专利名称：一种黄酒生产过程质量控制快速检测方法
技术领域：
本发明属于食品分析和食品安全技术领域，涉及一种同时测定黄酒中氨基甲酸乙酯及其前体物质一尿素的高效液相色谱(HPLC)方法。
背景技术：
氨基甲酸乙酯(简称EC，又称脲烷)是一种具有基因致癌作用的物质，能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。世界卫生组织国际癌症研究机构已将EC归为2A类致癌物。 EC是烟草叶及香烟的天然成分，也是发酵食品(如面包，酸牛奶，乳酪等)和酒精饮料(如葡萄酒，苹果酒，中国黄酒和日本清酒等)的伴随产物。世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)食品添加剂专业委员会(JECFA)已于2005年对EC进行了系统评估，认为EC对人的危害主要来自酒精饮料的饮用。建议各国采取有效措施控制酒类产品中EC含量，保护消费者健康。研究认为，尿素是发酵酒中形成EC的主要前体物质之一，黄酒中90%的EC就是通过尿素与乙醇反应生成，黄酒中尿素含量水平直接关系到黄酒产品中EC的含量水平， 控制黄酒中尿素的含量是控制EC含量的关键。由于黄酒中成分复杂，增加了 EC和尿素的检测难度。传统的固相萃取-气相色谱/质谱联用(SPE-GC/MS)技术已成为美国分析化学师协会(AOAC)、欧盟以及国际葡萄与葡萄酒局(OIV)饮料酒中EC的标准检测方法，但该法样品前处理复杂、耗时且成本较高，难以适应实验室常规检测要求。近年来，有学者开发出利用高效液相色谱测定黄酒中EC的方法。目前，国内关于尿素的测定方法一般有四种。一是分光光度法；二是化学比色法； 三是脲酶法；四是红外技术，但这些方法灵敏度均较低且易受其他成分干扰。以分光光度法为例，具有与尿素类似结构的瓜氨酸会直接影响定量结果；而脲酶法，黄酒中铵离子含量会直接影响到黄酒尿素含量的准确测定。故上述检测方法不适用于酒类中尿素的测定。AOAC 推荐的尿素检测方法是通过测定尿素与9-羟基吨反应生成的二黄质基脲，溶于50%硫酸溶液后形成的黄色溶液的吸光度，进而确定尿素的含量。另外，国外P. Herbert等人建立了手动衍生利用HPLC测定葡萄酒中尿素含量的方法。Slona Clark等人在此基础上，建立了自动衍生HPLC测定葡萄酒中尿素含量的方法。HPLC技术是近年来发展较快的一种食品分析和食品安全检测方法，在食品科学领域中应用越来越广泛。尿素作为黄酒生产中一项安全控制指标，对控制黄酒中EC含量十分关键。黄酒中EC和尿素的含量已成为黄酒生产中涉及食品安全的重要监测指标。在黄酒安全生产质量监控中，EC和尿素是两项非常重要的安全指标，目前主要采用HPLC或GC/MS 方法分别测定的，但这对生产企业来讲，无论是在检测设备的投入还是检测人员的投入都面临很大压力。因此，建立一种能够同时检测黄酒中EC和尿素的快速、有效且易于推广的方法十分必要。引证文献[1]FSANZ. Ethyl Carbamate in Australian foods. Survey sampling andanalysis conducted 2007.[2] EFSA. Ethyl Carbamate and hydrocyanic acid in food and beverages-Scientific opinion of the panel on contaminants,2008.[3] Shona Clark, Paul S. Francis, Xavier A. Conlan, Neil W. Barnett, Determination of urea using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection after automated derivatisation with xanthydrol, J. Chromatography A,1161 (2007)207-213.[4]夏艳秋，朱强，汪志君.谨防黄酒中氨基甲酸乙酯的危害.酿酒，2004，31 (3) 51-53.[5]王晓娟，王德良等.降低发酵酒中尿素含量的研究进展.酿酒科技，2009，(2) 93-95.[6]王晓娟，傅力等.高效液相色谱测定黄酒中尿素的含量.食品工业科技，2009， (5) :317-319.
发明内容
本发明开发了一种黄酒过程质量控制快速检测方法，该方法利用柱前衍生 HPLC-FLD (高效液相色谱-荧光法)可同时检测黄酒中EC和尿素，从而为黄酒安全生产控制提供了一种便利、有效的手段。本方法具有样品前处理快速、简单、重复性好、精密度高、 检测成本低等特点。本发明提供一种黄酒生产过程质量控制快速检测方法，包括(1)取200 μ L黄酒样品用无水乙醇稀释定容至1000 μ L，获得稀释后的黄酒样
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BFI ；(2)量取400 μ L稀释酒样，加入600 μ L 9_羟基吨溶液(0. 02mol/L)和100 μ L盐酸溶液(1.5mol/L)，室温避光衍生一定时间后得到衍生化样品；(3)高效液相色谱对衍生化后的黄酒样品进行尿素和氨基甲酸乙酯的组分分离， 采用外标法计算尿素和氨基甲酸乙酯的含量衍生后的酒样经微孔滤膜过滤后进样测定。所述的高效液相色谱仪采用C18柱 (250mmX4. 6mm，粒径5 μ L)，检测温度35°C ；荧光检测器增益为10 ；进样量IOyL;梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序
权利要求
1. 一种黄酒生产过程质量控制快速检测方法，其特征在于(1)取200μ L黄酒样品用无水乙醇稀释定容至1000 μ L，获得稀释后的黄酒样品；(2)量取400μ L稀释酒样，加入600 μ L浓度为0. 02mol/L的9-羟基吨溶液和100 μ L 浓度为1.5mol/L盐酸溶液，室温避光衍生一定时间后得到衍生化样品；(3)高效液相色谱对衍生化后的黄酒样品进行尿素和氨基甲酸乙酯的组分分离，采用外标法计算尿素和氨基甲酸乙酯的含量衍生后的酒样经微孔滤膜过滤后进样测定。所述的高效液相色谱仪采用C18柱 (250mmX4. 6mm,粒径5 μ L)，检测温度35°C ；荧光检测器增益为10 ；进样量10 μ L ；梯度洗脱，程序如表1 表1梯度洗脱程序
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述乙醇为无水乙醇。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤O)中，所述衍生时间为60min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述乙酸钠溶液浓度为 0.02mol/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述荧光检测器参数为0 15min，λ ex = 213nm，λ em = 308nm ；15 30min，λ ex = 233nm，λ em = 600nmo
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述组分为尿素和氨基甲酸乙
全文摘要
本发明公开了一种黄酒生产过程质量控制快速检测方法，属食品分析和食品安全技术领域。主要步骤如下(1)黄酒样品首先用无水乙醇稀释定容；(2)稀释后的黄酒样品在盐酸溶液中与9-羟基吨溶液混合室温反应60min；(3)高效液相色谱对衍生化后的黄酒样品进行组分分离，采用外标法计算样品中尿素和氨基甲酸乙酯(EC)的含量。本发明通过对荧光检测器在不同时间段设定不同参数的方式，解决了同时测定黄酒中EC和尿素含量的技术难题，建立了一种可同时检测黄酒中EC和尿素的HPLC-FLD方法，为黄酒安全生产提供了一种快速、简便、灵敏、准确的有效监控手段。
文档编号G01N30/02GK102353728SQ20111017770
公开日2012年2月15日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者熊正河, 邢江涛, 钟其顶 申请人:中国食品发酵工业研究院