一种重组单纯疱疹病毒的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒纯化技术领域，更具体涉及到重组单纯疱瘆病毒的纯化方法，
【背景技术】
[0002]由I型单纯疱瘆病毒(HSV-1)改造而来的重组单纯疱瘆病毒(mtHSV)是一种溶瘤病毒，这种病毒能特异性的特异性杀伤肿瘤细胞，在肿瘤内注射mtHSV的动物实验和临床I期实验中均显示良好的安全性及对胶质瘤、宫颈癌及黑色素瘤、横纹肌肉瘤抗瘤效应。目前HSV-1变异缺失病毒G207通过I期临床试验，在恶性胶质瘤患者中使用后，发现延长了患者生存时间，初步证明其安全性和有效性。然而长期以来，仍然缺乏高效简便低成本的纯化方法。目前常规的主要有纯化病毒的方法主要有沉淀法、离心法、透析法和亲和层析法等，其中超速离心法是应用最广泛的一种方法。沉淀法和透析法纯化效果不佳，亲和层析法和氯化铯平衡密度梯度离心的纯化效果理想，但其价格昂贵，费用较高，不易推广。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就是针对目前常规的纯化病毒的方法上述之不足，而提供一种重组单纯疱瘆病毒的非连续蔗糖密度梯度离心纯化方法。
本发明包括如下步骤:
(I).将在Vero细胞中扩增得到的重组单纯疱瘆病毒上清液中加入5%的PEG8000，4°C搅拌6个小时或过夜，4°C 13500g离心2小时；
(II).沉淀用TNMC缓冲液溶解，并在溶液中加入η-十二烷基-β -D-麦芽苷促进沉淀的溶解；
(III).制备蔗糖密度梯度，将浓缩的mtHSV溶液加于蔗糖密度梯度顶层，37500 g离心力在4°C离心18小时；
(IV).将离心管底部刺穿，按一定体积量等体积收集，收集10管，取每管收集液的一部分做蛋白质电泳染色和Western blotting鉴定分析，将经鉴定分析确定了的病毒含量和纯度高的收集管冻存于_80°C或液氮罐中。
步骤(II)中 TNMC 缓冲液配方为 50 mM Tris.HCL100 mM NaCLlO mM CaCl2, ImM MgCl2。
η-十二烷基-β -D-麦芽苷的终浓度为20mM
步骤(III)中蔗糖密度梯度为5%，20%，25%，27.5%，30%，35%。
本发明所涉及到的试剂溶液配方如下:
磷酸盐缓冲液(PBS):
1.4 mM KH2PO48 mM Na2HPO4140 mM NaCl
2.7 mM KCl,pH 7.4 病毒生长液:
5OOmL MEM Medium100U/mL青霉素lOOPg/mL链霉素)
0.2%牛血清白蛋白组分V 25mM HEPES缓冲液 2Pg/mLTPCK-胰酶十二烷基麦芽苷存储液:
200 mM η-十二烷基-β-D-麦芽苷(10% W/V 十二烷基麦芽苷)(Anatrace D310S) 蛋白酶抑制剂存储液(1000 X):1 M溶于丙酮的苯甲基磺酰氟(PMSF) (Sigma L7626)
I mg/mL 亮抑酶肽(Sigma L2884)
1mg/mL 胃酶抑素(Sigma P4265)
蔗糖溶液:
向6个15 mL的聚丙稀离心管(Corning)中分别加入1.5g，2g，2.5g，2.75，3g和3.5g的蔗糖。
再向每个管中加入10 mL 50 mM Tris.HCl pH7.5，I mM EDTA，0.05%十二烷基麦芽苷。 将管子盖紧，放置在混悬仪上混合大约20分钟直到所有蔗糖溶解。
2X SDS上样缓冲液:
20%甘油
4% SDS
100 mM Tris pH 6.8
0.002%溴酚蓝
100 mM 二硫苏糖醇以下内容，为详细的方案:
1.病毒增殖
将80%-90%细胞密度的Vero细胞用10 mL的无菌移液管吸取6mL PBS分别清洗细胞3遍；每瓶细胞瓶中加I mL mtHSV病毒接种液，放置于37°C吸附I个小时；加入病毒生长液维持液于细胞瓶中，放37 °C恒温培养箱培养至75-100%细胞出现CPE病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于_70°C冰箱，冻融2?3次，4°C 6000g离心20分钟，去掉沉淀，收集病毒上清。
I1.病毒浓缩
上清液中加入5%的PEG8000，4°C搅拌6个小时或过夜，4°C 13500g离心2小时；沉淀用TNMC缓冲液溶解，并在溶液中加入η-十二烷基-β -D-麦芽苷到其浓度为20mM，促进沉淀的溶解，最后使其待离心纯化病毒样品终体积为浓缩前的1%。
II1.非连续蔗糖密度梯度离心
非连续蔗糖密度梯度的制备是用密度纸下而上逐级递减的蔗糖分层堆积而成，制备非连续密度梯度所需的蔗糖溶液浓度为15%，20%，25%，27.5%，30%，35%。这个梯度能很好的分离纯化mtHSV。具体制备方法见附图1。 15-35%蔗糖梯度制备的装法方法:在V部分介绍了蔗糖溶液的制备，蔗糖梯度制备是将密度低的蔗糖溶液压放在密度高的蔗糖溶液上这样逐级分层堆积而成，因此最底部的第一层应该放置35%的蔗糖溶液，附图1是制备的示意图。首先现将贝克曼异质同晶聚合物离心管垂直固定在管架上，将黄枪头(200 μ L)安置于蓝枪头(1000 μ L)末端，适当的调整以确保它们结合紧密以及黄枪头末端可以接触到离心管内壁。现在将35%蔗糖溶液灌入蓝枪头里面，在重力的作用下35%蔗糖溶液将缓慢而稳定的流入到离心管中。具体体积可以根据实际需求做适当调整。注意:如果溶液没有从枪头中流出可以向蓝枪头施加一定大力压力，方法就是轻轻敲打蓝枪头的阔端。35%蔗糖溶液流完后，立即将30%蔗糖溶液灌入到蓝枪头中，使其流入到离心管并覆盖在35%蔗糖溶液上。依照此方法依次将27.5%，25%，20%，15%的溶液加入到离心管中。最后将步骤II准备好的浓缩的病毒样品溶液小心加入到最离心管的最上层。
蔗糖梯度灌注完后肉眼可以看到不连续的分层，在顶层加入了样品溶液后应将离心管非常小心的放置在转子里，转子型号是贝克曼SW50.1型转子，于4°C，37500rpm(RCFav132000g)离心16.5小时，离心机加速度和减速度均为7。
离心结束后应立即从转子中取出离心管，要非常小心的拿离心管，千万不能打乱蔗糖密度层。
将离心管垂直用固定支架放置牢固，准备开始分部收集，用细小的针在离心管最底部扎一个很小的洞，使蔗糖溶液能够按大约每秒钟一滴的速度从管底流出，用EP管，分层收集到6管中。取每管收集