载体之一。AAV的复制需要辅助病毒的帮助，通常腺病毒或HSV-1可以作为AAV的辅助病毒。将AAV的rep和cap基因插入HSV-1基因组中，得到的重组HSV-1作为辅助病毒用于AAV载体的包装已经成功的将AAV载体的产生效率提高到103-4TU/cell以上，但是生产过程中伴随大量辅助病毒的产生，使产品的生产过程和制备最终安全性受影响。这可能成为AAV载体在临床应用中的隐患。在本发明的rHSV/LaL-MtCre中插入rep和cap，在有锌离子的条件下辅助包装AAV载体，辅助病毒基因组在细胞中复制和表达各种反式蛋白给AAV载体的复制和包装，而辅助病毒自己的基因组由于包装信号被切除，不产生子代辅助病毒，因此得到的AAV载体中的辅助病毒含量大大减少，提高了AAV载体中辅助病毒充分灭活的可靠性。
(2)作为基因转移和基因治疗的载体本发明提出的rHSV/LaL-MtCre可以作为基因转移和基因治疗的载体，通过调节环境中的锌离子的浓度，可以达到对细胞或肌体中的rHSV/LaL-MtCre的复制和扩增的控制，在DNA高效转移或基因治疗中作为载体。如果进一步将rHSV/LaL-MtCre基因组中的某些基因缺失、或加上某些靶向基因，使病毒特异性的在肿瘤细胞中增殖并破坏肿瘤细胞，有望用于恶性肿瘤等疾病的基因治疗。
(3)用于HSV-1空壳的制备病毒空壳在病毒免疫、基因转移和基因治疗、病毒及细胞的分子生物学基础研究中都有非常广阔的应用前景。本发明提出的rHSV/LaL-MtCre在锌离子条件下产生大量不含病毒DNA的病毒颗粒，经纯化后可得到大量HSV-1空壳。
除HSV-1外，本发明还可用于其它α疹病毒亚科病毒，如人2型单纯疱疹病毒(HSV-2)等的改造。除单纯疱疹病毒外，本发明可以用于其它疱疹病毒的扩增子载体的辅助病毒，比如作为α疱疹病毒亚科的Marek's disease virus(MDV)的扩增子载体(Camp et al,J Virol 65(11),1991,6320-6324)的辅助病毒。
本发明中用到的原始生物材料有SetC粘粒系统其中包含五个粘粒；cos6、cos28、cos14、cos56和cos48(Gunningham,C.and A.J.Davison1993,Virology197:116-124)cos6Δa、cos48Δa本室构建。在cos6和cos48的基础上,用recA辅助的限制性核酸内切酶切割法(Fraefel,C.,Song,S.,Gellex,A.I.,1996,Journal of Virology,70,7190-7197)分别去除了HSV-1的包装信号pac；pBS246质粒GIBCOBRL公司商品质粒，提供两个同向排列的loxP序列pMC-Cre表达含核定位信号(NL signal)的Cre重组酶蛋白(Hua Gu 1993,Cell 73:1155-1164)pCMVHyTK由美国南加州大学周辰博士提供pKS-Mt含金属硫蛋白(metallothioneine)启动子基因,本室构建p3zf-pac本室构建，含HSV-1的包装信号pBluescript KS(+)Stratagene公司商品质粒pcDNA2.1Invitrogene公司商品质粒
pAV53由本室伍志坚博士提供pHSV1-LacZ由本室吴小兵博士构建。
本发明cos56/loxP-pac-loxP粘粒的构建过程如下如附图2所示。用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切p3zf-pac，回收1.7kb的pac序列，插入pBluescript KS(+)(Stratagene公司)的相应位点中，成为pKS-pac。用Hind3和BamH1切下pKS-pac上的pac片段，插入pBS246(Gibco公司)的相应点中，成为pBS246-pac。用Pstl单酶切pAV53，回收约1kb的带一个Xba1酶切位点的小片段，插入pcDNA2.1的相应位点。筛选此Xba1位点与pcDNA2.1上的Xba1位点相距较近的克隆，成为pcDNA2.1-Xba1。用Not1酶切pBS246-pac，回收pac片段，插入pcDNA2.1-Xba1的相应位点中，成为pcDNA2.1-pac。再用Xba1酶切pcDNA2.1-pac，回收pac片段，插入cos56的Xba1位点中，成为cos56/loxP-pac-loxP。
本发明cos6Δa-MtCre粘粒的构建过程如下如附图3所示。用XhoⅠ和SmaⅠ双酶切pCMVHyTK，回收约2.0Kb的带质粒骨架和polyA的片段，与XhoⅠ和SmaⅠ双酶切pKS-Mt的800bp的Mt片段连接，得到pMtpolyA。MluⅠ酶切pMC-Cre，回收1.1kb的cre基因，补平后插入pMtpolyA的SmaⅠ位点中，筛选cre方向与Mt启动子方向一致的质粒，命名为pMt-Cre。用XhoⅠ和NotⅠ双酶切pMt-Cre，回收2.1kb的Mt-Cre片段，装上XbaⅠ接头后，插入cos6Δa的XbaⅠ位点中，得到cos6Δa-MtCre。
本发明提出的粘粒cos56/loxP-pac-loxP、cos6Δa-MtCre分别保存于大肠杆菌(E.coli.)DH5α株(MAXEfficiency DH5α,GIBCO#18258-012)中，在含有50-100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃传代培养。含有cos56/loxP-pac-loxP粘粒的菌种命名为cos56/loxP-pac-loxP/DH5α(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号0414)，含有cos6Δa-MtCre粘粒的菌种命名为cos6Δa-MtCre/DH5α(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号0529)。
以下实施对本发明的重组辅助病毒rHSV/LaL-MtCre的制备和用途作了详细说明，但不意味着限制本发明的内容。
实施例1rHSV/LaL-MtCre重组病毒的产生、传代和保存cos6Δa-MtCre,cos56-1oxP-pac-loxP,cos28,cos14,cos48Δa五个粘粒等浓度混合，用PacⅠ酶切后，分别用酚、酚氯仿、氯仿抽提，酒精沉淀后，用蒸馏水溶解DNA。取适量DNA，用LipofectAMINE(GIBCO公司)转染BHK-21细胞。48小时后挑取病毒斑。经过连续两次空斑纯化后，得到rHSV/LaL-MtCre重组病毒。
rHSV/LaL-MtCre重组病毒以MOI=0.1在约80％汇片的BHK-21细胞上37℃吸附1h后，加适量含10％胎牛血清培养液1640,37℃养约48小时，至完全病变。将细胞与上清一并收集，反复冻融三次，1500rpm离心5min，收集上清，测定滴度并保存在-70℃冰箱中。
实施例2rHSV/LaL-MtCre的功能检测将rHSV/LaL-MtCre和对照病毒HSV1-lacZ(吴小兵等，病毒学报，1998,14:359-364)分别感染在普通1640培养基和含200μM锌离子(ZnCl2)的1640培养基中培养的BHK-21细胞(MOI=0.1)，吸附1h后，洗去未吸附的病毒，用含10％胎牛血清的1640培养基继续培养48h后收毒，反复冻融3次，1,500rpm离心取上清，用空斑计数法分别测定病毒滴度。结果显示，rHSV/LaL-MtCre在含锌离子的1640培养基中的滴度比不含锌离子的普通1640培养基中的滴度低两个数量级，而对照病毒HSV1-1acZ在上述两种培养基中滴度无明显变化。说明锌离子能有效激活rHSV/LaL-MtCre上的Cre的表达，从而大幅减少子代病毒的产生。
实施例3rHSV/LaL-MtCre作为辅助病毒对扩增子病毒包装的功能检测按照GIBCOBRL公司LipofectAMINE产品说明书，将扩增子质粒pHSV-LacZ转染BHK-2]细胞，12h后，将该细胞等量一分为二，其中一份的培养基中加入终浓度为200μM的锌离子，另一份不加锌离子。24小时后，分别用rHSV/LaL-MtCre病毒以MOI=0.5感染，室温吸附1h，用无血清1640培养液洗细胞2次，用含10％胎牛血清1640培养液37℃培养。继续培养至细胞完全病变(约2-3天)。将细胞与上清一并收集，反复冻融3次，1500rpm离心5min，收集上清。
扩增子病毒和辅助病毒的滴度检测将分别从上述细胞中收集的病毒上清以10倍倍比稀释，感染BHK-21细胞，吸附1h后，洗去未吸附的病毒，37℃培养至出现病毒斑，用PBS液洗细胞3次，用固定液(含2％甲醛的PBS液)4℃固定5min，再用PBS液洗细胞3次，加检测液(含1mg/mlX-gal,2mmolMgCl2,5mmol铁氰化钾，5mmol亚铁氰化钾的PBS液)覆盖细胞，37℃作用6h，显微镜下分别对染蓝和未染蓝的细胞病变斑(毒斑)进行计数。结果显示含锌离子的细胞产生的病毒中，扩增子病毒(蓝色毒斑)的滴度达到108pfu/ml,rHSV/LaL-MtCre(未染蓝的毒斑)的滴度小于105pfu/ml而不含锌离子的BHK-21细胞产生的病毒中扩增子病毒的滴度只有106pfu/ml,rHSV/LaL-MtCre的滴度为107pfu/ml。该结果证明本发明能有效减少扩增子病毒中辅助病毒的含量，同时大幅增加扩增子病毒的滴度。
权利要求
本发明涉及一种重组单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)的构建和用途。1．一种重组HSV病毒，其特征在于由以下成分组成a)该重组HSV病毒基因组去除了HSV天然的包装信号序列，并插入了一个经过改造的HSV的包装信号序列，该包装信号序列两侧带有可被重组酶特异识别的重组序列。b)该重组HSV-1病毒基因组中插入了一个外源DNA片段，它表达一种重组酶。该重组酶特异性地识别a)中所述重组序列，从而介导重组序列间的重组。该重组酶基因上游是可调控启动子，它调控重组酶的表达。
2．根据权利要求1，权利要求1b)中描述的DNA片段是表达重组酶Cre基因的表达盒。
3．根据权利要求1、2，权利要求1a)中所述的可被重组酶特异识别的重组序列是两个同向排列的loxP。
4．根据权利要求1，权利要求1b)中所述的调控重组酶表达的启动子是金属硫蛋白启动子。
5．根据权利要求1，本发明提出的重组酶是酵母重组酶Flp。
6．根据权利要求5，重组酶Flp识别的位点是Frt重组序列。
7．根据权利要求1，本发明提出的重组酶是酵母重组酶R。
8．根据权利要求7，重组酶R识别的位点是Ft重组序列。
9．根据权利要求1，本发明提出的可调控的启动子是细菌四环素启动子。
10．根据权利要求1，本发明提出的可调控的启动子是肾上腺皮质激素调控启动子。
11．根据权利要求1，本发明提出的重组病毒作为辅助病毒用于HSV扩增子载体的包装。
12根据权利要求1，本发明提出的重组病毒用于其它需要HSV作辅助病毒的系统。
13根据权利要求1、11，本发明提出的重组病毒作为辅助病毒用于基因转移和基因治疗的临床应用。
14．根据权利要求1，本发明提出的重组病毒作为基因转移和基因治疗的载体。
15．根据权利要求1，表达单位插入HSV基因组的非必需基因区，以达到进一步减少子代病毒的滴度或降低其感染性的目的。
16．根据权利要求1，本发明提出的重组病毒用于不含DNA的单纯疱疹病毒空病毒颗粒的制备。
17．据权利要求1，HSV是人1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。
18．根据权利要求1，HSV是人2型单纯疱疹病毒(HSV-2)。
全文摘要
本发明提出了一种重组单纯疱疹病毒,其天然的包装信号(pac)已经缺失,取而代之的是一个经过改造的包装信号,该包装信号两端各带一个重组序列:loxP序列;在本重组病毒基因组中的另一处插入了一个编码特异识别上述重组序列的重组酶Cre的基因。该Cre的基因带有一个可调控的启动子；金属硫蛋白启动子,以控制Cre的表达。该重组病毒感染细胞后,加入适量锌离子激活金属硫蛋白启动子,表达重组酶Cre,Cre介导两个loxP序列间发生重组,将包装信号切除,从而病毒基因组虽然能复制和表达各种蛋白,但基因组无法包装进病毒衣壳中,因此不产生子代病毒。如果细胞中不加锌离子,Cre不表达,重组病毒基因组上的包装信号不被切除,因此该重组病毒能在细胞中可以正常复制和传代。本发明提出的重组病毒可以用作单纯疱疹病毒扩增子载体的辅助病毒,以及直接作为基因治疗载体用于恶性肿瘤的治疗,和用于病毒空壳的制备。
文档编号C12N15/52GK1299868SQ01100579
公开日2001年6月20日 申请日期2001年1月16日 优先权日2001年1月16日
发明者吴小兵, 曹晖, 侯云德 申请人:本元正阳基因技术股份有限公司